Разработка методики пробоподготовки микроорганизмов для проведения исследований методом атомно-силовой микроскопии

Министерство образования и науки Российской Федерации

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ
ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ
«ОРЕНБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»


Химико-биологический факультет

Кафедра биохимии и микробиологии










ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА


Направление подготовки 06.03.01 Биология


Разработка методики пробоподготовки микроорганизмов для проведения исследований методом атомно-силовой микроскопии

ОГУ 06.03.01.3318.015 ОО


                                       Руководитель работы
                                       канд. биол. наук, доцент
                                       _____________ О.К.Давыдова
                                       

                                       Исполнитель
                                       Студент группы 14Био(ба) Мб
                                       _____________ В.А.Бритвин 


                                       


Оренбург 2018

                                                                                                                               Утверждаю:
      заведующий кафедрой БХМБ
      _____________Е.С. Барышева
      « 17 »        апреля         2018 г.
      
      
ЗАДАНИЕ

на выполнение выпускной квалификационной работы

студенту                                     Бритвину Владиславу Алексеевичу                                         _

по направлению подготовки                                06.04.01 Биология                               _

1 Тема ВКР: Разработка методики пробоподготовки микроорганизмов для проведения исследований методом атомно-силовой микроскопии


2 Срок сдачи студентом ВКР «25 »      июня       2018 г.

3 Цель и задачи ВКР: цель работы: экспериментальное создание методики пробоподготовки микроорганизмов для проведения исследований методом атомно-силовой микроскопии (АСМ). Задачи: 1)Изучение влияния условий пробоподготовки: типа питательной среды, времени культивирования, количество проведенных отмывок, оборотов, а также времени центрифугирования на качество изображений, получаемых с помощью атомно-силового микроскопа; 2) проведение морфологической оценки бактериальных клеток с помощью атомно-силовой микроскопии.  

4 Исходные данные к ВКР: литературные данные о методах микроскопии в микробиологических исследованиях.

5 Перечень вопросов, подлежащих разработке: 1) оценка возможностей атомно-силовой микроскопии в микробиологии; 2) определение морфологических параметров бактериальных клеток методом атомно-силовой микроскопии.



Дата выдачи и получения задания 

Руководитель ВКР                     « 17 »         апреля           2018 г._________      О.К. Давыдова


Студент                                       « 17 »         апреля           2018 г. ________       В.А. Бритвин
Аннотация
     
     
     Выпускная квалификационная работа посвящена вопросам исследования микробиологических объектов с нанометровым разрешением методом  атомно-силовой микроскопии, позволяющего получить принципиально новую информацию о состоянии микрообъектов, недоступную с использованием существующих методов визуализации.
     На основе анализа литературных данных поэтапно описываются возможности и достижения атомно-силовой микроскопии.
     Особое место в работе уделено собственным результатам исследования:
      - влияние различных условий пробоподготовки: типа питательной среды, времени культивирования, количество проведенных отмывок, оборотов, а также времени центрифугирования на качество изображений, получаемых с помощью атомно-силового микроскопа;
     - морфологические характеристики бактериальных клеток, оцененные с помощью атомно-силовой микроскопии.
     Структура работы соответствует логике научного исследования и состоит из введения, трех глав, заключения и списка использованных источников.
     Результаты исследования имеют большое практическое значение и могут использоваться в разработке методов пробоподготовки на тестовые Работа содержит 49 страниц текста, 27 рисунков,4 таблицы. При написании использовано 52 научных источника. 
     
     
     
     
     
     
     
     
     
     
     
     
     
     
     
     
     
     
    Аnnotation
    
    
    
     Graduation qualification work is devoted to the investigation of microbiological objects with nanometer resolution using atomic force microscopy, which allows obtaining fundamentally new information about the state of microobjects that is inaccessible with the use of existing imaging methods.
     Based on the analysis of literature data, the results of the study are described step by step:
      - the influence of different nutrient media and the time of cultivation on the morphological characteristics of bacterial cells;
      - number of spent cleaning, number of revolutions and time of centrifugation
     A special place in the work is devoted to the study of quantitative morphological parameters of bacterial cells.
     The structure of the work corresponds to the logic of scientific research and consists of an introduction, three chapters, conclusion and a list of sources used.
     The results of the study are of great practical importance and can be used in the development of methods for sample preparation for test. The work contains 49 pages of text, 27 figures, 4 tables. At the writing 52 scientific sources were used.
Содержание

Введение..............................................................................................................
6

1
Использование атомно-силовой микроскопии (АСМ) в микробиологических исследованиях…………………………………….
8

1.1 Развитие методов микроскопии в микробиологии 
8

1.2 Возможности АСМ в исследовании бактериальных клеток и поверхностных структур ……………………………………………...........
18

2
Материалы и методы......................................................................................
21

2.1 Объекты исследования.............................................................................
21

2.1.1 Bacillus subtilis IP 5832…………………………………………..........
21

2.1.2 Escherichia coli K12 TG-1……………………………………………..
22

2.1.3 Bifidobacterum longum ………………………………………………………
23

2.1.4 Lactobacillus acidophilus…………………………………………………….
24

2.2 Сканирующий АСМ.................................................................................
25

2.2.1 Устройство АСМ………………………………………………………
25

2.2.2 Пробоподготовка для АСМ…………………………………………...
28

2.3 Питательные среды……………………………………………………
28
3
 Результаты  исследования ...................................................................…….
29

3.1 Подбор условий культивирования для микроорганизмов …………..
29

3.1.1 Исследование  микроорганизмов, выращенных на твердой питательной среде…………………………………………………………..
29

3.1.2 Исследование микроорганизмов, выращенных на жидкой питательной среде…………………………………………………………..
31

3.2 Подбор условий пробоподготовки образцов………………………….
33

3.2.1 Варьирование количества циклов и длительности центрифугирования ………………………………………………………...
33

3.3 Результаты сканирования различных микроорганизмов ……………
34

3.3.1 АСМ грамположительных микроорганизмов ……………………...
35

3.3.2 АСМ грамотрицательных микроорганизмов……………………….
38

3.4 Морфометрические измерения………………………………………...
38
Заключение..........................................................................................................
44
Список использованных источников...............................................................
45








                                                Введение

     Методы микроскопии сыграли ведущую роль в возникновении и развитии микробиологии. Именно открытие оптического микроскопа  позволило впервые обнаружить и получить изображения отдельных клеток. В силу относительной простоты приготовления исследуемых объектов, а также возможности изучения биологических образцов в близких к природным условиях, оптическая микроскопия получила чрезвычайно широкое распространение и по-прежнему входит в «обойму» рутинных микробиологических методов. В то же время детальное строение микроорганизмов, называемое «ультраструктурой» удалось изучить и описать лишь с появлением электронной микроскопии (40-е года XX века). Однако, электронная микроскопия, до настоящего времени являющаяся одним из основных методов изучения структуры микрообъектов, имеет ряд недостатков, главные из которых – сложность приготовления препаратов и необходимость проведения исследований в вакуумной среде. 
Изобретение атомно–силового микроскопа Г. Биннигом, К. Квейтом и Ч. Гербером в 1986 году открыло перед учеными новые возможности. С появлением АСМ было успешно преодолено ограничение, существовавшее для туннельного микроскопа — возможность визуализировать только проводящие объекты.
     Возникшая в 1981 году новая область микроскопии – сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ) потенциально является способной совместить в себе основные достоинства упомянутых методов. Демонстрируя нанометровое разрешение и способность работы в воздушной и жидкой средах в сочетании с предельно простой процедурой подготовки образцов, СЗМ в одном из своих вариантов – атомно-силовой микроскопии, стала одним из востребованных в биологии современным методом визуализации. На начальном этапе становления атомно-силового микроскопа (АСМ) в качестве микробиологического инструмента, практически все публикации посвящались  описанию возможности визуализации биообразцов с высоким разрешением и сравнению полученных данных с раннее известными результатами, установленными с помощью других методов визуализации. В этот период были получены изображения широкого диапазона всевозможных клеточных и молекулярных структур – от биопленок до единичных молекул ДНК и белков.
     На следующем этапе развития, внимание исследователей было обращено  к более интересным возможностям АСМ, выгодно отличающими его от всех известных методов визуализации.  Так, перспективными являются исследования с помощью АСМ, в которых зонд микроскопа используется как наноманипулятор, позволяющий оперировать отдельными молекулами. На данной основе разработаны АСМ-методики, позволяющие изучать силу молекулярных взаимодействий (гидрофобных и электростатических), а также картировать физико-химические и иные свойства поверхности. 
     Атомно-силовая микроскопия получает все большее применение при разработке принципиально новых подходов иммунодиагностики. Так известен способ применения метода атомно-силовой микроскопии для диагностики вирусных инфекций, основанный на специфическом прикреплении вирусных частиц к модифицированной антителами подложке. 
     Другим перспективным направлением являются исследования, в которых зонд микроскопа используется не только как инструмент визуализации, но и как наноманипулятор, позволяющий оперировать отдельными молекулами. На данной основе разработан метод функционализации зонда атомно-силового микроскопа специфическими белками (молекулами антител), проведение на данной основе реакции «антиген–антитело» в жидкостной ячейке, что на основе измерения сил взаимодействия между лигандами и рецепторами (определение кривых «отвода-подвода») позволяет распознавать отдельные молекулы или клетки. Имеющиеся ограничения для данного варианта атомно-силовой микроскопии определяются необходимостью проведения сканирования в жидкостной ячейке, что усложняет процесс пробоподготовки и сканирования и часто приводит к появлению артефактов на полученных изображениях. 
     В то же время перечисленные возможности, несмотря на уникальность получаемой с их помощью информации, при проведении микробиологических исследований используются все еще незначительно по причине имеющихся методологических и практических ограничений. Так, например, существует недостаток  методик АСМ-исследований применительно к микробиологическим объектам. Кроме того, упомянутые выше АСМ-методики связаны с необходимостью проведения сканирования в жидкостной ячейке, что усложняет процесс пробоподготовки и сканирования и часто приводит к появлению артефактов на полученных изображениях. 
     Таким образом, открытым остается вопрос исследования микробиологических объектов с нанометровым разрешением методом  атомно-силовой микроскопии, лишенного описанных выше недостатков и позволяющего получить принципиально новую информацию о состоянии микрообъектов, недоступную с использованием существующих методов визуализации.
     В этой связи основным содержанием дипломной работы явилась разработка методик пробоподготовки различных бактериальных клеток для исследования методом АСМ
     
     
     
     
     
     
     
    1  Использование атомно-силовой микроскопии в микробиологический исследованиях
       
     1.1 Развитие методов микроскопии в микробиологии 
     
     
     Размеры всех объектов, являющихся предметом изучения микробиологии, лежат далеко за пределами разрешающей способности человеческого глаза. Морфология микроорганизма (форма, размеры, взаиморасположение клеток, поверхностные структуры, внутренняя организация) является чрезвычайно важной его характеристикой и лежит в основе таксономии. Поэтому одним из главных методов исследования в области микробиологии является микроскопия [1].
     Первый микроскоп был сконструирован отнюдь не профессиональным ученым, а «любителем», торговцем мануфактурой Антони Ван Левенгуком, жившим в Голландии в семнадцатом веке. Микроскопы Левенгука представляли собой небольшую, величиной с горошину, сферическую линзу, вставленную в оправу. С точки зрения сегодняшней оптики, прибор, который называется «микроскопом Левенгука», является не микроскопом, а очень сильной лупой, поскольку его оптическая часть состоит только из одной линзы.
     Большой вклад в разработку проблем теоретической и прикладной оптики, усовершенствование оптических систем микроскопа и микроскопической техники внесли М.В. Ломоносов, И.П. Кулибин и др. [2].
     Основу микроскопических методов исследования составляют световая микроскопия со всеми ее разновидностями (темнопольная, фазово-контрастная, люминесцентная и др.). Выбор метода микроскопии определяется целями, стоящими перед исследователем. 
     Метод люминесцентной микроскопии основан на способности некоторых веществ светиться под действием коротковолновых лучей. При этом длина волны излучаемого при люминесценции света всегда будет больше, чем длина волны света, возбуждающего люминесценцию. Препараты для люминесцентной микроскопии окрашивают специальными светящимися люминесцентными красителями – флуорохромами (акридиновый оранжевый, изотиоцианат флуоресцеина и др.). Лучи света от сильного источника (обычно ртутной лампы сверхвысокого давления) пропускают через сине-фиолетовый светофильтр. Под действием этого коротковолнового излучения окрашенные флуорохромом клетки или бактерии начинают светиться красным или зеленым светом. Метод люминесцентной микроскопии позволяет изучать живые нефиксированные бактерии, окрашенные сильно разведенными флуорохромами, не причиняющими вреда микробным клеткам. По характеру свечения могут быть дифференцированы отдельные химические вещества, входящие в состав микробной клетки. Метод с успехом может быть использован для ускоренной диагностики ряда заболеваний.
     Малые размеры, а также низкие величины оптической плотности и показателя преломления большинства прокариотических клеток делают их почти невидимыми в обычном световом микроскопе даже при большом увеличении. Большим достижением в развитии методов визуализации микробных клеток стало изобретение Цернике в 1934 году фазово-контрастного микроскопа и разработка этого вида микроскопии Келлером и Лузом.
     При обычной световой микроскопии контраст достигается в том случае, если различные структурные элементы по-разному поглощают свет. Такой тип образца называют абсорбционным, или амплитудным, объектом, поскольку он меняет амплитуду падающего света. Другие объекты, в том числе многие бактерии, относятся к фазовому типу – они совсем не поглощают свет или все части объекта поглощают его одинаково. В структуре таких образцов имеются различия по толщине или показателю преломления, и поэтому они изменяют только фазу волны падающего света, но не амплитуду. Человеческий глаз не способен уловить эти фазовые сдвиги. Метод фазового контраста позволяют сделать объекты видимыми путем превращения фазовых сдвигов в амплитудные. Существенными недостатками фазово-контрастной микроскопии являются слабая контрастность получаемых изображений и наличие светящихся ореолов вокруг объектов. Она не увеличивает разрешающей способности микроскопа, но помогает выявить детали структуры живых бактерий, стадии их развития, изменения в них под действием различных агентов (антибиотики, химические вещества и т. д.). 
     Другим методом визуализации микробных клеток служит интерференционная отражательная микроскопия, основанная на использовании интерференции волн, отраженных от различных границ раздела фаз, например, стекло–вода, вода–плазмолемма. Благодаря изменениям коэффициента преломления возникает псевдотрехмерное изображение, в котором можно количественно определить толщину объекта.
     Степень разрешения световой микроскопии удалось повысить путем разработки метода лазерной конфокальной сканирующей микроскопии. В этих приборах вместо обычного источника света используется лазер. Лазерный луч сканирует поверхность образца. Метод позволяет получать изображения тонких плоскостей внутри образца, трехмерную реконструкцию объекта и проводить разнообразные количественные измерения [1, 3].
     Благодаря относительной простоте приготовления исследуемых объектов, а также возможности изучения биологических образцов в условиях близких к природным, оптическая микроскопия получила чрезвычайно широкое распространение и по прежнему входит в обойму «рутинных» методов микробиологии. Увидеть детальное строение микроорганизмов на молекулярном уровне, изучить и описать их ультраструктуру удалось лишь с появлением электронной микроскопии (сороковые года двадцатого века).
     Электронный микроскоп (ЭМ) представляет собой прибор, позволяющий получать изображение объектов с максимальным увеличением до миллиона раз, благодаря использованию вместо светового потока пучка электронов. Его разрешающая способность в десятки тысяч раз превосходит разрешение светового микроскопа и для лучших современных приборов может составлять несколько ангстрем[4].
     История создания электронного микроскопа – замечательный пример того, как самостоятельно развивающиеся области науки и техники могут, обмениваясь полученной информацией и объединяя усилия, создавать новый мощный инструмент научных исследований.
     Вершиной классической физики была теория электромагнитного поля, которая объяснила распространение света, возникновение электрических и магнитных полей, движение заряженных частиц в этих полях как распространение электромагнитных волн. Волновая оптика сделала понятными явление дифракции, механизм формирования изображения и игру факторов, определяющих разрешение в световом микроскопе. Успех в области теоретической и экспериментальной физики обусловлен открытием электрона с его специфическими свойствами. Эти отдельные и, казалось бы, независимые пути развития привели к созданию основ электронной оптики, одним из важнейших приложений которой являлось изобретение ЭМ в тридцатых годах двадцатого века. Прямым намеком на такую возможность можно считать гипотезу о волновой природе электрона, выдвинутую в 1924 г. Луи де Бройлем и экспериментально подтвержденную в 1927 г. К. Дэвиссоном и Л. Джермером. Тем самым была подсказана аналогия, позволившая построить ЭМ по законам волновой оптики.
     Существует множество разновидностей электронной микроскопии. Исторически первым был создан просвечивающий (трансмиссионный) электронный микроскоп (Эрнст Август Руска, 1931 г.). С тех пор, несмотря на множество технических усовершенствований, улучшающих разрешение, облегчающих работу и анализ полученных изображений, его принципиальная схема не претерпела существенных изменений. 
     Для регистрации изображения сначала применяли фоточувствительные материалы (фотопленку, фотопластинки), однако в последнее время они вытесняются цифровыми матрицами (как в цифровых фотокамерах). Это позволяет сразу же получать оцифрованную информацию об образце, обрабатывать ее, используя современные компьютерные программы анализа изображений и сохранять в долговременной памяти.
     В отличие от обычного просвечивающего микроскопа в растровом электронном микроскопе (РЭМ) изображение строится не одновременно во всех точках, а последовательно, путем сканирования образца сфокусированным пучком по определенной траектории от точки к точке. Синхронно на мониторе по экрану движется луч, формирующий изображение, как это делается в обычном телевизоре.
     Первичные электроны, падающие на образец, взаимодействуют с электронами внешних оболочек атомов мишени, передавая им часть своей энергии. Происходит ионизация атомов образца, а высвобождающиеся в этом случае электроны могут покинуть образец и быть выявлены в виде вторичных электронов. Вторичные электроны обеспечивают максимальную, в сравнении с другими сигналами, разрешающую способность порядка пяти нанометров. Поэтому они являются в РЭМ главным источником информации для получения изображения поверхности объекта. С целью увеличения эмиссии вторичных электронов часто образец устанавливается под углом к оси зонда. 
     Растровая микроскопия позволяет исследовать микрорельеф, определять локально химический состав, распределение отдельных элементов по образцу, проводить рентгеновский спектральный анализ в заданных точках. РЭМ дает возможность получать снимки с большой глубиной резкости, что делает его незаменимым инструментом в исследованиях шероховатых поверхностей, биообъектов и структур со сложной топологией, трехмерных наноэлектромеханических систем [2, 5].
     Электронная микроскопия широко применяется в биологических и медицинских исследованиях. Она позволяет выявить компоненты клетки и детали строения мембран, митохондрий, эндоплазматической сети, рибосом и множества других органелл, входящих в состав клетки. 
     Биологические исследования с использованием этого вида микроскопии были распространены и на микроорганизмы, особенно на вирусы, которые не разрешаются световыми микроскопами. Электронная микроскопия позволила выявить, например, структуры бактериофагов и расположение субъединиц в белковых оболочках вирусов. Кроме того, методами позитивного и негативного окрашивания удалось выявить структуру с субъединицами в ряде других важных биологических микроструктур. Методы усиления контраста нуклеиновых кислот позволили наблюдать одно- и двунитивые ДНК [6]. 
     Электронная микроскопия – мощное средство изучения наноструктур, в ряде случаев не заменимое другими методами. Наряду с большими достоинствами ей присущи и серьезные недостатки: необходимость сложной и трудоемкой подготовки образцов, в результате которой их свойства могут сильно измениться; существенные радиационные повреждения под действием высокоэнергетических электронов пучка, вследствие чего структура и свойства материала могут претерпеть значительные изменения в процессе исследования.
     Возникшая в 1981 году новая область микроскопии – сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ) потенциально является способной совместить в себе основные достоинства оптической и электронной микроскопии.
     Развитие техники СЗМ началось с прообразов атомно-силовых микроскопов – профилометров. Профилометры широко применяют в настоящее время для изучения профилей поверхности вдоль выбранной координаты. Измерение профиля производится в процессе механической протяжки подложки относительно зонда. Подвод зонда к образцу осуществляют системой микрометрического перемещения. Для защиты от вибраций используют пассивные системы в виде резиновых опор. При презиционных измерениях используют виброзащитные столы. Перемещение зонда по нормальной координате регистрируют емкостным или индукционным датчиками. Для ранних приборов использовались аналоговые схемы управления с жесткой автоматикой, данные о профиле поверхности записывались в самописец. В настоящее время профилометры оснащены вычислительной техникой для записи и обработки данных. Латеральное разрешение профилометров к началу восьмидесятых годов составляло 100 нм, а разрешение по вертикали около 1 нм. Примерно такие же характеристики приборов сохранились и в настоящее время.
     Сканирующая зондовая микроскопия – один из современных методов исследования морфологии и локальных свойств поверхности твердого тела с высоким пространственным разрешением. За последние десять лет она превратилась в широко распространенный и успешно применяемый инструмент для исследования свойств поверхности. В настоящее время практически ни одно исследование в области физики поверхности и тонкопленочных технологий не обходится без применения методов СЗМ [7].
     Общей чертой всех сканирующих зондовых микроскопов является наличие микроскопического зонда, который приводится в контакт с исследуемой поверхностью и, в процессе сканирования, перемещается по некоторому участку поверхности заданного размера.
     Контакт зонда и образца подразумевает их взаимодействие, это взаимодействие носит сложный характер. Чтобы осуществлять исследование с помощью конкретного прибора, из широкого спектра выбирается какое-либо одно рабочее взаимодействие. Природа выбранного взаимодействия и определяет принадлежность прибора к тому или иному типу в рамках семейства зондовых микроскопов. Информация о поверхности извлекается путем фиксации (при помощи системы обратной связи) или детектирования взаимодействия зонда и образца. Миниатюрные размеры зонда и высокая чувствительность детектирующей системы зондовых микроскопов позволяет достигать нано- и субнанометрового пространственного разрешения при детектировании поверхностных свойств (разрешающая способность прибора, как правило, тем выше, чем более короткодействующий характер имеет взаимодействие зонда и образца).
     Процесс сканирования осуществляется при помощи пьезокерамического манипулятора (или системы манипуляторов). Зонд движется последовательно, строка за строкой, вдоль поверхности. Для оцифровки данных участок сканирования разбивается на  строк, а каждая строка на  точек, таким образом, положение иглы в плоскости  описывается двумя координатами  из множества {}  точек (обычно выбирают  равно ).
     Если зонд движется над поверхностью при постоянной координате , то говорят, что сканирование осуществляется по способу постоянной высоты. Если же система обратной связи фиксирует в процессе сканирования на заданном уровне величину рабочего взаимодействия вариацией вертикальной  координаты зонда, то говорят, что сканирование осуществляется по способу постоянного взаимодействия.
     С помощью компьютерного программного обеспечения можно проводить анализ полученных зависимостей (анализ характерных латеральных и вертикальных размеров поверхностных особенностей, построение сечений, Фурье-анализ, оценка шероховатости и т.д.), отображать полученные зависимости на экране монитора и выводить их на принтер.
     Первым в семействе зондовых микроскопов появился сканирующий туннельный микроскоп (СТМ), принцип работы которого основан на явлении туннелирования электронов через узкий потенциальный барьер между металлическим зондом и проводящим образцом во внешнем электрическом поле [10].
     Идея использования туннельного эффекта для исследования топографических характеристик поверхности была предложена в 1966 году и реализована Р. Янгом, Д. Вартом и Ф. Скиром в 1971 году. Этой группой был создан прибор – «Topografiner», который и являлся первым сканирующим туннельным микроскопом.
     Прибор содержал все характерные блоки СТМ:
     а) трехкоординатный пьезокерамический сканер,  - перемещение в котором (нормальная к поверхности образца координата) осуществлялось при помощи стекера из пяти пьезокерамических дисков толщиной 4,8 нм, а  - сканер был изготовлен из двух пьезокерамических трубок и обеспечивал максимальный размер скана равного 7,6 мкм;
     б) вольфрамовая игла с электрохимической заточкой и последущим отжигом в условиях сверхвысокого вакуума;
     в) микрометрическая система подвода образца и зонда;
     г) автоматическая система измерения и поддержания тока от 0,1 до 5 нА;
     д) система регистрации профиля на основе двухкоординатного самописца и петли обратной связи по току, замкнутую посредством подачи напряжения на пьезокерамику.
     Прибор собирался на фланце и устанавливался в сверхвысоковакуумную камеру с системой откачки на основе магниторазрядного и адсорбционного титанового насосов. Виброзащита осуществлялась при помощи специализированного стола с резонансной частотой по вертикали порядка 1 Гц с использованием демпфера для затухания колебаний на резонансных частотах.
     Проводилось исследование поверхности платины в вакууме. Удавалось наблюдать на поверхности платины ступеньки высотой от 0,3 до 0,6 нм, что интерпретировалось как моно и двухатомные ступени. Т. е. прибор с такими характеристиками должен был обеспечивать получение атомарного разрешения на монокристаллическом ориентированном графите, но задачи такой группа Янга перед собой не ставила.
     Гениальность догадки Герда Биннинга и Генриха Рорера состояла в осознании возможности получения атомарных разрешений при помощи твердотельных зондов [7].
     В 1981 году швейцарскими учеными Гердом Биннигом и Генрихом Рорером был изобретен первый микроскоп из семейства зондовых микроскопов сканирующий туннельный микроскоп (СТМ). В своих работах они показали, что это достаточно простой и весьма эффективный способ исследования поверхности с пространственным разрешением вплоть до атомарного. В 1986 году за его создание ученым была присуждена Нобелевская премия по физике.
     Вслед за туннельным микроскопом в течение короткого времени были созданы атомно-силовой микроскоп (АСМ), магнитно-силовой микроскоп (МСМ), электросиловой микроскоп (ЭСМ), ближнепольный оптический микроскоп (БОМ) и многие другие приборы, имеющие сходные принципы работы и называемые сканирующими зондовыми микроскопами [8, 9].
     В СТМ зонд подводится к поверхности образца на расстояние в несколько ангстрем. При этом образуется туннельно-прозрачный потенциальный барьер, величина которого определяется, в основном, значениями работы выхода электронов из материала зонда и образца. Экспоненциальная зависимость тока от расстояния позволяет осуществлять регулирование расстояния между зондом и образцом в туннельном микроскопе с высокой точностью. СТМ представляет собой электромеханическую систему с отрицательной обратной связью. Система обратной связи поддерживает величину туннельного тока между зондом и образцом на заданном уровне, выбираемом оператором. Контроль величины туннельного тока осуществляется посредством перемещения зонда вдоль оси  с помощью пьезоэлектрического элемента (рисунок 1).
     Изображение рельефа поверхности в СТМ формируется двумя способами. В режиме постоянного туннельного тока зонд перемещается вдоль поверхности, осуществляя растровое сканирование; при этом изменение напряжения на -электроде пьезоэлемента в цепи обратной связи (с большой точностью повторяющее рельеф поверхности образца) записывается в память компьютера в виде функции, а затем воспроизводится средствами компьютерной графики.

     1 – пьезодвигатель; 2 – усилитель; 3 – АЦП; 4 – образец
     Рисунок 1 – Основные узлы СТМ
     Высокое пространственное разрешение СТМ определяется экспоненциальной зависимостью туннельного тока от расстояния до поверхности. Разрешение в направлении по нормали к поверхности достигает долей ангстрема. Латеральное же разрешение зависит от качества зонда и определяется, в основном, не макроскопическим радиусом кривизны кончика острия, а его атомарной структурой. При правильной подготовке зонда на его кончике с большой вероятностью находится либо одиночный выступающий атом, либо небольшой кластер атомов, который локализует его на размерах, много меньших, чем характерный радиус кривизны острия [11].
     Ограниченность применений сканирующей туннельной микроскопии была очевидна с момента изобретения, поэтому, как только появилась твердая уверенность в реальном изготовлении приборов, способных осуществлять и регистрировать субнанометровые перемещения, родилась задача расширения приложений. В 1985 году Г. Биннинг во время своей поездки в США оценил соотношение межатомных сил взаимодействия на поверхности твердого тела и давления со стороны зонда. Из этой оценки следовало, что даже если игла будет оканчиваться отдельным атомом, реально сделать зонд в виде консоли с иглой с такими параметрами балки, что поверхность не будет разрушаться в процессе этого контакта. Идея Биннинга была реализована в 1986 году Г. Биннингом, Гербером и Квайтом. Был изобретен первый вариант атомно-силового микроскопа. В качестве зонда было предложено использовать острую иглу, прикрепленную на конец острой пружинки, а вертикальное перемещение пружинки предлагалось измерять чувствительным датчиком, способным фиксировать малые перемещения (рисунок 2) [7].


1 – фотодиод; 2 – зеркало; 3 – лазер; 4 – кантилевер в держателе; 
5 – пьезосканер; 6 – система обратной связи; 7 – компьютер
     Рисунок 2– Основные узлы АСМ
     Таким образом, вид зондовой микроскопии, в основе которого лежит силовое взаимодействие атомов, носит название атомно-силовой микроскопии (АСМ).
     Атомно-силовой микроскоп уступает в разрешающей способности СТМ, но не требует обязательной электрической проводимости исследуемых образцов. Принцип его действия основан на использовании сил атомных связей, действующих между атомами вещества. На малых расстояниях между двумя атомами (около одного ангстрема) действуют силы отталкивания, а на больших – силы притяжения. В сканирующем атомно-силовом микроскопе такими телами служат исследуемая поверхность и скользящее над нею острие.
     Характер данного взаимодействия достаточно сложен, поскольку определяется свойствами зонда, образца и среды, в которой проводится исследование. Сила, действующая на зонд со стороны поверхности, приводит к изгибу консоли. Регистрируя величину изгиба, можно контролировать силу взаимодействия зонда с поверхностью. Схематическое изображение зондового датчика для атомно-силового микроскопа представлено на рисунке 3. 
     Оптическая система регистрации АСМ юстируется таким образом, чтобы излучение полупроводникового лазера фокусировалось на консоли зондового датчика, а отраженный пучок попадал в центр фоточувствительной области фотоприемника.
     

     
     Рисунок 3 – Схематическое изображение зондового датчика АСМ
     
     В качестве позиционно-чувствительных фотоприемников применяются четырехсекционные датчики отклонения кантилевера – полупроводниковые фотодиоды. При сканировании обратная связь фиксирует разностный сигнал верхних и нижних сегментов фотодиода, нормированный на величину суммарного сигнала всех сегментов фотодиода........................