Методика постановки эксперимента

2.1 Методика постановки эксперимента. Схема проведения исследований. Характеристика объектов исследования

В соответствии с поставленными целью и задачами была разработана следующая схема проведения эксперимента (рис. 1):

1. выделение новых штаммов микроорганизмов из высококачественных мясных продуктов -- сыровяленые и сырокопченые колбасы, микрофлора которых сформирована естественным путем;

2. изучение морфологических, культуральных, физиолого-биохимических, технологических свойств выделенных микроорганизмов;

3. идентификация выделенных штаммов молочнокислых микроорганизмов в соответствии с Международным стандартом на основе анализа нуклеотидных последовательностей 16S рРНК;

4. паспортизация идентифицированных штаммов и их депонирование в ВКПМ ГосНИИГенетика;

5. обоснование использования выделенных штаммов молочнокислых микроорганизмов для биотрансформации вторичного сырья;

6. получение белкового композита на основе говяжьего легкого, биотрансформированного выделенными штаммами молочнокислых микроорганизмов;

7. определение рационального уровня введения белкового композита взамен адекватного количества основного мясного сырья в технологии вареных колбас;

8. изучение целесообразности производства вареных колбас с использованием белкового композита.

Объектами исследований в данной работе являлись:

· выделенные штаммы молочнокислых микроорганизмов Lactobacillus casei 10, Lactobacillus curvatus 1, Pediococcus pentosaceus 28, Pediococcus acidilactici 8;

· белковый композит, полученный на основе вторичного мясного сырья (легкие крупного рогатого скота) и стартовых бактериальных культур;

· вареная колбаса, выработанная с применением белкового композита.

Рисунок 1. Схема проведения исследования

Исследуемые показатели:

1. определение массовой доли влаги;

2. белка;

3. жира;

4. золы;

5. хлорида натрия;

6. остаточного нитрита;

7. влагосвязывающей способности;

8. величины pH;

9. пероксидного числа;

10. углеводов;

11. экстрактивных веществ;

12. структурно-механических свойств;

13. аминокислотного состава;

14. летучих компонентов;

15. количества молочнокислых организмов;

16. энергетической ценности;

17. переваримости;

18. массы продукта;

19. выхода готовой продукции;

20. органолептических показателей.

2.2 Методы исследований

1. Изучение технологических свойств

2. Определение массовой доли влаги

3. Определение массовой доли белка

4. Определение массовой доли жира

5. Определение массовой доли золы

6. Определение массовой доли хлорида натрия

7. Определение массовой доли остаточного нитрита

8. Определение влагосвязывающей способности

9. Определение величины рН

10. Определение пероксидного числа

11. Определение углеводов

12. Определение экстрактивных веществ

13. Определение структурно-механических свойств

14. Определение аминокислотного состава

15. Определение летучих компонентов

16. Определение микробиологических показателей

17. Определение количества молочнокислых микроорганизмов

18. Определение энергетической ценности

19. Определение переваримости

20. Определение массы продукта

21. Определение выхода готовой продукции

22. Определение органолептических показателей

2.2.1 Определение технологических свойств молочнокислых микроорганизмов

Определение предела кислотообразования

Для определения предела кислотообразования молочнокислых бактерий в пробирку с 10 мл стерильного обезжиренного молока вносили одну петлю исследуемого штамма и выдерживали в термостате при оптимальной температуре (37°С) в течение 7 сут., после чего определяли титруемую кислотность, которая характеризует предел кислотообразования штамма.

Определение энергии кислотообразования

Энергию (интенсивность) кислотообразования молочнокислых бактерий определяли по времени образования сгустка молока (кислотность около 58?60°Т) при внесении 0,5 смі молодой (12?20-часовой) культуры в 10 смі стерильного обезжиренного молока и выращивании посевов при оптимальной температуре 37 °C.

Кислотность молока, выраженную в °Т, определяли при титровании 0,1 N NaOH с индикатором фенолфталеином. Для титрования брали 10 смі молока, разбавленного 20 смі дистиллированной воды. Объем щелочи (в смі), пошедший на нейтрализацию кислоты, умножали на 10 (то есть производили перерасчет на 100 смі молока) и получали, таким образом, кислотность молока в °Т (1°Т соответствует 9 мг молочной кислоты в 100 смі молока).

Редукция нитритов

Для выяснения редуцирующей способности нитритов исследуемой культуры проводили следующие реакции.

К свежеприготовленному МПБ добавляли 0,2% калийной селитры (KNO3), свободной от нитритов и разливали по 5 мл в пробирки. Среду стерилизовали при 120 °C в течение 15 мин.

Приготовление реактива. I. Брали 1 г растворимого крахмала на 100 мл кипящей дистиллированной воды и после охлаждения раствора добавляли 0,5 г йодистого калия. П. Готовили 10%-й водный раствор химически чистой серной кислоты.

Растворы I и II смешивали в равных объемах перед постановкой реакции. Срок годности готового реактива -- 15 мин.

Постановка реакции. Через 48?72 часа выдерживания исследуемой культуры в термостате к каждой засеянной пробирке с нитратным бульоном добавляли по 1 мл реактива. При редукции нитратов в нитриты получается темно-синее окрашивание бульонной культуры.

Определение устойчивости к соли

Для определения устойчивости микроорганизмов к различным концентрациям NaCl (2, 4, 6, 8, 10, 12%), проводили посев суточных культур молочнокислых микроорганизмов на среду МРС с соответствующими концентрациями соли. Рост микроорганизмов оценивали визуально.

Определение антагонистической активности по отношению к санитарно-показательной микрофлоре

Для определения антагонистической активности микроорганизмов использовали метод перпендикулярных штрихов. В качестве тест-культур использовали следующие штаммы: Staphylococcus aureus 6538-р (209-р), Stahpylococcus epidermidis 14?990, Staphylococcus saprophiticus 15?305, Escherichia coli 157, Salmonella typhimurium 5715, Shigella sonnae 5063, Proteus vulgaris 14, Proteus mirabilis 47.

2.2.2 Определение содержания влаги (ГОСТ 9793?74)

Содержание влаги определяли методом высушивания при температуре 150 °C в сушильном шкафу. Навеску измельченного продукта (3 г), взвешенную в бюксе с точностью до 0,0002, высушивали в сушильном шкафу при температуре 150 °C в течение 1 часа. После охлаждения бюксы в эксикаторе и взвешивания рассчитывают содержание влаги, но формуле:

,

где (2.2. 1) X -- содержание влаги, %;

M1 -- масса бюкса с песком, стеклянной палочкой и навеской до высушивания, г;

М2 -- масса бюкса с песком, стеклянной палочкой и навеской после высушивания, г;

М -- масса бюкса с песком и стеклянной палочкой после высушивания, г.

2.2.3 Определение содержания белка

Содержание белковых веществ в продукте определяли по количеству белкового азота, который находится по разности между количеством общего и небелкового азота с учетом пересчета азота на белок. Метод определения азота основан на минерализации органических соединений с последующим определением азота по количеству образовавшегося аммиака с дальнейшей его отгонкой в чашках Конвея.

Содержание общего азота рассчитывали, но формуле:

,

где (2.2. 2) X -- содержание общего азота, %;

0,21 -- количество азота, эквивалентное 1 мл 0,015 М раствора гидроксида натрия, израсходованный на титрование контрольного раствора, мл;

V1 -- объем 0,015 М раствора гидроксида натрия, израсходованный на титрование испытуемого раствора, мл;

К -- коэффициент пересчета на точно 0,015 М раствор гидроксида натрия;

m0 -- масса навески, г;

V2 -- объем минерализата, взятый для отгонки аммиака, мл.

2.2.4 Определение содержания жира методом Сокслета

Метод основан на многократной экстракции жира растворителем из подсушенной навески продукта с последующим удалением растворителя и на высушивании жира до постоянной массы. Количества жира вычисляли по формуле:

,

где (2.2. 3) X -- содержание жира, %;

m1 -- масса гильзы с материалом до экстрагирования, г;

m2 -- масса гильзы с материалом после экстрагирования, г;

m0 -- масса навески до высушивания, г.

2.2.5 Определение содержания золы

Общее содержание минеральных веществ может быть определено озолением. Содержание золы определяли ускоренным методом. Для этого использовали раствор ацетата магния, который способствует образованию пористой структуры озоляемого вещества, что обеспечивает лучший доступ кислорода воздуха.

Содержание золы рассчитывали по формуле:

,

где (2.2. 4) X -- содержание золы, %;

m2 -- масса золы, г;

m1 -- масса оксида магнии, полученная после минерализации, г;

m0 -- масса навески, г.

2.2.6 Определение содержания хлорида натрия

Содержание хлорида натрия определяли в водной вытяжке из продукта методом Мора в нейтральной среде. Метод Мора основан на осаждении иона хлора ионом серебра в нейтральной среде в присутствии хромата калия в качестве индикатора, дающего осадок оранжево-красного цвета. Содержание хлорида натрия определяли по формуле:

,

где (2.2. 5) X -- содержание хлорида натрия, %;

0,0029 -- количество хлорида натрия, эквивалентное 1 мл 0,05 М раствора нитрата серебра, г;

К -- коэффициент пересчета на 0,05 М раствор нитрата серебра;

V1 -- объем фильтрата, взятый на титрование, мл;

V2 -- объем 0,05 М раствора нитрата серебра, пошедший на титровани, мл;

m0 -- масса пробы, г.

2.2.7 Определение содержания остаточного нитрита

Метод основан на измерении интенсивности окраски, образующейся при взаимодействии нитрита с сульфаниламидом М-(1-нафтил)-этилендиаминдигидрохлоридом в безбелковом фильтрате. Концентрацию нитрита натрия находят на калибровочном графике по полученной оптической плотности. Интенсивность красной окраски измеряли на спектрофотометре при длине волны 538 нм. Содержание нитрита вычисляли по формуле:

,

где (2.2. 6) X -- содержание нитрита в 100 г продукта, мг;

С -- количество нитрита в 1 мл окрашенного раствора, найденное по калибровочному графику, мкг;

m0 -- масса навески продукта, г;

V -- объем фильтрата, взятый для фотометрического измерения, мл;

1000 -- перевод в мг.

2.2.8 Определение влагосвязывающей способности

Определение влагосвязывающей способности определяли методом прессования. Метод прессования основан на выделении воды испытуемым образцом при легком его прессовании, сорбции выделяющейся воды фильтровальной бумагой и определении количества отделившейся влаги по площади пятна, оставляемого ею на фильтровальной бумаге. Размер влажного пятна вычисляют по разности между общей площадью пятна и площадью пятна, образованного испытуемым образцом. Массовую долю связанной влаги в образце вычисляли по формуле:

,

где (2.2. 7) X1 -- массовая доля связанной влаги в мясном фарше, % к массе мяса;

Х2 -- массовая доля связанной влаги, % к общей влаге;

М -- общая масса влаги в навеске, мг;

S -- площадь влажного пятна, см;

m0 -- масса навески мяса, мг.

2.2.9 Определение величины рН

рН среды определяли потенциометрическим методом в водной вытяжке, приготовленной в соотношении 1: 10, помещали для коагуляции белков. После охлаждения вытяжку фильтровали и измеряли рН.

2.2. 10 Определение пероксидного числа

Для определения пероксидного числа берут 0,5 г навески с точностью до 0,001 г. Навеску помещают в колбу и ставят на водяную баню. Затем приливают 5 мл хлороформа, 5 мл концентрированной уксусной кислоты и 0,25 мл насыщенного раствора иодида калия. Полученное содержимое тщательно перемешивают и ставят на 5 минут в темное место. После этого приливают 50 мл дистиллированной воды и 0,5 мл 1%-го раствора крахмала. Содержимое колбы должно окраситься в синий цвет. Далее проводят титрование тиосульфатом натрия до исчезновения синей окраски.

,

где (2.2. 8) a -- объем тиосульфата натрия, пошедший на титрование образца, мл;

b -- объем тиосульфата натрия, пошедший на титрование реактива, мл;

m -- масса навески, г.

2.2. 11 Определение углеводов

Определение углеводов определяли расчетным методом, если известно количество белка, жира, влаги, экстрактивных веществ (в %) в исследуемом образце: углеводы (%) = 100-белок-жир-влага-экстрактивные вещества.

2.2. 12 Определение экстрактивных веществ

Общий азот можно рассматривать как сумму белкового и небелкового азота. Небелковый азот характеризуется наличием пептидов, свободных аминокислот, аммиака, азотистых соединений. Если из водной вытяжки осадить белки и отфильтровать осадок, в фильтрате можно определить небелковый азот, а в осадке -- азот растворимых белков. Зная содержание общего азота в исследуемом материале и азот в фильтрате, по разнице можно судить о количестве суммарных белков.

Определение экстрактивных веществ определяли следующим образом: 1 г хорошо измельченного образца встряхивают в закрытом сосуде с 20 мл дистиллированной воды. Экстракцию повторяют 3 раза, каждый раз сливая жидкость через фильтр в мерную колбу на 50 мл. Объем водного экстракта доводят до метки и смешивают с равным объемом 20%-ной ТХУ кислотой, выпавший осадок отфильтровывают, промывают 10%-ным раствором той же кислоты. Промыв ведут так, чтобы общий объем фильтрата был равен 100 мл. Минерализуя фильтрат, определяют остаточный азот, минерализуя осадок на фильтре, определяют азот растворимых белков. Для минерализации фильтрата берут 2 мл фильтрата, прибавляют 1 мл 40%-ной H2SO4 и минерализуют до полного обесцвечивания с катализатором (Н2О2 или CuSO4), после этого жидкость охлаждают и количественно переносят в колбу на 25 мл, доводят до метки и перемешивают. Из этого объема берут 5 мл и вносят в мерную колбу на 25 мл, добавляют 1 мл реактива Несслера, доводят до метки и перемешивают. Параллельно готовят контрольную пробу со стандартным раствором, где известна концентрация азота. Для этого в мерную колбу на 25 мл вносят 3 мл стандартного раствора сульфата аммония (NH4)2SO4, прибавляют 1 мл реактива Несслера, доводят водой до метки и перемешивают. Обе колбы оставляют на 10 мин. Для развития окраски, после чего колометрируют на ФЭКе с синим светофильтром.

Количество небелкового азота в мг % вычисляют по формуле:

,

где (2.2. 9) d -- оптическая плотность стандартного раствора;

D -- оптическая плотность пробы;

0,02 -- концентрация азота в 1 мл стандартного раствора (NH4)2SO4, мг;

3 -- объем стандартного раствора, взятого для цветной реакции;

5 -- объем фильтрата, взятого для минерализации;

100 -- перевод в проценты;

V -- разведение при экстракции (V =100)

Н -- навеска пробы, г.

2.2. 13 Определение структурно-механических свойств

Структурно-механические свойства характеризуют поведение продукта в условиях напряженного состояния и позволяют связать между собой напряжении, деформации и скорости деформаций в процессе приложения усилия. По характеру приложения к продукту внешних усилий и вызываемым ими деформациям их можно классифицировать на три группы: сдвиговые, компрессионные, поверхностные.

Определение предельного напряжения сдвига

Определение ПНС производится коническим индентором с углом при вершине б = 60°, движущимся с постоянной скоростью.

Исследуемый помещается в цилиндрическую кювету, устанавливается под траверсой и центрируется под индентором.

В процессе эксперимента определяются усилие пенетрации и глубина погружения конуса.

ПНС определяется по формуле П. А. Ребиндера:

Па,

где (2.2. 10) Р -- усилие пенетрации, Н;

Н -- глубина погружения конуса, м;

Кб -- константа конуса при б = 60°, Kб = 0,214.

Определение работы резания

На специальном устройстве вырезают ровный цилиндрический образец диаметром 10 мм. Полученный образец подвергали срезу с помощью прижимной пластины, имеющей ножевую поверхность с десятью ножевыми лезвиями. Усилие, необходимое для среза образца, передается через тензодатчик и фиксируется в виде пика в компьютерной программе Microsoft Excel, где и автоматически производится расчет работы резания.

Определение пластичности

Определение пластичности проводится по следующей формуле:

смІ/г,

где (2.2. 11) S -- площадь влажного пятна, смІ;

m -- масса навески, г.
.......................