Общая характеристика и эпидемиология хронической обструктивной болезни легких

    Введение
    В структуре общей заболеваемости населения России, болезни органов дыхания традиционно занимают лидирующую позицию - на их долю приходится до 27,8% всей зарегистрированной и 42,7% выявленной впервые в жизни патологии. Среди хронических респираторных заболеваний у взрослых значительная часть приходится на хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ). По оценке Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), ХОБЛ как причина смертности делит четвертое / пятое место с вирусом иммунодефицита человека после сердечно-сосудистых, цереброваскулярных заболеваний и острых респираторных инфекций. В отличие от вышеперечисленных заболеваний, за последние 10 лет, летальность от  ХОБЛ увеличилась на 25%. Такая же ситуация наблюдается в Российской Федерации и, в частности, в Республике Башкортостан (https://health.bashkortostan.ru).
     Наследственная предрасположенность является важным внутренним фактором риска развития хронических заболеваний органов дыхания, с которыми тесно связаны особенности иммунологической реактивности, роста и развития легких (GOLD, 2010). Многие аспекты развития хронических заболеваний органов дыхания до сих пор не ясны, но известны ключевые звенья, патогенеза. Это, прежде всего, хроническое воспаление, запускающее весь каскад патогенетических реакций, приводящих к нарушению баланса протеолитических ферментов и их ингибиторов, и развитию окислительного стресса. Генетические механизмы формирования ХОБЛ в последние годы стали объектом широкомасштабных исследований во всем мире. До «Эры GWAS» генетическая составляющая ХОБЛ достаточно активно изучалась с использованием анализа генов-кандидатов (Silverman et al., 2011). Данный метод до сих пор наиболее широко используется при проведении исследований по генетике ХОБЛ, поскольку позволяет сосредоточиться на одном или нескольких функционально значимых аллельных вариантах гена, кодирующих соответственно варианты белка, различающиеся по структуре и функциям, некоторые из которых могут быть вовлечены в развитие патогенетических изменений.
    Геном человека находится под постоянным воздействием экзогенных факторов и эндогенных метаболитов, которые способны повреждать химическую структуру ДНК, и изменять содержащуюся в ней информацию (Костин и др., 2009). В клетке находятся  специфические белковые молекулы системы репарации ДНК, обеспечивающие стабильность клеточного генома. Несомненно, любые изменения в генах, кодирующих белки репарации, влияют на способность клетки восстанавливать свой генетический материал и увеличивают риск малигнизации (Branzei, Foiani, 2008). Известно, что инактивирующие мутации в генах системы репарации ДНК встречаются крайне редко и приводят к внутриутробной гибели плода, что в свою очередь свидетельствует о важности этих генов для жизнедеятельности организма (Костин, 2009). Однако существует полиморфизм генов репарации, который способен изменить функцию белков и, таким образом, нарушить способность клеток к восстановлению целостности (Костин, 2009; Branzei, Foiani, 2008).
    Существуют  доказательства  снижения  процессов репарации ДНК при ХОБЛ (Siganaki et al., 2010;  Savale et al., 2009). В значительной мере это может быть связано с дисбалансом в системе оксиданты-антиоксиданты и постоянным окислительным стрессом, циклической активацией  и пролиферацией лимфоцитов (Xie et.al.,  2009),  в тоже  время не исключено, что причиной служит недостаточная эффективность системы репарации двунитевых разрывов ДНК  (Shi et al., 2012).
    Целью исследования является выявление ассоциации полиморфных вариантов генов, кодирующих ферменты репарации  ДНК с развитием   и прогрессированием ХОБЛ в популяции татар.
    Исходя из поставленной цели, были выдвинуты следующие задачи: 
  1. Определить частоты генотипов и аллелей полиморфных локусов генов репарации ДНК у больных ХОБЛ и индивидов контрольной группы.
  2. Изучить ассоциацию полиморфных вариантов генов XPC (rs2228001, поли (AT)), XRCC1 (rs25487, rs25489), XRCC3 (rs861539), XPD (rs13181), XPA (rs1800975) с развитием и клиническими фенотипами ХОБЛ
  3. Провести анализ ассоциации исследованных полиморфных локусов с развитием ХОБЛ с учетом этнической принадлежность и статуса курения обследованных.

  Данная дипломная работа проводилась в лаборатории физиологической генетики Учреждения Российской академии наук Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН.




     ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
     1.1. Общая характеристика и эпидемиология  хронической обструктивной болезни легких
     Подавляющее большинство заболеваний человека являются по своей природе многофакторными хроническими патологическими процессами. Они оказывают влияние на качество жизни значительной части населения, ограничивают трудоспособность, часто приводят к инвалидизации, преждевременному старению и смерти, то есть представляют собой глобальную медицинскую и социальную проблему. Многие из них характеризуются длительным латентным периодом: от первых патологических реакций в детстве до появления клинических признаков уже в зрелом возрасте (Пузырев, 2009; Баранов, 2009). Классическими примерами подобного рода патологий является хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ).
     Попытки борьбы с заболеваемостью населения с помощью профилактических мероприятий, направленных против средовых факторов риска оказались не столь эффективными, как ожидалось. Стало очевидным, что дальнейшие перспективы в изучении природы многих заболеваний, разработке эффективной стратегии предиктивной и профилактической медицины, медицинской генетики связаны с познанием генома человека, с выявлением его особенностей, создающих предпосылки для формирования патологического фенотипа (Баранов, 2009). 
     Показано, что эффекты полиморфизма генов могут модулироваться в связи с влиянием факторов среды, этнической принадлежностью (Пузырев, 2009; Sagoo, et al., 2009; Silverman et al., 2011). 
     В силу того, что легкие и другие органы дыхания находятся на границе двух сред, они постоянно оказываются подверженными неблагоприятному влиянию вредных веществ, загрязняющих атмосферный воздух (Гичев, 2002).
     В течение многих лет болезни органов дыхания являются одной из ведущих причин заболеваемости и смертности в современном обществе и представляют собой значительную экономическую и социальную проблему не только в Российской Федерации, но и во всем мире. Ежегодно в нашей стране более миллиона человек становятся инвалидами в результате патологии органов дыхания, из которых около 40 тысяч – дети (Чучалин, 2009; GOLD, 2011; www.who.int).
     В структуре общей заболеваемости населения России, болезни органов дыхания традиционно занимают лидирующую позицию, на их долю приходится до 27,8% всей зарегистрированной и 42,7% выявленной впервые в жизни патологии (http://mzrb.bashmed.ru). Неуклонный рост заболеваемости болезнями органов дыхания обусловлен широким распространением курения и увеличением антропогенного загрязнения окружающей среды. Отмечается широкая распространенность заболеваний дыхательной системы среди населения городов и территорий с неблагоприятной экологической обстановкой (Чучалин, 2009; GOLD, 2011).  
     Республика Башкортостан (РБ) – важнейший промышленный регион с довольно сложной экологической ситуацией. Концентрация нефтехимических и химических производств, предприятий металлообрабатывающей и горнодобывающей промышленности на территории крупных городов способствовали загрязнению окружающей среды и экологической нагрузке на население. На территории РБ располагается более 3500 промышленных предприятий, сельскохозяйственных объектов, выбрасывающих загрязняющие вещества в атмосферу. Основным загрязнителем атмосферного воздуха и водного бассейна РБ являются автотранспорт и промышленные предприятия, насыщающие среду такими вредными для человека соединениями, как  оксиды углерода, серы, азота, углеводороды, соединения свинца, пыль, табачный дым и многие другие, что привело к обострению экологической ситуации и  создает реальную основу для роста заболеваемости и первую очередь заболеваниями органов дыхания (http://www.bashkortostan.ru/; http://mzrb.bashmed.ru).
     ХОБЛ – многофакторное  хроническое, экологически   опосредованное  воспалительное заболевание респираторной системы, с преимущественным поражением дистальных отделов дыхательных путей и легочной паренхимы с развитием эмфиземы, проявляющееся частично обратимой бронхиальной обструкцией, характеризующееся прогрессированием и нарастающими явлениями дыхательной недостаточности (Чучалин, 2009; GOLD, 2011). Обструкция при ХОБЛ носит прогрессирующий характер и обусловлена патологическим воспалительным ответом легких на воздействие ингалируемых вредных частиц или газов (GOLD, 2011). Для ХОБЛ характерно развитие системных эффектов, обуславливающих развитие тяжелых осложнений дополнительно отягощающих течение болезни у отдельных пациентов (GOLD, 2011).
     Одной из причин, способствующих возникновению ХОБЛ, являются хронические воспалительные заболевания легких, возникающие в детском возрасте, продолжающиеся у подростков и взрослых. В первую очередь, это заболевания с преимущественным двухсторонним поражением мелких дыхательных путей и паренхимы легкого (GOLD, 2011). Затяжные и хронические заболевания респираторной системы являются  одной из самых актуальных проблем педиатрии и клинической медицины в целом (Ferkol, Schraufnagel , 2014; Геппе c cоавт., 2009).
     Распространенность, заболеваемость и смертность от хронических заболеваний органов дыхания значительно различаются в разных странах (www.who.int). В последние годы во всем мире отмечается рост бронхообструктивной патологии и, прежде всего, увеличивается заболеваемость ХОБЛ. По официальным данным Министерства здравоохранения и социального развития, в РФ уже сегодня ХОБЛ занимает 4-е - 5-е место среди всех причин смертности (после сердечнососудистых заболеваний, диабета, травм).  За последние 30 лет смертность больных ХОБЛ возросла в 3,3 раза среди мужчин и в 15 раз среди женщин (Чучалин, 2009). В России на 1 января 2007 г. распространенность ХОБЛ составила 49,7 на 100 тыс. населения и 187,0 на 100 тыс. населения по заболеваемости хроническим бронхитом и эмфиземой легких (www.minzdravsoc.ru). Для Республики Башкортостан эти цифры составили 97,4 и 206,4 на 100 тыс. населения, соответственно. В Российской Федерации в 2008 г. среди детей до 14 лет распространенность хронического бронхита и эмфиземы составила 69,0 на 100 тыс. детского населения (www.minzdravsoc.ru). В Республике Башкортостан в 2008 г. зарегистрировано 67,5 больных хроническим бронхитом и эмфиземой на 100 тыс. детского населения в возрасте от 0-14 лет (www.minzdravsoc.ru). По данным Министерства здравоохранения Республики Башкортостан (МЗ РБ) в 2009 г. заболеваемость болезнями органов дыхания приблизилась к 41 тыс. на 100 тыс. населения (http://mzrb.bashmed.ru).
     По экспертным оценкам в мире диагностируются только 25% от всех случаев ХОБЛ, причем, в основном на стадиях, когда болезнь приняла клинически выраженную форму, требует госпитализации пациента и неотложной терапии (Чучалин, 2009; GOLD, 2010). Поэтому имеющиеся на сегодняшний день данные о распространенности ХОБЛ существенно занижены. В Pоccии количество людей c признаками XОБЛ составляет около 11 млн. человек (Чучалин, 2009). 
     Для привлечения внимания врачей к проблемам диагностики, патогенеза и лечения ХОБЛ в 1998 году Национальным институтом сердца, крови и легких (США) и Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) был инициирован проект GOLD «Глобальная инициатива по хронической обструктивной болезни легких» (Global Initiative for Chronic Obstructive pulmonary Disease) (www.goldcopd.com). С этого момента по настоящее время действия международного комитета экспертов GOLD направлены на объединение усилий общественности для предотвращения и лечения этого серьезного заболевания.
     1.2. Экзогенные  факторы риска развития ХОБЛ
     Традиционно одним из основных факторов риска развития ХОБЛ считается курение. Около 80% смертей от ХОБЛ относятся на счёт курения. Заядлые курильщики имеют в 30 раз более высокий риск развития ХОБЛ по сравнению с некурящими (Андреева, Красовский, 2004; GOLD, 2011; Silverman et al., 2011). Прямая связь между развитием ХОБЛ и курением несомненна (Shapiro, Ingenito, 2005). Именно дыхательные пути являются местом абсорбции табачного дыма, а, следовательно, и наиболее уязвимы при воздействии свободных радикалов, образующихся в результате сгорания сигарет. Табачные изделия содержат такие вещества как никотин, полициклические ароматические углеводы (ПАУ), N-нитрозамины, угарный газ, синильную кислоту, акролеин, оксиды азота, 76 металлов, радиоактивные вещества, которые содействуют нарушению функциональной деятельности респираторной системы и развитию ХОБЛ (Андреева, Красовский, 2004). Многие компоненты табачного дыма индуцируют экспрессию микросомальных ферментов, что в свою очередь приводит к еще большему повреждению клеток на молекулярном уровне. Свободные радикалы табачного дыма вместе с другими высокоактивными веществами, например перекисными соединениями, составляют группу оксидантов, которые участвуют в реализации окислительного стресса (Matthews et al. 2012).
     Особое место в патогенезе хронических заболеваний дыхательных путей занимает инфекционный процесс. Перенесенная в детстве тяжелая респираторная инфекция может приводить к снижению функции легких и формированию ХОБЛ во взрослом состоянии (Zhao et al., 2014; Grigg, 2009; Cookson, Moffatt, 2011).
     Многочисленными эпидемиологическими исследованиями показана важная роль загрязнения окружающей среды при возникновении заболеваний дыхательной системы (Гичев, 2002). Распространенными и наиболее опасными поллютантами окружающей среды являются продукты сгорания дизельного топлива, выхлопные газы грузовых и легковых автомашин - диоксид серы, азота и углерода, свинец, угарный газ, бенз(а)пирен, промышленные отходы - черная сажа, дымы, формальдегид и прочие. (Величковский, 2003; Чучалин, 2009).
      
     1.3. Патогенез ХОБЛ
     Многие аспекты развития ХОБЛ до сих пор  не ясны, но существуют ключевые механизмы, которые  вовлечены в патогенез. Это, прежде всего, хроническое воспаление, которое запускает весь каскад реакций, приводящий к нарушению баланса протеолитических ферментов и их ингибиторов и развитию окислительного стресса (Bosse  et al. 2009; Silverman et al., 2011).
     ХОБЛ характеризуется хроническим персистирующим воспалением всех отделов дыхательных путей, легочной паренхимы, а также сосудов легких (Чучалин, 2009). Пусковым механизмом развития воспаления служит воздействие факторов внешней среды (курение, экспозиция вредных бытовых и производственных поллютантов, инфекционных агентов) (рис. 1). Все клеточные элементы респираторной системы под влиянием названных факторов активируются и участвуют в воспалительной реакции. Воспаление лежит в основе таких нарушений, как гиперсекреция слизи и цилиарная дисфункция, дыхательная обструкция, изменения в газовом обмене, лёгочная гипертензия и системные эффекты (Barnes, 2011). Воспалительные клетки выделяют большое количество активированных форм кислорода (АФК) и реактантов, способных повреждать структуру легких и поддерживать нейтрофильное воспаление. АФК способны разрушать белки, липиды и нуклеиновые кислоты, что приводит к апоптозу клеток и сдвигу равновесия в системе оксиданты-антиоксиданы, и развитию окислительного стресса. Окислительный стресс - это состояние, при котором АФК оказывают токсическое действие вследствие их повышенного образования или в результате нарушений механизмов клеточной защиты.

     Рис. 1. Схема  патогенеза ХОБЛ  (MacNee, Rahman, 2000).
     
     Угнетение антиоксидантной системы приводит к истощению запасов глутатиона в легких и повышению уровня перекисного окисления липидов, а также к повышению экспрессии генов провоспалительных цитокинов (Barnes,  2011).
     Исследования последних лет показывают, что АФК действуют не только на биохимическом уровне, путём инактивации антипротеаз, индукции апоптоза, регуляции клеточной пролиферации, модулирования иммунной системы лёгких (Rabinovich, MacNee, 2011), но и на молекулярном – инициируя воспалительный процесс посредством активации таких транскрипционных факторов как nuclear factor-kB (NF-kB, ядерный фактор-kB) и activator protein-1 (АР-1, белок-активатор-1), сигнальной трансдукции, непосредственного воздействия на хроматин и экспрессию генов провоспалительных медиаторов (Yang  et al., 2012).
     Реализация всех компонентов патогенеза в дебюте заболевания осуществляется под влиянием факторов риска ХОБЛ, а при сформировавшейся болезни принимает характер самоподдерживающегося процесса, под влиянием которого формируются основные патофизиологические компоненты заболевания, определяющие бронхиальную обструкцию и развитие эмфиземы легких (Чучалин, 2009).
     
     1.4. Генетические факторы риска развития ХОБЛ
     Многочисленные ассоциативные исследования показывают, что в патогенезе ХОБЛ принимают участие множество функционально взаимосвязанных генов (генных сетей), в том числе главные, ключевые гены, и гены-модификаторы, фенотипический эффект которых зависит от факторов окружающей среды (Silverman, 2011).
     Одним из первых генетических маркеров раннего развития эмфиземы и ХОБЛ тяжелого течения был альфа1-антитрипсин (AAT). Дефицит альфа1–антрипсина, обусловленный несколькими мутациями в гене SERPINA1, до сих пор считается единственным хорошо изученным  генетическим фактором риска  развития эмфиземы и ХОБЛ (GOLD, 2011; Silverman, 2011). При ?1-антитрипсиновой недостаточности, обусловленной Z аллелем (Glu342Lys) гена SERPINA, фермент теряет способность должным образом контролировать деятельность нейтрофильной эластазы, являющнгося основной мишенью SERPINA1 в легких, приводя к разрушению ткани легкого и развитию эмфиземы (Davies, Lomas et al., 2008). Кроме того, у лиц, гомозиготных по Z-варианту, происходит накопление агрегатов или полимеров серпина в эндоплазматическом ретикулуме антитрипсин-продуцирующих клеток (Zari?  et al., 2011). Другой дефицитный аллель S, возникший в результате точковой мутации в 3-м экзоне гена SERPINA1, которая приводит к замене остатка глутаминовой кислоты на валин в 264 положении белковой молекулы (Glu264Val). У индивидов, гомозиготных по вышеописанным мутациям, уровень ?1-AAT снижен в плазме крови до 15% (Z/Z) и до 60% (S/S) от нормы (Law et al., 2006). Однако дефицит альфа1-антитрипсина является причиной заболевания лишь у 1-2% индивидов с ХОБЛ (GOLD, 2011).  
     Начиная с 1998 года, генетическая составляющая ХОБЛ достаточно активно изучалась с использованием анализа генов, которые вовлечены в звенья патогенеза заболевания. Большая часть исследований посвящена анализу ассоциаций полиморфных маркеров генов-кандидатов с ХОБЛ с использованием метода ПЦР на выборках объемом от нескольких десятков до нескольких сотен и тысяч человек. Данный метод до сих пор чаще всего используется при проведении  исследований по генетике ХОБЛ (Silverman, 2011; www.copdgene.org). Однако данные, полученные разными исследователями, носят противоречивый характер. Отсутствие однозначных результатов может быть связано со следующими факторами: малый размер выборок, гетерогенность фенотипа ХОБЛ в различных исследованиях, множественные сравнения, ошибки генотипирования, популяционная стратификация, неполный анализ гена, отсутствие публикаций по отрицательным результатам, генетическая неоднородность (Silverman, 2011; www.copdgene.org).
     Другим методом поиска генов предрасположенности к многофакторным заболеваниям является проведение анализа сцепления. Однако данный методический подход слишком сложно использовать при изучении генетики ХОБЛ, так как манифестация заболевания происходит после 40-50 лет. Выходом является выявление семей с ранней манифестацией ХОБЛ (www.copdgene.org). Группой Silverman E. (2002) был проведен первый полногеномный анализ сцепления (genome wide linkage analysis) для выявления новых генов, связанных с развитием ХОБЛ (Silverman, 2002, Palmer, 2003). Для исследования были отобраны 72 семьи (585 человек), пробандами служили индивиды с ранней манифестацией ХОБЛ без дефицита ?1–антитрипсина (Boston Early-Onset COPD). Было протипировано 377 STR-маркеров и обнаружено несколько регионов хромосом, сцепленных с фенотипом хронического бронхита (19, 22), легкой (12p, 8, 19) и средней (12p, 19) степенями обструкции дыхательных путей (LOD=1.37-1.70) (Silverman et al., 2002). После выявления локусов генома, сцепленных с ХОБЛ, было проведено ассоциативное исследование позиционно определенных генов-кандидатов с известной патогенетической функцией. На хромосоме 19q единственным геном, который мог быть связан с развитием ХОБЛ, был ген TFGB1 (transforming growth factor, beta 1, трансформирующий фактор роста бета 1). Была выявлена ассоциация нескольких однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) в промоторе гена TGFB1 с развитием ХОБЛ, подтвержденная двумя независимыми исследованиями (Li, 2012).  
     Для выявления гена, локализованного на хромосоме 2q,  исследователи выбрали альтернативную стратегию. Используя анализ экспрессии клеток легкого мыши и человека, исследователи идентифицировали  ген SERPINE2 (serpin peptidase inhibitor, clade E, серпиновый ингибитор пептидаз, тип E), как новый кандидатный ген для ХОБЛ. Иммуногистохимический анализ продемонстрировал экспрессию гена SERPINE2 в тканях легкого человека и мыши. Проведенный впоследствии анализ показал достоверную ассоциацию нескольких ОНП в гене SERPINE2 с развитием семейных случаев ХОБЛ (DeMeo et al., 2006). В 2007 году было проведено репликативное исследования на расширенных выборках, которое доказало ассоциацию шести ОНП гена SERPINE2 с развитием семейных случаев ХОБЛ, для пяти из них ассоциация была подтверждена и в случае поздней манифестации ХОБЛ в  кандидатном анализе (Zhu et al.,  2007). В дальнейшем, ассоциация полиморфных вариантов в гене SERPINE2 с ХОБЛ и эмфиземой легких была выявлена еще в нескольких исследованиях (An  et al., 2012).
      Современным подходом, позволяющим идентифицировать генетические маркеры риска многофакторных заболеваний, является метод полногеномного исследования генетических ассоциаций (GWAS – genom-wide association studies), состоящем в проведении исследований на значительных по объему выборках с использованием большого количества ОНП, в выборе которых не ориентируются на представления о патогенезе заболевания (www.genome.gov/gwastudies – каталог GWAS). В 2009 году были опубликованы результаты первого многоцентрового  полногеномного исследования по ХОБЛ (Pillai  et al, 2009). Выявлена ассоциация  нескольких локусов с развитием ХОБЛ, на 15-й хромосоме в области 15q25.1, охватывающей целый блок генов CHRNA3, CHRNA5 (cholinergic receptor nicotinic alpha 3, холинергические никотиновые рецепторы альфа 3 и  5),  ген PSMA4 (proteasome subunit alpha type 4, субъединица альфа 4-го типа протеосомного комплекса) и ген  IREB2 (iron-responsive element binding protein 2, белок железо-связывающего элемента 2). На 4-ой хромосоме были идентифицированы локусы, находящиеся в непосредственной близости к генам HHIP (4q31.21) (hedgehog interacting protein, взаимодействующий протеин hedgehog сигнального пути) и FAM13A (4q22.1) (family with sequence similarity 13 member A, член А семейства со схожей последовательностью 13) (Pillai  et al, 2009). Затем, была опубликована серия работ, подтверждающая полученные результаты на независимых выборках (Pillai et al, 2010; Zhou et  al., 2012). 
     В 2011 году при полногеномном анализе, помимо уже выявленных ранее локусов, был идентифицирован новый маркер rs7937 на хромосоме 19q13, ассоциированный с развитием ХОБЛ. Область 19q13 включает гены RAB4B (member RAS oncogene family, ras-related protein Rab-4B, член семейства онкогенов RAS), EGLN2 (egl nine homolog 2, hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase 1, пролил гидроксилаза 1 индуцируемого гипоксией фактора HIF) и ген CYP2A6 (cytochrome P450, family 2, subfamily A, polypeptide 6, цитохром Р450 2A6) (Cho et al., 2012). Ранее ОНП, локализованными в области 19q13 в масштабном полногеномном исследовании Thorgeirsson et al., (2010) приверженности к курению,  показали ассоциацию с такими параметрами,  как количество выкуриваемых сигарет в день и возраст начала курения (Thorgeirsson et al., 2010). Ассоциации с количественными показателями, характеризующими поведение курильщиков при ХОБЛ,  были выявлены с локусами CHRNA3/CHRNA5 на хромосоме 15q25.1, CYP2A6  на хромосоме 19q1 и DBH. Функциональная значимость выявленных генов в настоящее время активно изучается. Так показано, что  ген HHIP (4q31.21) кодирует белок (hedgehog interacting protein, взаимодействующий протеин hedgehog сигнального пути), имеющий важное значение в процессах развития легких (Zhou et  al., 2012). Исследователями было установлено, что полиморфные локусы, ассоциированные с развитием ХОБЛ находятся в области энхансера гена HHIP, замены в которых приводят  к уменьшению активности промотора. Полученные результаты указывают, что HHIP и сигнальный путь Hedgehog вовлечены в патогенез ХОБЛ (Zhou et  al., 2012).  
     DeMeo et al., (2009) установили роль гена IREB2 (iron-responsive element binding protein 2, белок железо-связывающего элемента 2) в патогенезе ХОБЛ, так как белок железо-связывающего элемента 2 является важным звеном поддержания баланса железа в легких (DeMeo et al., 2009). Известно, что дисбаланс железа приводит к развитию воспаления в легочной ткани . Гипоксемия, которая часто сопровождает ХОБЛ, является фактором, регулирующим экспрессию гена IREB2. Кроме того, IREB2 может участвовать в развитии оксидативного стресса и регулировать процесс аутофагии эпителиальных и эндотелиальных клеток (DeMeo et al.,  2009).
     Белок FAM13A (family with sequence similarity 13 member A, семейство со схожей последовательностью 13-го члена А) играет важную роль в сигнальной трансдукции. Известно, что усиление экспрессии гена FAM13A происходит при гипоксии (Chi  et al., 2006).
     Гены CHRNA3, CHRNA5, кодирующие холинергические никотиновые рецепторы альфа 3 и 5, а также ген CYP2A6, кодирующий фермент метаболизма никотина, играют первостепенную роль в формировании приверженности к курению. Данные гены ассоциируют с раком легкого, в развитии, которого курение также является главным фактором риска (Thorgeirsson et al., 2010).      
     1.4.1. Гены-кандидаты развития  ХОБЛ
     На основании знаний нормальной физиологии организма, этиологии и патогенетических механизмов формируются представления о возможных генах предрасположенности к заболеваниям (Баранов, 2009). Подход «ген-кандидат» позволяет сосредоточиться на одном или нескольких аллельных вариантах гена, кодирующих соответственно варианты белка, различающиеся по структуре и функциям и тем самым вовлеченные в развитие патогенетических изменений (Баранов, 2009; Пузырев, 2009). 
     Геном человека находится под постоянным воздействием экзогенных факторов и эндогенных метаболитов, которые способны повреждать химическую структуру ДНК, и изменять содержащуюся в ней информацию (Костин и др., 2009). В клетке находятся  специфические белковые молекулы системы репарации ДНК, обеспечивающие стабильность клеточного генома. Несомненно, любые изменения в генах, кодирующих белки репарации, влияют на способность клетки восстанавливать свой генетический материал и увеличивают риск малигнизации (Branzei, Foiani, 2008). Известно, что инактивирующие мутации в генах системы репарации ДНК встречаются крайне редко и приводят к внутриутробной гибели плода, что в свою очередь свидетельствует о важности этих генов для жизнедеятельности организма (Костин, 2009). Однако существует полиморфизм генов репарации, который способен изменить функцию белков и, таким образом, нарушить способность клеток к восстановлению целостности (Костин, 2009; Branzei, Foiani, 2008).
     В настоящее время у человека открыто более 150 генов, отвечающих за репарацию ДНК (Branzei, Foiani, 2008). Известно несколько систем репарации ДНК (Костин и др., 2009; Branzei, Foiani, 2008; Королев, 2005). Репарация однонитевых разрывов осуществляется при помощи трех основных процессов: 1) эксцизионная репарация оснований (base еxcision repair - BER); 2) эксцизионная репарация нуклеотидов (nucleotide excision repair - NER) и 3) репарация неправильно спаренных оснований в двойной спирали ДНК, возникающих в результате ошибок репликации и рекомбинации (mismatch repair - MMR) (Королев, 2005). Большую опасность представляют двунитевые разрывы ДНК, ведущие к перестройке всего генома. Известно два механизма такой репарации — соединение негомологичных концов (non-homologous end joining - NHEJ) и гомологичная рекомбинация (homologous recombination - HR). 
     Ген XRCC1 (X-ray repair cross-complimenting group 1) является важным компонентом BER-репарации (Костин и др., 2009; Branzei, Foiani, 2008; Королев, 2005). В комплексе с ДНК-полимеразой ? его продукт заполняет однонуклеотидные бреши, образовавшиеся после удаления поврежденного азотистого основания. Наиболее изученными полиморфными локусами этого гена являются rs25489 (c.839G>A) и rs25487 (c.1196A>G). Варианты 839А и 1196G ассоциируются с повышенной чувствительностью к действию мутагенов (Костин и др., 2009). 
     Эксперименты на клеточных линиях XP (xeroderma pigmentosum) китайского хомячка определили 8 основных генов NER-репарации: XPA, XPB, XPC, XPD, XPE, XРF, XРG и XPV, которые впоследствии получили название гены ERCC (excision repair cross-complimenting). В гене XPC показаны полиморфные варианты, имеющие патогенетическую значимость в процессах опухолевого роста, одним из них является замена c.2815C>A (rs2228001) (Vodicka et.al.,2004).
     Хорошо изученный полиморфный локус гена XPA обусловлен заменой c.-4A>G (rs1800975) в 5'  области гена, изменяет транскрипцию гена, приводя к сниженному синтезу  белка (Applebaum et al., 2007). 
     Фермент гена XPD  является ДНК-зависимой АТРазой (Wang et al., 2012). В этом гене определено значительное количество полиморфных локусов, одним из которых является замена c.2251A>C (rs13181). Вариабельные аллели этого гена ассоциированы с низкой способностью к репарации ДНК и высоким риском малигнизации (Wang et al., 2012).
     Ген XRCC3 (X-ray repair cross-complimenting group 3) является одним из генов гомологичной репарации, семейства Rad-51-связанных белков. Во многих исследованиях ген XRCC3 рассматривается в качестве гена-кандидата канцерогенеза, показана ассоциация редкого аллеля с риском развития рака (Matullo et al., 2001; He et al., 2012; Vral et al., 2011).
     Показано, что полиморфизм генов репарации ассоциирован с увеличением частоты хромосомных аббераций, разрывами ДНК, образованием микроядер и формированием опухолей различной локализации (Wang et.al., 2012; Naccarati et al., 2006; Hamdy et al., 2011). Гены репарации ДНК, определяющие индивидуальную токсико-генетическую чувствительность к воздействию факторов внешней среды, имеют множество полиморфных вариантов, однако их роль в развитии заболеваний опухолевой природы остаётся не раскрытой (Manuguerra et a.,l 2006). Данные, получаемые в ассоциативных исследованиях в разных популяциях мира, показывают противоречивый результат. Это, прежде всего, связано с большой вариабельностью в распределении аллелей полиморфных локусов генов репарации, в современных популяциях (Костин и др, 2009; Naccarati et al., 2006; Hamdy et al., 2011; Manuguerra et a., 2006).  




      Глава 2. Материалы и методы исследования
      
      2.1. Объект исследования
     В работе использовали образцы ДНК неродственных индивидов, татар по этнической принадлежности (N=1019), проживающих на территории Республики Башкортостан, Россия. Диагноз ХОБЛ устанавливали согласно Международной Классификации Болезней 10-го пересмотра и с учетом рекомендаций Global initiative for chronic obstructive lung disease (GOLD, 2011) (GOLD, 2011; 25]. Выборка больных ХОБЛ состояла из 511 человека (432 мужчин (84.54%) и 79 женщин (15.46%)), средний возраст составил  62.74±12.7 лет. Среди больных ХОБЛ курильщиков и бывших курильщиков было 392 человека (76.71%), некурящих 119 (23.29%), индекс курения у курильщиков (PY=44.58±25.92). Для выявления ассоциации полиморфных локусов с тяжестью течения, различными фенотипами ХОБЛ внутри выборки больных выделяли следующие  подгруппы: эмфизематозный фенотип ХОБЛ  (N=242)  и бронхитический фенотип ХОБЛ (N=269); группа больных с тяжелой ХОБЛ (N=223), включающая больных с IV стадией заболевания по GOLD и осложнениями,  и  ХОБЛ средней тяжести (N=288), которая включала больных со II и III стадиями по GOLD без  осложнений. 
     Группу контроля (N=508) составили практически здоровые индивиды, без патологии дыхательной системы в анамнезе и без профессионального контакта с вредными химическими веществами отобранные по возрасту (57.24±8.55), полу (457 мужчин (89.96%) и 51 женщин (10.04%)),  статусу курения (курильщики и бывшие курильщики - 335 (67.94%) и некурящие – 173 (34.06%)), индекс курения у курильщиков (PY=18.54±8.08). Характеристика больных ХОБЛ и группы сравнения представлена в табл.1.
     От всех участников исследования было получено информированное добровольное согласие на использование биологического материала в планируемых исследованиях. 
     Таблица 1.     
     Характеристика больных ХОБЛ и группы сравнения
     
ХОБЛ (N=511)
Контроль (N=508)
P
     Пол абс. (%)

М
Ж
432 (84.54%)
79 (15.46%)
457 (89.96%)
51 (10.04%)

0.012
Возраст (лет) M±m
62. 74 ± 12.7
55.822±7.22
0.0001
 Индекс массы тела (ИМТ)
25.81±5.92
27.06±3.84
0.05
     Этническая принадлежность: абс. (%)

Татары
Русские
239 (46.77%)
272 (53.23%)
289 (56.89%)
219 (43.11%)
0.002
Статус курения:  абс. (%)
курильщики
некурящие
392 (76.71%)
119 (23.29%)
335 (65.94%)
173 (34.06%)
0.0001
Индекс курения 
(пачка-лет) M±m
для курильщиков
     
44.58±25.92
     
18.54±13.12
0.0001
Индекс курения
(пачка-лет) M±m
с учетом некурящих
25.81±34.15
(от 0 до 200)
12.22±13.81
(от 0 до 98)
0.0001
 Классификация  ХОБЛ  по GOLD
Стадия II
Стадия III
 Стадия IV
149 (29.16%)
139 (27.20%)
223 (43.64%)
-
-
Всего
511
508
-
     Примечание: M – среднее значение, m – средняя ошибка среднего значения.
2.2.Молекулярно-генетические методы исследования
      ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови с использованием фенольно-хлороформной экстракции. Для проведения анализа ассоциации были отобраны следующие полиморфные локусы: XPC (rs2228001, поли (AT)), XRCC1 (rs 25487, rs25489), XRCC3 (rs861539), XPD (rs13181), XPA (rs1800975). Полиморфные локусы XPC (rs2228001, поли (AT)), XRCC1 (rs 25487, rs25489), XRCC3 (rs861539), XPD (rs13181), XPA (rs1800975) анализировали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим расщеплением соответствующими рестриктазами Bst2UI, PvuII, MspI, RsaI, NcoI, PstI, MspI (производство фирмы «СибЭнзим», Россия; “Thermo scientific”, Германия) в условиях, рекомендованных фирмой производителем. ПЦР проводилась   в стандартных условиях на приборе  T100TMThermal Cycler  (Bio-Rad Labora.......................