Теория флуоресценции атомов и ее основные характеристики

Флуоресценция.
Явление флуоресценции
Люминесценция
     Люминесценция – излучение света из любой материи, вызванное переходом электронов из возбужденного состояния на основное. Люминесценция делится на 2 категории: флуоресценция и фосфоресценция в зависимости от уровня возбужденного электрона. На возбужденных синглетных уровнях, электрон на возбужденном уровне парный (противоположный спин) по отношению ко второму электрону на основной орбитали. Следовательно, возвращение электрона на основную орбиталь разрешено по спину и происходит быстрая эмиссия фотона. Излучение флуоресценции, в основном, происходит в течении наносекунд. Из-за малых временных рамок флуоресценции, измерение разрешенного по времени излучения требует сложного оборудования.
	Флуоресценция, обычно, свойственна молекулам, имеющие запах. Некоторые флуоресцентные вещества (флуорофоры) приведены на рисунке 1.

Рис. 1 – Флуоресцентные вещества.
     Один из часто встречающихся флуорофоров - хинин, который присутствует в тонике. Если посмотреть на стакан с тоником под воздействием солнечного света, то можно увидеть голубоватое свечение на поверхности. Это свечение лучше видно, когда стекло находится под прямым углом по направлению солнечного света и его диэлектрическая постоянная уменьшена добавлением полярных растворителей, таких как спирты. Хинин в тонике возбуждается ультрафиолетовым светом от солнца. При возвращении в основное состояние электроны хинина испускают синий свет с длиной волны близкой к 450 нм. Первое наблюдение флуоресценции хинина в солнечном свете наблюдал сэр Джон Фредерик Вильям Гершель в 1845г.
     В жизни встречаются и другие флуорофоры. Зеленое или красно-оранжевое свечение наблюдается в антифризе из-за флуоресцеина или родамина (рисунок 1). Полициклические ароматические углеводороды, например антрацен и перилен, также флуоресцентны и излучение от них используется для мониторинга загрязнения маслами окружающей среды. Некоторые замещенные органические соединения также флуоресцентны. Например, 1,4 бис(5-фенилоксазолил-2)бензола (р-РОРОР) используется в сцинтилляционном расчете и оранжевый акридин часто используется в качестве красителя ДНК. Пиридин и родамин часто используются в лазерах на красителях.
     Спектральные данные флуоресценции, как правило, представлены в виде спектров излучения. Спектр излучения флуоресценции - график зависимости интенсивности флуоресценции от длины волны (нм) или волнового числа (см-1). Два типичных спектра флуоресценции показаны на рисунке 2. Эмиссионные спектры сильно варьируются и зависят от химического состава флуорофора и растворителя в котором он растворен. 
     Важной особенностью флуоресценции - высокая чувствительность обнаружения. Чувствительность флуоресценции была использована в 1877 году, чтобы продемонстрировать, что реки Дунай и Рейн были связаны подземным каналами. Эта связь была продемонстрирована путем размещения флуоресцеина (рис 1) в Дунай. Шестьдесят часов спустя его характерная зеленая флуоресценция была обнаружена в речке, которая вела к Рейну. Сегодня флуоресцеин до сих пор используется в качестве аварийного маркера. 

1.1.2 Диаграмма Яблонского
     Процесс, который происходит между поглощением и испусканием фотона показан на диаграмме Яблонского. Обычно с нее и начинают объяснение поглощения и испускания фотонов. Эта диаграмма используется в разных формах, чтобы проиллюстрировать разнообразные молекулярные процессы, которые могут происходить на возбужденных уровнях. Данная диаграмма названа в честь Александра Яблонского, который считается отцом флуоресцентной спектроскопии за его огромный вклад. 
     Типичная схема Яблонского показана на рисунке 3. Синглет - основной, первый и второй электронные уровни изображены S0, S1, S2 соответственно. На каждом из этих электронных уровней флуорофор может существовать в нескольких колебательных энергетических уровнях, изображенных на 0, 1, 2, и т.д. В этой диаграмме мы исключили ряд взаимодействий, таких как тушение, передача энергии, а также взаимодействие с растворителем. Переходы между состояниями показаны в виде вертикальных линий, чтобы проиллюстрировать мгновенный характер поглощения света. Переходы происходят в течении ?10?^(-15) секунд, временем слишком коротким для значительного смещения ядер. Это принцип Франка-Кондона. 
     Энергетическое расстояние между различными энергиями колебательных уровней показан на примере спектра излучения перилена (рис 2).
     
     Рис. 2 - Спектры поглощения и флуоресценции перилена и хинина.
     
     Отдельные максимумы излучения (и, следовательно, энергетические колебательные уровни) на расстоянии примерно 1500 см-1 друг от друга. При комнатной температуре тепловой энергии недостаточно для существенного заполнения колебательных уровней. Поглощение и излучение происходит, в основном, из молекул с низкой колебательной энергией. Большая разность энергий возбужденных состояний S0 и S1 слишком велика для термо-населения электронами уровня S1. По этой причине мы используем энергию света, а не нагрева, чтобы вызвать флуоресценцию. 
     После поглощения света идут следующие процессы. Флуорофор, обычно, возбуждается до какого-то более высокого колебательного уровня S1 или S2. За редкими исключениями, молекулы в конденсированных фазах быстро расслабляются до самого низкого колебательного уровня S1. Этот процесс называется внутренней конверсией и обычно происходит в течение ?10?^(-12)сек или меньше. Флуоресцентное излучение - результат теплового равновесия в возбужденном состоянии, то есть, электроны занимают самый низкий энергетический колебательный уровень S1. 
     Возвращение электрона в основное состояние, как правило, происходит с более высокого колебательного уровня основного состояния, который быстро (?10?^(-12) с) достигает теплового равновесия (Рисунок 3)
     
     Рис. 3 - Диаграмма Яблонского. 
     
Характеристика флуоресцентного излучения.


Стоксовский сдвиг
     Исследование схемы Яблонского (рисунок 3) показывает, что энергия излучения, как правило, меньше, чем у поглощения. Флуоресценция, как правило, происходит при более низких энергиях или высоких длинах волн по отношению к поглощенной энергии. Это явление впервые было обнаружено сэр. Г. Стоксом в 1852 году в Университете Cambridge. Эти эксперименты были проведены на относительно простых приборах (Рисунок 4).
     
     Рис 4 - Эксперимент Стокса.
     Источник ультрафиолетового возбуждения был представлен солнечными лучами и синим стеклянным фильтром, который был частью витража. Этот фильтр избирательно пропускает свет ниже 400 нм, который был поглощен хинином (рис 4). Попадание получившегося света на детектор (глаз) было устранено желтым бокалом (с вином). Флуоресценция Хинина происходит вблизи 450 нм и, следовательно, видна невооруженным глазом. 
     Раствор хинина бесцветный, потому что он поглощает ультрафиолет, который мы не можем увидеть. Синий цвет идет только из области вблизи поверхности. Это происходит потому, раствор хинина относительно концентрирован и поглощает весь УФ в первых нескольких миллиметрах. Следовательно, Стокс наблюдал внутренний эффект фильтра. После прохождения через раствор свет был "ослаблен" и больше не был способен вызвать голубое свечение. Это произошло потому что УФ поглотился и "ослабленный" свет больше не мог возбудить хинин. 
     Потери энергии между возбуждением и излучением наблюдаются повсеместно для флуоресцентных молекул в растворе. Одной из распространенных причин сдвига Стокса - быстрое падение до более низкого колебательного уровня на уровне S1. Кроме того, Флуорофоры, в целом, переходят на более высокие колебательные уровни S0 (рисунок 3), в результате - дальнейшей потери энергии на нагрев. В дополнение к этим эффектам, флуорофоры могут иметь дополнительное Стоксовское смещение из-за растворителя.
     
Независимость спектра от возбуждающей длины волны.
     Еще одно свойство флуоресценции - спектр флуоресценции, как правило, не зависит от длины волны возбуждения. Это правило Каша, хотя Вавилов сообщал в 1926 году, что квантовые выходы, как правило, зависят от возбуждающей длины волны. При возбуждении до более высоких электронных и колебательных уровней, избыточная энергия быстро рассеивается, оставляя флуорофор в нижнем колебательном уровне S1. Это расслабление происходит в ?10?^(-12)сек, и, вероятно, является результатом сильного перекрытия между многочисленными уровнями с почти одинаковой энергией. Из-за быстрой релаксации, спектры излучения, обычно, не зависят от длины волны возбуждения. Исключения существуют, например, флуорофоры, которые существуют в двух состояниях ионизации, каждый из которых отображает четкие спектры поглощения и излучения. Кроме того, некоторые молекулы, как известно, излучают от уровня S2, но такая эмиссия редка и обычно не наблюдается в биологических молекулах. 
     Интересно узнать, почему перилен следует правилу зеркальности, а излучению хинина не хватает двух пиков, наблюдаемых в его спектре возбуждения при 315 и 340 нм (рис 2). В случае хинина, поглощение пика более короткой длины волны обусловлено ??возбуждением на второе возбужденное состояние S2, которое быстро релаксирует к S1. Излучение происходит преимущественно от низкого синглетного (S1), так что излучение S2 не наблюдается. Спектр излучения хинина - зеркальное отражение S0 - S1 поглощения хинина, а не общего спектра поглощения. Это верно для большинства флуорофоров: излучение зеркально S0 - S1 поглощению, а не общему спектру поглощения. 
     Как правило, симметричная природа этих спектров - результат такого же перехода, который участвует в поглощении и излучении, и подобных колебательных энергетических уровнях S0 и S1. В большинстве флуорофорах распределение энергетических уровней S0 и S1 не особо отличаются. Предположим, спектр поглощения флуорофора показывает различные пики колебательных энергетических уровней. Такие пики наблюдаются для антрацена на рисунке 5. 
     
     
     Рис. 5 – Правило зеркальности и факторы Франка-Кондона.
     
     Эти пики обусловлены переходами из нижнего колебательного уровня S0 в более высокие колебательные уровни состояния S1. По возвращении в состояние S0 флюорофор может вернуться к любому из основного состояния колебательных уровней. Эти колебательные уровни энергии имеют аналогичные расстояния в состоянии S1. Спектр излучения имеет те же колебательные энергии, что и в спектре поглощения. В соответствии с принципом Франка-Кондона, все электронные переходы являются вертикальными, то есть, они происходят без изменения в положении ядер. В результате, если вероятность перехода (Франк-Кондона) между 0-и 1-го колебательных уровней является самым вероятным в поглощении, обратный переход также наиболее вероятен (рис 5).
     
     
Время затухания и квантовые выходы флуоресценции.
     Часто измеряется время затухания и квантовые выходысоединений, обладающих флуоресценцией. Физический смысл этих параметров хорошо виден из улучшенной диаграммы Яблонского (рис. 5). На этой диаграмме не указываются отдельные процессы релаксации, приводящие к релаксированному состоянию S1, а больше внимания отводится на переходы в основное состояние. Нас интересует константа скоростиизлучательнойрелаксациифлуорофора (Г) и константа скорости безызлучательнойрелаксации в состояние S0(k).
     Квантовый выходфлуоресценции — это отношение числа испущенных фотонов к числу поглощенных. Константы скорости Г и kсоответствуют процессам релаксации с возбужденного состояния. Количество молекул флуорофора, которые релаксируют с испусканием, определяются выражением:
     Q=Г/(Г+k)(1)
     Квантовый выход стремится к единице тогда, когда константа скорости безызлучательной дезактивации гораздо меньше константы скорости испускания, т. е. k« Г.Следует заметить, что энергетический выход излучения флуоресценции всегда меньше единицы вследствие потерьстокса. Для удобства все процессы безызлучательной дезактивации объединены в одну константу скорости k.
     Время жизни возбужденного состояния определяется как среднее время, в течение которого молекула находилась в возбужденном состоянии до того, как вернуться в основное состояние[1]. Обычно время затухания флуоресценции 10 нс, Дляфлуорофора, описываемого диаграммой Яблонского (рис. 5), время затухания равно:
     ?=1/(Г+k)	(2)
Важно помнить, что излучение флуоресценции является случайным процессом и не все молекулы (или атомы) испускают фотоны при t = ?. В примере для одноэкспоненциального затухания, 63% молекул релаксируют за время t = ?, а 37 % - за время t>?. Время жизни флуорофорав момент, когда не происходит излучательных процессов, называемым собственным временем жизни ,? 0, равно
     ?_0=1/Г                                                             (3)
Отсюдаможно вывести соотношение между квантовым выходом и временем жизни:
        Q=?/?_0 	(4)
     Время жизни и квантовый выход могут меняться под действием различных факторов, воздействующих на константы скорости. Допустим, молекула может оказаться неспособной испускать флуоресцентное излучение из-за большой скорости внутренней конверсии или малой скорости испускания. Сцинтилляторы как правило выбирают за их высокие квантовые выходы, которые являются результатом больших значений Г. Им соответствуют короткое время жизни, около 1 нс. Флуоресцентное излучение ароматических соединений, содержащих группы NO2, обычно имеет слабую интенсивность, в первую очередь из-за большой величины k. 
     

Анизотропия флуоресценции.
     Флуорофоры поглощают преимущественно те фотоны, электрические векторы которых направлены параллельно моменту перехода флуорофора. Момент перехода имеет строго определенную ориентацию в молекуле флуорофора. В изотропных растворах молекулы флуорофоров не имеют упорядоченной ориентации. Во время возбуждения поляризованным светом возбуждаются только те молекулы флуорофора, для которых дипольный момент перехода параллелен электрическому вектору возбуждающего излучения. Такое выборочное возбуждение частично ориентированного набора флуорофоров приводит к частично поляризованному излучению флуоресценции. Для каждого флуорофора моменты перехода имеют строго фиксированную ориентацию. Угол между ними дает максимальную измеряемую анизотропию r0[1]. Анизотропия (r) и поляризация (Р) флуоресценции выражаются уравнениями
r=(I_(||)-I_?)/(I_(||)+2I_? )                                                              (5), 
P=(I_(||)-I_?)/(I_(||)+I_? )                                                                 (6),
     где I||  иI?  интенсивности флуоресценции вертикально (II) и горизонтально (?) поляризованного излучения в случае возбуждения флуорофора вертикально поляризованным излучением. Анизотропия и поляризация - это одно и того же явление, поэтому они взаимозаменяемы. Некоторые факторы могут уменьшать анизотропию до значений ниже максимального. Самый частый из них — вращательная диффузия, которая происходит за время жизни возбужденного состояния и изменяет положение испускающего диполяфлуорофора. Измерение этого параметра предоставляет информацию об относительном угловом смещении флуорофора между поглощением и испусканием. Перенос энергии возбуждения между флуорофорамитоже приводит к уменьшению анизотропии.
     Допустим, что единственный существенный процесс, приводящий к уменьшению анизотропии, является вращательная диффузия. Тогда анизотропия определится выражением:
     , (7)
     где r0 - анизотропия, которая должна измеряться в отсутствие вращательной диффузии, а ? - время корреляции для процесса диффузии, определяемое как
     ? =?V/kТ	(8)
     где ? - вязкость раствора; k - константа Больцмана; Т - абсолютная температура; V-объем вращающегося фрагмента. 
     
Шкала времени молекулярных процессов в растворе.
       Флуоресцентная спектроскопия - крайне эффективный метод исследования процессов в растворах в динамике, представляющих огромный интерес для биологов. Существует такая возможность в первую очередь благодаря времени жизни возбужденных состояний. Из-за принципа Франка - Кондона абсорбционная спектроскопия дает информацию только среднестатистические характеристиках основного состояния молекул, которые поглотили свет. Только соседствующие с поглощающими частицами молекулы растворителя влияют на спектр поглощения, в связи с этим, абсорбционная спектроскопия дает информацию лишь о средней сольватной оболочке растворителя, которая соседствует с хромофором, и не показывает молекулярную динамику. 
     Параметры флуоресцентной спектроскопии являются чувствительными ко всем процессам, протекающих за время жизни возбужденноймолекулы. В этих процессах участвуют возбужденные молекулы, находящиеся на расстояниях до 100 Ангстрем от флуорофора. Может показаться, что 10  нс - слишком малое значение времени. Фактически это большой промежуток времениеслисравненивать с временем движения молекул в жидкости. Вращательная диффузия флуорофоров,связанных с белками и мембранами, также находится внутриэтого временного диапазона.
     Тушение флуоресценции при помощи молекулярного кислорода по механизму столкновений является очень показательным примером для показа размеров пространственного и временного диапазонов, представляемых временем затухания флуоресценции. Если флуорофор, который находится в возбужденном состоянии, сталкивается с молекулой кислорода, то он возвращается в основное состояние без излучения фотона. Коэффициент диффузии кислорода в воде при 25°С   равен 2,5*10-3 см2/с. Среднее расстояние [(?х2)1/2], на которое может диффундировать молекула кислорода за 10-3 с, определяется уравнением Эйнштейна:
      ? x2 = 2D?	(9)
     Расстояние [ ( ?х2)1/2] составляет ~ 70 ?, что близкок толщине биологической мембраны или диаметру белка. Для некоторых флуорофоров время жизни возбужденного состояния достигает 400 нc.Благодаря этому можно наблюдать диффузию молекул кислорода на расстояния более 450 А. Измерения поглощения дают информацию о окружении флуорофора и о мгновенном усредненном окружении.
     Диапазон времени между поглощением света и его последующим излучением достаточен для протекания нескольких процессов, каждый из которых ослабляет наблюдаемые спектральные характеристики флуоресценции. Такими процессами являются столкновения с тушителями, поступательная и вращательная диффузия, образование комплексов с растворителями или с растворенными. Данные динамические процессы влияют на анизотропию флуоресценции, квантовые выходы, спектры испускания ивремена жизни. Как результат спектральные характеристики флуорофоров дают большую информацию о динамических процессах.

Резонансный перенос энергии.
     Еще один важный процесс, происходящий в возбужденном состоянии - резонансный перенос энергии (РПЭ). Этот процесс происходит всякий раз, когда спектр излучения от флуорофора, называемый донором, пересекается со спектром поглощения другой молекулы, называемый акцептором. Такие пересечения показаны на рисунке 6. 

Рис. 6 - Спектральное перекрытие флуоресцентного резонансного переноса энергии.

     Акцептор может не быть флуорофором. Важно понимать, что РПЭ не предполагает излучение света донором. РПЭ не является следствием выбросов от донора будучи поглощенным акцептором. Такие процессы реабсорбции зависят от общей концентрации акцептора, и для молекулярных факторов, таких как размер выборки, и, таким образом, представляют меньший интерес. Нет никакого промежуточного фотона в РПЭ. Донор и акцептор соединены посредством диполь – дипольного взаимодействия. По этим причинам термин в РПЭ является более предпочтительным, нежели термин флуоресцентного резонансного переноса энергии (ФПРЭ), который также находится в общем пользовании.

     Степень передачи энергии определяется расстоянием между донором и акцептором, и степенью спектрального перекрытия. Для удобства спектрального перекрытия (Рис. 6) описывается термином Ферстерово расстояние (R0). Скорость перекачки энергии k_r (r) определяется по формуле
     
k_T (r)=1/?_D (?R_0/r)?^6,                                                                                             (10)

     где R-расстояние между донором (D) и акцептором (А) и ?_D время жизни донора в отсутствие переноса энергии. Эффективность переноса энергии для одиночной донор–акцепторной пары на фиксированном расстоянии находится:
     
E=(R_0^6)/(R_0^6+r^6 ),                                                                                                   (11)

     Отсюда степень передачи зависит от расстояния (R). К счастью, Ферстерово расстояние сопоставимо с размерами биологических макромолекул: от 30 до 60 ангстрем. По этой причине перенос энергии был использован в качестве "спектроскопической линейки" для измерения расстояния между объектами в белках. Значение R0 для передачи энергии не следует путать с фундаментальной анизотропией (r0). Область в РПЭ-остается большой и сложной. Теория отличается для доноров и акцепторов, которые ковалентно связаны, свободны в растворе или содержится в ограниченной геометрии мембраны или ДНК. Кроме того, в зависимости от времени жизни доноров, диффузия может увеличить степень передачи энергии сверх той, что предсказано формуле 11.


Установившаяся и разрешенная по времени флуоресценция
     Флуоресцентные измерения можно разделить на два типа: установившиеся и разрешённые по времени. Измерения установившегося состояния, является наиболее распространенным типом, которые выполняются при постоянной освещенности. Образец освещается непрерывным лучом света и регистрируется интенсивность или спектр излучения (Рис. 7).


Рис. 7 - Сравнение установившейся и разрешенной по времени флуоресцентной спектроскопии.
     Из-за наносекундного промежутка времени флуоресценции, большинство измерений – стационарные измерения. Когда образец подвергается воздействию света, устойчивое состояние достигается практически сразу. Второй тип измерений – разрешенные по времени, который используются для измерения интенсивности распадов или анизотропии распадов. Для этих измерений образец подвергается воздействию импульса света, где длительность импульса обычно короче, чем время затухания образца (Рис. 7). Эта интенсивность распада записывается с высокой скоростью обнаружения, что позволяет системе оценить интенсивность или анизотропию по НС сроки. Важно понимать взаимосвязь между стационарными и кинетическими измерениями. А устойчивое состояние наблюдения — это просто средняя величина временного разрешения явлений над интенсивностью разложения образца. Например, рассмотрим флуорофор, который отображает одно время затухания (?) и ЕДИНИЧНОЕ время вращательной корреляции (?). Интенсивность и анизотропия распадов приведена на: 
I(t)=I_0 e^(-t/?) ,                                                                                          (12)

r(t)=r_0 e^(-t/?),                                                                                         (13)

где I0 и r0 интенсивность и анизотропия при t = 0, непосредственно после импульса и возбуждения, соответственно.
Уравнения 12 и 13 могут использоваться для иллюстрации того, как время затухания определяет, что можно наблюдать с помощью флуоресценции. Установившаяся анизотропия (r) определяется по формуле средний r(t), взятых по I(t):

r=(?_0^??r(t)I(t)dt)/(?_0^??I(t)dt),   (14)
В этом уравнении знаменатель нормализует анизотропию чтобы не зависело от общей интенсивности. В числителе анизотропия, в любое время т, способствует установившейся анизотропии в зависимости от интенсивности в момент времени t.
Подстановка уравнения 12 и 13 в 14 дает уравнение Перрена.
     Возможно простой пример - как установившаяся интенсивность (МКС) связана с периодом распада. Установившаяся интенсивность:

I_SS=?_0^???I_0 e^(-t/?) dt=? I_0 ?,   (15)
значение  I_0 можно рассматривать как параметр, который зависит от концентрации флуорофора и ряд инструментальных показателей. Следовательно, в молекулярных терминах, установившихся интенсивность пропорциональна продолжительности жизни. 

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИНФОРМАЦИЯ ОТ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ

Спектры излучения и Стоксовский сдвиг
     Самым важным аспектом является возникновение флуоресценции на длинах волн больших, чем те, на которых происходит поглощение. Это Стоксов сдвигов, который является наиболее важным дляполярных флуорофоров в полярных растворителях, обусловленный взаимодействиями между флуорофором и его ближайшим окружением. Индол группа триптофановых остатков в белках является одним из таких растворителей-чувствительным флуорофором, и эмиссионные спектры индола может выявить расположение триптофановых остатков в белках. Излучение от облученной поверхности осадка будет происходить при больших длинах волн, чем от остатков триптофана в белке. Это явление было показано в верхней части Рис. 8, который показывает сдвиг в спектре остатков триптофана при разворачивании белка и последующем облучение остатков триптофана в водной фазе.


Рис. 8 – Спектр поглощения и излучения в биомолекулах. 

     Ценным свойством многих флуорофоров является их чувствительность к окружающей среде. Эмиссионные спектры и интенсивности примесных зондов часто используются для определения местоположения зонда на макромолекуле. Например, одним из широко используемых зондов для таких исследований является6-(п-толуидин)нафталин-2-сульфонат (ТНС), который имеет полезное свойство - быть очень слабым люминесцентом в воде (Рис. 9). 


Рис. 9 - Спектры излучения ТНС в воде, связанный с апомиоглобином, и связанный м липидными везикулами.

Зеленое излучение ТНС в отсутствие белка едва виден на фотографии. Слабая флуоресценция в воде и сильная флуоресценция, будучи привязанной к биомолекуле это свойство, которым обладают и другие широко используемые зонды, в том числе многе ДНК красители. Белок апомиоглобин содержит гидрофобный карман, который связывает гемгруппу. Этот карман может также связывать другие неполярные молекулы. При добавлении апомиоглобин к раствору ТНС, существует значительное увеличение интенсивности флуоресценции, а также сдвиг спектра излучения в сторону коротких волн. Это увеличение в ТНС флуоресценции отражает неполярный характер гем-связывающий участок апомиоглобин. ТНС также связывается с мембранами (Рис. 9). Эмиссионного спектра ТНС связанного с моделью оболочек димиристоилфосфатидилхолина (ДМФХ) несколько слабее и при больших длинах волнпо сравнению с апомиоглобин. Это указывает на то, что ТНС связка на поверхности мембраны является более полярной. Из спектра излучения представляется, что ТНС соединяется с полярной головной группой мембран, а не в неполярной ацильной боковой цепи. Следовательно, эмиссионные спектры флуорофора, чувствительного к растворителям дает информацию о расположении соединения на макромолекуле.

Тушение флуоресценции
     Различные малые молекулы или ионы могут действовать в качестве гасителей флуоресценции, то есть, они уменьшают интенсивность излучения. Эти вещества включают йодид (I–), кислорода, и акриламида. Это свойство флуорофоров для таких гасителей может быть использовано для определения местоположения зондов на макромолекуле, или пористость белков и мембран для гасителей. Этаконцепция иллюстрируется на рис. 10, которая показывает интенсивность излучения протеин - или мембраносвязанногофлуорофора в присутствии водорастворимого йодистого гасителя, I–. 


Рис. 10 - Доступность флуорофоров для гасителя.

Как показано на правой стороне рисунка, интенсивность свечения триптофана на поверхности белка (W2), или на поверхности клеточной мембраны (Р2, справа), будет уменьшаться в присутствии водорастворимых гасителей. Интенсивность остатков триптофана (W1) или зонда в мембране (P1) будет менее подвержена влиянию растворенного йодида (слева). Константа гашения K йодида Штерн-Волмер в уравнении:
F_0/F=1+KQ=1+k_q ?_0 Q,                                                (11)
 будет больше для незащищенных флуорофоров, чем для затушенных флуорофоров. Как вариант, можно добавить жирорастворимые гасители, такие как бромированные жирные кислоты, чтобы изучить структуру ацильной боковой цепи мембраны, путем измерения от степени гашения липидо-растворимый гашения.

     
     

Поляризация флуоресценции или Анизотропия
     Флуорофоры поглощают свет в определенном направлении по отношению к молекулярным осям. Например, DPH поглощает только поляризованный вдоль его длинной оси свет (Рис. 10). Ось, в которой вращается флуорофор в возбужденном состоянии определяет его поляризацию или анизотропию. Явление поляризации флуоресценции может быть использовано для измерения видимого объема (или молекулярного веса) белков. Это измерение возможно потому, что большие белки вращаться медленнее. Следовательно, если белок связывается с другим белком, вращательная скорость уменьшается, а анизотропия возрастает (Рис. 11).


Рис 11 - Влияние ассоциации белка и микровязкости мембран на анизотропию флуоресценции.

Вращательную скорость молекулы часто описывают её временем вращательной корреляции ?, которая связана:

?=?V/RT (12)
где ?-это вязкость, V представляет собой молекулярный объем, R-газовая постоянная температура в К. Предположим, что белка помечен DNS-Cl (Рис. 11). Если белок связывается с другим белком, объем увеличивается, что влияет на время вращательной корреляции. Это приводит к увеличению анизотропии, из-за отношения между установившейся анизотропией R и временем вращательной корреляции ?. 
     Измерения поляризации флуоресценции, также используются для определения вязкости бокового связанной области (центр) мембран. Такие измерения микровязкости, как правило, выполняются с использованием гидрофобного зонда как и DPH (Рис. 11), который размещается в мембране. Вязкость мембран, как известно, уменьшаться в присутствии ненасыщенных жирных кислот. Следовательно, увеличение количества ненасыщенных жирных кислот приведет к снижению анизотропии. Видимая микровязкость мембраны определяется путем сравнения поляризации зонда измеряется в мембране со значением, наблюдаемым в растворах известной вязкости. 
     Измерения анизотропии широко используются в биохимии, и даже используются для клинико-иммунологических исследований. Одна из причин такого использования является легкость, с которой эти абсолютные величины могут быть измерены и сравнены между лабораториями.

     
     
Резонансный ПереносЭнергии
     Резонансный перенос энергии (РПЭ), иногда называемый флуоресцентным резонансным переносом энергии (ФРПЭ), обеспечивает возможность измерения расстояний между объектами на макромолекулах. Ферстерово расстояния, как правило, лежит в диапазоне от 15 до 60 ангстрем, что сопоставимо с диаметром многих белков и толщине мембраны. Согласно уравнению 11, расстояние между донором и акцептором может быть рассчитано по эффективности передачи.


      РПЭ для измерения ассоциации белка и расстояния показан на рис. 12. Для двух мономеров, которые ассоциируют и образуют димер. Допустим, один мономер содержит остаток триптофана, а другой данзильную группу. Ферстерово расстояние определяется спектральным перекрытием трп донора эмиссии с данзильнымl поглощением акцептора. После объединения будет происходить РПЭ, который уменьшает интенсивность излучения донора (Рис. 12).

Рис 12 – Передача энергии между донором и акцептором.
     Степень гашения донора может быть использована для расчета донора-акцепторного расстояние в димере. Важно также заметить, что РПЭ предоставляет метод для измерения ассоциации протеина, потому что оно возникает всякий раз, когда донор и акцептор находятся в пределах Ферстерого расстояния.





НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ФЛУОРЕСЦИИРОВАНИЯ


Многофотонное Возбуждение

     За последние несколько лет технический прогресс предоставил новые возможности использования флуоресценции. Эти технологии были быстро приняты и стали доминирующими методами. Одной из таких технологий является двух фотонное или мульти фотонное возбуждение и многофотонная микроскопия. Флуоресценция обычно возбуждается при поглощении одного фотона с длиной волны в полосе поглощения флуорофора. Импульсные лазеры с фемтосекундной импульсной шириной могут возбудить флуорофор путем двухфотонного поглощения. Такие лазеры стали просты в использовании и доступны с микроскопами. Если интенсивность лазера высока, флуорофором может одновременно поглотиться два длинноволновых фотона до первого синглетного состояния (Рис. 13).


Рис. 13 – Схема Яблонского для двухфотонного возбуждения. На фото видно локализованное возбуждение в фокусной точке лазерного луча.
Этот процесс сильно зависит от интенсивности света и встречается только в фокусной точке луча лазера. Это можно увидеть на фото, где эмиссия происходит только из одной точки внутри образца. Флуорофор за пределами фокального объема не возбуждаются. 
     Локализованные возбуждения из двух-фотонного возбуждения нашли широкое применение в люминесцентной микроскопии. Многофотонные возбуждения позволяют визуализировать только из фокальной плоскости микроскопа. Это является преимуществом, поскольку флуоресценция искажается от флуоресценции выше и ниже фокальной плоскости. Рис. 14 показан пример чрезвычайно резких изображений, получаемых с помощью многофотонного возбуждения. 


Рис. 14 – Изображение флуоресценции RBL-3H3 клетки подкрашенной DAPI(синий), Patman(зеленый) и тетраметилродамин(красный).


Клетки были помечены с тремя зондами: для ДНК красителем dapi, patman для мембран, и tetramethylrhodamine для митохондрий. Была использована возбуждающая длина волны 780 нм. Эта длина волны не поглощается флуорофором с одно-поглощающим фотоном, но 780 нм поглощается всеми флуорофорами путем многофотонного процесса. Изображения остры, потому что нет фазы флуоресценции, которая уменьшает контраст в цветной конфокальной флуоресцентной микроскопии. Такие образы в настоящее время получены во многих лабораториях.

Флуоресцентная Корреляционная Спектроскопия

     Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (ФКС), быстро стала широко используемым инструментом для исследования широкого спектра реакций ассоциации. ФКС основана на временных колебаниях, происходящих в малом наблюдаемом объеме. Фемтолитровые объемы могут быть получены с помощью локализации многофотонного возбуждения или с помощью конфокальной оптики (Рис. 15, сверху). 


Рис. 15 – ФКС.
     Всплески фотонов рассматриваются как единичная флуорофорная диффузия из лазерного луча. Метод является высокочувствительным, поскольку лишь несколько флуорофоров наблюдаются в одно время. На самом деле, ФКС не может быть выполнена, если раствор слишком концентрированный и есть много флуорофоров в наблюдаемом объеме. Меньше количество флуорофоров в итоге приводят к большим колебаниям, и большее количество флуорофоров приводит к меньшим колебаниям и усредняет сигнал. ФКС осуществляется путем наблюдения интенсивности колебаний с течением времени (Рис. 15, средняя часть). Частота колебаний зависит от скорости диффузии флуорофора. Интенсивность увеличивается и снижается быстрее, еслидиффузия флуорофоров происходит быстрее. Если диффузия флуорофоров происходит медленнее они остаются в наблюдаемом объеме в .......................