Изучение антиоксидантных свойств экстракта перги

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Южно - Уральский  государственный медицинский университет  Министерства здравоохранения Российской Федерации
кафедра Химии фармацевтического факультета
      
      

      
      
     ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА 
     
     
      ПО СПЕЦИАЛЬНОСТИ «ФАРМАЦИЯ»
     На тему Изучение антиоксидантных свойств экстракта перги 
     
      
      
      
      
     Выполнил:
     Группа     форма обучения  заочная
     Научный руководитель:  к. фарм. н., доцент,
     заведующий  кафедрой Химии фармацевтического
     факультета Симонян Елена Владимировна
      
      
      
      
      
      
      
      
      Челябинск, 2015 год

     ОГЛАВЛЕНИЕ
      
     ВВЕДЕНИЕ...................................................................................................................
     ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................
     1.1. ИСТОРИЯ ОТКРЫТИЯ АНТИОКСИДАНТОВ.................................................
     1.2. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИОКСИДАНТОВ.....................................
     1.2.1.КЛАССИФИКАЦИЯ АНТИОКСИДАНТНОВ …............................................
     1.1.3.МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ АНТИОКСИДАНТОВ..........................................
     1.3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ АНТИОКСИДАНТНОВ....................................
     1.3.1. Фотометрические методы..................................................................................
     1.3.2.Хемилюминесцентные методы…......................................................................
     1.3.3.Флуориметрические методы........................................................................... 
     1.4.Общие сведения о перге................................................................................
     1.4.1. Описание перги...................................................................................
     1.5. Общая характеристика флавоноидов и механизм их антиоксидантных свойств.....
     1.5.1.. Понятие о флавоноидах............................................................................
     1.5.2. Физико-химические свойства флавоноидов......................................
     1.5.3.Антиоксидантная активность флавоноидов.
     1.6. Методы анализа основных биологически активных веществ перги
     1.6.1. Качественные реакции
     1.6.2.Качественные реакции на рутин.
     1.6.3.Количественное определение флавоноидов.
     1.6.3 Хроматография
     1.6.4. Использование спектрофотометрии для идентификации и количественной оценки флавоновых соединений
     ГЛАВА 2Материалы и методы
     Глава 3 ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ ЧАСТЬ
     ВВЕДЕНИЕ
     
     Актуальность. Кислород является сильным окислителем, реакции окисления проходящие с его участием - источник энергии для многих живых организмов. При этом в процессе метаболизма образуются соединения кислорода, которые разрушают структуру и вещества клетки. За счет этого процесса в клетке и во всем организме нарушается обмен веществ. Ролью антиоксидантов является связать и вывести из организма свободные радикалы.
     Антиоксиданты (АО), как вещества тормозящие окисление, нашли широкое применение в химической, пищевой, косметической, фармацевтической промышленности, медицине и сельском хозяйстве. Они являются составной частью всех биологических систем. Свободные радикалы и реакции протекающие с их участием принимают важную роль в этиологии и патогенезе многих заболеваний человека, а также в старении организма в целом.
     В организме имеется собственная система осуществляющая борьбы с излишним количеством свободных радикалов, но она ослабляется под воздействием неблагоприятных факторов окружающей среды. Многие растения содержат вещества, которые проявляют антиоксидантной активностью.
     Важнейшим источником природных АО являются растительное сырье, как лекарственное, так и пищевое. Не малый интерес представляет исследование антиоксидантных свойств не только веществ, выделенных в химически чистом виде, но и неочищенных растительных экстрактов, содержащих в своем составе большое количество компонентов, поскольку сумма их антиоксидантной активности и других полезных свойств часто превосходят таковые индивидуальных соединений (синергизм антиоксидантов).
     В качестве объекта исследования была выбрана перга, которая имеет богатый органических и минеральный  состав. Однако, сведения о ее АО свойствах крайне ограничены и не систематизированы.  
     Поэтому целью настоящей работы было изучение антиоксидантных свойств перги.
     Задачи работы: 
     1. Установить, обладает ли экстракт перги антиоксидантной активностью
     2. Определение содержания в экстракте перги фенольных соединений, а точнее флавоноидов, дубилиных веществ.
     3. . Провести практическую работу по усстановлении АОА перги исходя из ее химического состава.
     4.  Провести подтверждающие ракции на наличие дубильных вещест, флавоноидов.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРА

1.1. ИСТОРИЯ ОТКРЫТИЯ АНТИОКСИДАНТОВ

     Понятие об антиоксидантах впервые  появился в 60-х годах XX в. благодаря исследованиям Б. Н. Тарусова (1954), Н. М. Эмануэля (1963). Б. Н.Тарусов установил роль липидов, особенно ненасыщенных жирных кислот, как одного из основных субстратов биохимических процессов, провел скрининг радиозащитного влияния цистеина, глутатиона, тиомочевины. Н. М. Эмануэль и его ученики смогли не только определили механизм действия антиоксидантов, но также дали точное определение антиоксидантов как соединений, подавляющих развитие свободнорадикального окисления.
     После установления того что антиоксидантные вещества это те вещества которые сами легко окисляются, были изучены возможные механизмы их действия.
     В первые идея применять антиоксиданты в лечении некоторых болезней пришла к отечественным биохимикам, искавшим средство, помогающее справиться с последствиями лучевой болезни. В результате были получены результаты, что антиоксиданты играют важную роль в нормальной жизнедеятельности здоровой клетки, являясь универсальными регуляторами состава, структуры и активности мембран клеток. Антиоксиданты природного и синтетического происхождения начали применять в онкологии, кардиологии, неврологии.
     В СССР отечественные антиоксиданты появились в начале 1980-х годов в ГУ НИИ Фармакологии РАМН, где Л.Д. Смирновым и В.И. Кузьминым был синтезирован новый препарат - сукцинат 2-этил-6-метил-3-оксипиридина (Мексидол), и под руководством академика РАМН А.В. Вальдмана были выявлены его фармакологические эффекты, проведены исследования механизма действия (С.Б. Середенин, Т.А. Воронина, А.В. Еременко и др.), выполнены доклинические исследования по токсикологии (Б.И. Любимов) и фармакокинетике (А.К. Сариев, В.П. Жердев), проведены первые клинические испытания и внедрение препарата в медицинскую практику. (З.А. Суслина, Г.Г. Незнамов, А.И. Федин, С.А. Румянцева, А.Л. Верткин, В.И. Шмырев). 
      
      
     1.2.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИОКСИДАНТОВ
      
     Антиоксиданты – это соединения, уменьшающие интенсивность свободнорадикального окисления, нейтрализующие свободные радикалы с помощью обмена своего атома водорода на кислород свободных радикалов. Антиоксиданты могут быть природногои синтетического происхождения имея в своем строении подвижный атом водорода в связи с наличием в молекуле нестойкой связи с углеродом (С–Н) или серой (S–Н). При их взаимодействии со свободными радикалами возникают малоактивные радикалы самого антиоксиданта, не способные к продолжению цепи.
     Свободные радикалы - это аномальные молекулы, имеющие неспаренный электрон на последнем энергетическом уровне, который делает их крайне нестабильными. В этом состоянии свободные радикалы ловят уязвимые протеины, ферменты, липиды и даже целые клетки. Они стремятся к тому, чтобы забрать недостающий электрон у одной из молекул клетки организма. Если это происходит, нарушается внутриклеточный бaлaнс, происходит моментальная цепная реакция, и в ослабленную клетку проникают миллиарды новых разрушителей здоровья – свободных радикалов. Свободные радикалы начинают проявлять активность при воздействии солнечного ультрафиолетового излучения. Зaбирая электрон у молекулы, они инактивируют клетки, тем самым нарушая хрупкий химический баланс.[2]
      
      
      
      
      
      
     1.2.1.КЛАССИФИКАЦИЯ АНТИОКСИДАНТНОВ 
     Таблица 1.

     Группа
     
     Представители
     Высокомолекулярные соединения
ферменты антиоксидантной защиты, белки, способные связывать ионы Fe и Cu, являющиеся катализаторами свободнорадикальных процессов. Антиоксидантные ферменты (супероксиддисмутаза (СОД), церулоплазмин, каталаза, глутатионзависимые ферменты) 
     Низкомолекулярные антиоксиданты
     аминокислоты, полиамины, мочевина, мочевая кислота, глутатион, аскорбиновая кислота, билирубин, ?-токоферол, витамины группы A, K, P.
     Классификация антиоксидантов, являющихся по происхождению лекарственными препаратами:
     Субстраты свободнорадикального окисления
     препараты ненасыщенных жирных кислот.
     Природные антиоксиданты
     препараты аминокислот, белков, нуклеиновых кислот и их производных, которые реагируют с продуктами свободнорадикального окисления.
     Биоантиоксиданты 
     препараты витаминов, гормонов, флавоноидов.
     Модуляторы свободнорадикального окисления 
     препараты, содержащие микроэлементы.
     
     1.2.2МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ АНТИОКСИДАНТОВ
     Окисление углеводородов, спиртов, кислот, жиров кислородом воздуха представляет собой цепной процесс. Цепные реакции преврaщений осуществляются с участием активных свободных радикалов— перекисных (RO2*), алкоксильных (RO*), алкильных (R*). При образовании свободных радикалов, при рaспaде промежуточных продуктов (гидроперекисей и др), увеличивается скорость цепных разветвленных реакций окисления.
     Механизм антиоксидантного действия наиболее распространённых соединений  (ароматические aмины, фенолы(C6H5OH), нaфтолы(C10H(8-n)(ОН)n, где n = 1, 2, 3 и более)) состоит в обрыве реакционных цепей: молекулы антиоксиданта взаимодействуют с активными радикалами с обрaзованием малоактивных рaдикалов. Процесс окисления замедляется в присутствии веществ, разрушающих гидроперекиси. Следовательно скорость образования свободных радикалов понижается. Дaже в небольшом количестве (0,01—0,001%) антиоксиданты уменьшают скорость окисления, поэтому в течение некоторого времени (период торможения, индукции) продукты окисления не обнаруживаются. [3]
      
     Таблица 2. Классификация антиокидантов по механизму действия
      
     Группа
     Представитель
     Антирадикальные ингибиторы 
     препараты, содержащие полифенолы 
     Препараты антиоксидантов, которые разрушают пероксиды
     серосодержащие соединения
     Препараты, связывающие катализаторы свободнорадикальных процессов
     ионы металлов переменной валентности.
     Лекарственные препараты, которые инактивируют синглетный кислород
     витаминные препараты (токоферолы, каротиноиды и др.).
      
      
     1.3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ АНТИОКСИДАНТОВ
      
     1.3.1. Фотометрические методы 
     В основе колориметрического метода  определение общей антиокислительной активности (ТАС) лежит окислении кроцина. Он состоит в том, что каждую лунку планшеты пипетируют по 100 мкл кроцина и 50 мкл испытуемого образца, разведенного в фосфатном буфере. Реакция сопровождается добавлением 100 мкл предварительно подогретого до 37 °С раствора 2,2?-азобис-(2-амидинопропан) гидрохлорида (ААРН, 5 мг/мл) и окисление кроцина проводится инкубацией планшеты во влажном термостате при 37 °С в течение 60–75 минут. Контрольные лунки, содержащие кроцин,образцы и фосфатный буфер (по 100, 50 и 100 мкл соответственно), инкубируются параллельно. После инкубирования измеряется оптическая плотность при 450 нм. Специфическое поглощение определяется по формуле:
     100 ? (D0 – Daoa)/D0, 
     где D0 – поглощение в отсутствии антиоксидантов; Daoa – поглощение в присутствии антиоксидантов. Определение антиокислительной активности по методу ТАС основано на оценке общего восстановительного эффекта индивидуальных низкомолекулярных антиоксидантов, как гидрофильных, так и гидрофобных. Оно дает информацию о типах антиоксидантов и их концентрациях без точного качественного различия. 
     Метод ТАС основан на оценке общего восстановительного эффекта низкомолекулярных антиоксидантов. При проведении донного метода возможно установить какой тип антиоксиданта и в какой концентрации присудствует в образце.
Эти методы основаны на изменения окраски, отнесенной к стандартному соединению – Trolox (водорастворимый аналог витамина Е (6-гидрокси-2,5,7,8- тетраметилхроман-2-карбоновая кислота)). 
     Фотоколориметрический метод.
     В основе метода лежит фотоколориметрия железотиацианатных комплексов [6]
     Методика: испытуемы образец смешивают с 0,12 мл метанола, 2,88 мл 2,51% раствора линолевой кислоты в 80%-ном этаноле и доводят объем смеси 40 мМ фосфатным буфером (рН = 7,0) до 12 мл. Затем смесь инкубируют при 40 °С, оставляют на некоторое время, после чего определяют концентрации гидропероксидов по железотиацианатному методу. Метод заключается в том, что к аликвоте смеси добавляют по 0,2 мл раствора 20 мМ FeCl2 и 30% NH4CNS и измеряют оптическую плотность при 500 нм.7
     Одним из способов оценки АОА [8] является колориметрия свободных радикалов, основанная на реакции DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (C18H12N5O6, M = 394,33), растворенного в метаноле, с образцом антиоксиданта (АН) по схеме: 
     DPPH* + AH ? DPPH-H + A*
     Результатом является восстановления DPPH антиоксидантом снижается пурпурно-синяя окраска DPPH в метаноле, а реакция контролируется по изменению оптической плотности при 514 нм обычными методами спектрофотометрии.
     Так же применяют методы: по восстановлению антиоксидантами железа: (ferric reducing/antioxidant power-FRAP) [11] – определение низкомолекулярных антиоксидантов. При низких рН восстановление Fe(III)-трипиридилтриазинового комплекса в Fe(II)-комплекс сопровождается появлением интенсивной голубой окраски. Измерения основаны на способности антиоксидантов подавлять окислительный эффект реакционных частиц, генерируемых в реакционной смеси.
     
     1.3.2.Хемилюминесцентные методы 
     Хемилюминесцентное определение антиокислительной активности, использует способность люминола давать свечение после взаимодействия со свободными радикалами. Свободные радикалы в системе генерируются постоянно в результате инициируемого теплом распада 2,2?-азобис-(2-амидинопропан) дигидрохлорида (ААРН).
     Показано, что экспериментальные кривые ФХЛ описываются достаточно точно для следующей совокупности реакций (в скобках – константы скоростей, М-1 х с -1):
      hv + RH ? R* + O2 – (2,3?10-4 с -1); 
     RH + * O2 – ? R* + H2O2 (1000); 
     RH ? … (0,005 с -1); *
      O2 – + * O2 – ? … . + фотон (2?105 ); 
     SOD + *O2 – ? SOD + H2O2= (1?108 ); 
     ASC + O2 – ? … (2?107 ). 
     Здесь RH – рибофлавин, *O2 – – супероксидный радикал; R* – радикал рибофлавина; SOD – супероксиддисмутаза; ASC – аскорбат. 
      
     1.3.3.Флуориметрические методы 
     Метод определения адсорбционной емкости по отношению к кислородным радикалам («Oxygen Radical Absorption Capacity»-ORAC) [17] является одним из наиболее применяемых в настоящее время. Он был первоначально разработан доктором Гохуа Као (Dr. Guohua Cao) в Национальном нституте старения (США) в 1992 г. В 1996 г доктор Као объединился с доктором Рональдом Прайером (R. Prior) в совместную группу в Исследовательском центре старения USDA (администрации по контролю за лекарственными средствами США), где был создан полуавтоматический метод [18]. С тех пор автоматизированный метод интенсивно применялся при исследованиях антиоксидантов и окислительного стресса [19–21]. Метод основан на измерении интенсивности флуоресценции определенного соединения и ее изменении от времени протекания реакции. В присутствии соединений, связывающих кислородные радикалы, увеличивается время флуоресценции вследствие защитного действия антиокислителей. Количественное определение антиокислительной активности (АОА) осуществляется по площади между двумя кривыми – свободной реакции и с добавлением антиоксидантов 
     Первоначально в качестве флуоресцирующего вещества применялся белок В-фикоэритрин. Однако оказалось, что он вступает в реакцию с фенольными соединениями, являющимися главными антиоксидантами растительного происхождения, что приводило к систематически заниженным результатам определения АОА. Поэтому на фирме Brunswick Laboratories впервые применили другое, более стабильное, флуоресцирующее соединение – флуоресцеин. Метод, основанный на поглощении кислородных радикалов (ORAC), – относительно простой и чувствительный, но длительный по времени (около 95 мин на определение) и требует наличия флуоресцентного детектора. В этой системе 2,2?-азо-бис-(2-амидинопропан) дигидрохлорид (ААРН, см. рис. 1) используется в качестве источника перекисных радикалов. Указанным методом (ORAC) может быть определена антиокислительная активность как водорастворимых, так и жирорастворимых объектов, таких как пищевые продукты, напитки, химикаты, добавки, плазма и сыворотка крови, моча.
     Метод Гуо и Янга [22] основан на определении антиокислительной активности соединений по их способности связывать гидрокси-радикалы НО. , которые, как полагают, являются наиболее реакционноспособными в физиологических условиях и ответственными за множество нежелательных в организме последствий, таких как онкогенез, атеросклероз и мутации ДНК. В модельной системе, предложенной авторами, генерация гидроксил-ионов протекает из кислорода при участии комплексов железа с этилендиаминтетрауксусной кислотой (EDTA) по следующей схеме: 
     Fe+2-EDTA + O2 ? Fe+3-EDTA + O2 .– 2O2 .– + 2H+ ? H2O2 + O2 Fe+2-EDTA + O2 .- + 2H+ ? Fe+3-EDTA + H2O2 Fe+2-EDTA + H2O2 ? Fe+3-EDTA + OH- + • OH ( ko). 
     Добавления перекиси водорода в этом случае не требуется. Образованные радикалы НО. взаимодействуют с терефталевой кислотой (ТР) с образованием флуоресцирующей 2-гидрокситерефталевой кислоты (НО-ТР): ТР + •OH ? HO-TP (k1). С этой реакцией может конкурировать реакция связывания гидрокси-радикалов антиоксидантами: антиоксиданты + • OH ? продукты (k2). 
      
     1.3.4.Электрохимические методы 
     При помощи этого метода определяют сумму антиоксидантной активности природных и синтетических соединений. Методика состоит в кулонометрическом титровании общего количества антиоксидантов в объектах электрогенерированным бромом. По полученным результатам титрования рассчитывают величину бромной антиоксидантной способности, мерой которой служит количество электричества в кулонах, отнесенных к 100 г (100 мл) образца (И.Ф.Абдуллин, Е.Н.Турова, Г.К.Будников. Кулонометрическая оценка антиоксидантной способности экстрактов чая электрогенерированным бромом. (1)
     Основным недостатком метода является то, что он позволяет исследовать лишь водорастворимые формы антиоксидантов и те из них, которые реагируют с бромом. Кроме того, для исследований требуется не менее 100 г (100 мл) исследуемого образца.
    
     1.4.Общие сведения о перге
     1.4.1. Описание перги.
     Перга - это цветочная пыльца, которую после сбора пчелы утрамбовывают в соты и заливают медом. В отсутствие воздуха и в условиях повышенной влажности на пыльцу начинают воздействовать ферменты, содержащиеся в меде и пчелиной слюне. В результате химических реакций пыльца начинает бродить и выделять молочную кислоту. Кислота, в свою очередь, начинает действовать как консервант пыльцы, защищая ее от воздействия бактерий и грибков. Получающееся в результате всех этих взаимодействий вещество и называют пергой. Пергу исследуем на следующие показатели: массовую долю воска, флавоноидных соединений, окисляемость, механические примеси.
     
     1.4.2. Химический состав перги.
     
     Перга содержет: моносахариды, 16 заменимых и незаменимых аминокислот (глютаминовая, лейцин, аспарагиновая, серин, аланин, треонин, глицин, изолейцин, валин, пролин, тирозин, лизин, фенилаланин, аргинин, гистидин, метионин), 13 жирных кислот (линолевая (Омега-6), линоленовая (Омега-3), миристолеиновая, миристиновая, олеиновая, пальмитиновая, пальмитолеиновая, арахидоновая и др.), каротиноиды (предшественники витамина А),витамины (Е, С, D, P (рутин), К, B1, B2, B3, B6), макро- и микроэлементы (калий, магний, фосфор, марганец, железо, медь, цинк, хром, йод, кобальт и др.), органические кислоты, ферменты, белки 20,3-21,7, сахара 24,4-34,7, соединения и гормоноподобные вещества. В перге обнаружено высокое содержание фенольных соединений, проявляющие биологическую активность, а конкретно флавоноиды. Антиоксидантные свойства флавоноидов имеют более широкий спектр, чем у таких антиоксидантов, как витамины С и Е, цинк и селен. Комплекс биофлавоноидов (рутин, кверцитин, антоцианы, катехины и др.) образует витамин Р, восстанавливающий аскорбиновую кислоту. Комплекс флавоноиды + аскорбиновая кислота положительно влияет на стенки капилляров укрепляя их и уменьшая проницаемость. (10).
     
     Органолептические и физико-химические показатели перги, соответствующие требованиям ТУ 10 РФ 505-92
     Показатели
     Нормы
     Внешний вид
     Мелкие неравномерные комочки
     Вкус
     Кисло-сладкий, слегка горьковатый
     Запах
     Характерный медово-пыльцовый
     Консистенция
     Мягкорыхлые, легко распадающиеся комочки
     Цвет
     От тёмно-желтоватого до коричневого
     Концентрация водородных ионов (pH) 2-%-го водного раствора перги, не менее
     3,7
     Массовая доля влаги, %, не более
     15
     Массовая доля воска, %, не более
     5
     Массовая доля механических примесей, %, не более
     0,1
     Массовая доля сырого протеина, %, не менее
     20
     Массовая доля флавоноидных соединений, %, не менее
     2,3
     Окисляемость, с, не более
     2,0
     Поражённость плесенью
     не допускается
      

     1.4.3. СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ И ХРАНЕНИЯ ПЕРГИ.
     
     Известны следующие технологии заготовки и преработки перги на предприятиях и пасеках:
1. Включает стадии: сушка, подмораживание, скарификация сот, дробление и отделение воска веянием..
Получают частички перги в виде многогранников, повторяющих форму ячеек. Затем подсушенную пергу фасуют и отпускают в подсушенном виде, либо перерабатывают. На стадии замораживания и сушки идет частично потеря полезных свойств.
2. Второй способ более "сберегающий". Способ заготовки перги пчелиной - вырезают пергу из перговых сот, пропускаю пергу через мясорубку, смешивают с мёдом. Готовят смесь мёда и перги в разных пропорциях (от 50% до 20% перги). Смесь выстаивается несколько дней, за это время к поверхности поднимаются восковые частицы, они удаляются. Полученная смесь содержит пергу, некоторое количество воска, прополиса и мёд. Эта смесь оптимальна в качестве биодобавки к пище. Срок хранения в холодильнике не менее 2,5 лет.(4)
      Пчелиная перга в продаже бывает трех видов:
     1)Перга в сотах - натуральный продукт,  не подверженный никаким обработкам. .
2)Перговая паста, представляет собой перемолотые механическим способом соты.
3)Гранулированная перга - самая ценная и практичная в использовании. На вид она похожа на шестигранную призму. Главное преимущество такой перги в том, что она очищена от побочных продуктов и состав ее остается первоначальным и неизменным.

Хранение перги.

1. Хранение перги в сотах.  Хранят в сухом помещении (влажность не более 70%), при температуре 8—10° C . Помещение не должно иметь посторонних запахов и доступа в него грызунов, насекомых-вредителей и пчёл. Для предохранения сотов с пергой от восковой моли, помещение ставят открытые ёмкости с уксусной кислотой 75%-ной концентрации из расчёта 5-10 гр. кислоты на кубометр помещения.
2.  Хранение сухой перги осуществляются в сухом помещении, не рекомендуется хранить  вхолодильнике, высокая влажность может привести к появлению плесени.
      
     1.5. Общая характеристика флавоноидов и механизм их антиоксидантных свойств.
     1.5.1. Понятие о флавоноидах.
     Флавоноидами называется многочисленная группа природных биологически активных соединений, в строении которых лежит скелет, состоящий из двух бензольных колец (А и В), соединенных между собой трехуглеродной цепочкой (пропановый мостик) – С6-С3-С6. С помощью  пропанового мостика в большинстве флавоноидов образуется гетероцикл, являющийся производным пирана или гамма-пирона с атомом кислорода в кольце. Большее количество флавоноидов можно рассматривать как производные 2-фенилхромана (флавана) или 2-фенилхромона (флавона).
     1.5.2. Физико-химические свойства флавоноидов
     В чистом виде флавоноиды представлены в виде кристаллических соединений, бесцветных (изофлавоны, катехины, лейкоантоцианидины, флаванонолы, флаваноны), желтые(флавоны, флавонолы, халконы, ауроны), а также окрашенных в красный, синий или фиолетовый цвета (антоцианидины). Без запаха, горького вкуса, с определенной температурой плавления. [2]
     В зависимости от рН среды: в кислой среде они имеют оттенки красного или розового цветов; в щелочной - синего.
     НАЙТИ Флавоноиды перги
     1.5.3.Антиоксидантная активность флавоноидов.найти источник
     Одним из основных свойств флавоноидов является оказание антиоксидантной активности, что лежит в основе подавления действия АФК (активная форма кислорода) при инфекциях, воспалении, ожогах или лучевом поражении.
     Реакция взаимодействия флавоноидов с АФК характеризуется высокими скоростями, составляющими для OH-радикала – 5х108 М-1 с-1 , для перокисного радикала липидов – 0,18х108 М-1 с-1  (кверцетин), несколько ниже для супероксид аниона – 4х104 М-1 с-1 (катехин).
     Флавоноиды способны необратимо окисляются до п-гидрохиноновой формы, которая после обратимо может окисляться до п-хинона. П-хинона полимеризуется в не растворимое соединение. Окисление флавоноидов протекает под действием ионов тяжелых металлов и света. Промежуточные формы окисления флавноидов могут являться токсичными для клеток, а в процессе их взаимопревращения в ряде случаев образуются АФК (рис. 1).
      
     Рис.1 Окислительно-восстановительные превращения кверцетина 
     Не смотря на это, флавоноиды считают одними из наиболее значимых антиоксидантов, антиоксидантная активность которых возрастает в присутствии аскорбиновой кислоты. Высокой антиоксидантной активности флавоноидов, может быть их ингибирующая активность ряда ферментов, включая гидролазы, например фосфолипазы, оксидоредуктазы, например избирательно ингибируют COX1 или COX2, связанные с воспалительным и репарационным ответами соответственно, ДНК-синтетазы, РНК-полимеразы, фосфатазы, фосфокиназы, оксигеназы, и оксидазы аминокислот. В некоторых случаях, тип ингибирования конкурентный, но чаще это аллостерическое ингибирование. Многие флавоноиды также способны ингибировать цАМФ и цГМФ фосфодиестеразы, в результате чего увеличивается уровень цАМФ, участвующего в различных каскадах. Наиболее важными для антирадикальной активности структурные элементы молекул флавоноидов: 
     1) две ОН-группы в положениях СЗ' и С4', 
     2) двойная связь между 2 и 3 атомами углерода, желательно совместно с карбонильной группой в положении С4 и 
     3) ОН-группы в положениях СЗ и С5 совместно с карбонильной группой .
     В молекулах флавоноидов ОН-группа в положении С4' представляет собой наиболее удобную мишень для радикальной атаки, при этом наличие ОН-групп у соседнего атома углерода СЗ' (катехоловая структура) или СЗ' и С5' (галловая структура) облегчает отрыв атома водорода. Между соседними гидроксилами кольца В образуются водородные связи, поэтому соединения, имеющие такие структуры, характеризуются низким окислительным потенциалом и относительно легко образуют радикалы. Кроме того, присутствие opтo-дигидроксильной структуры приводит к большей делокализации неспаренного электрона и повышает стабильность феноксилыюго радикала . Синтезированные на структурной основе флавона соединения, не содержащие ОН-групп в В-кольце, не проявляли существенной антиоксидантной активности в отношении окисления липидных липосом при индукции ионами Fe2+, Fe3+ и 2,2'-азобис(2-амидинопропан)дигидрохлоридом. Катехоловые структуры также эффективно связывают ионы металлов переменной валентности, препятствуя тем самым их вовлечению в реакции разложения гидроперекисей. Прежде всего это касается катехоловых структур В-кольца, однако при Fe +- и Ре3+-индуцированном окислении, так же, как в отношении ОН-радикалов в реакции Фентона и пероксинитрита, выраженный ингибирующий эффект дают соединения, содержащие ОН-группы в положениях С7 и С8 или С5 и С6 [5, 17, 40]. Замена ОН-групп в положениях С5, С7 или СЗ на O-D-глюкозу приводила к снижению способности флавоноидов ингибировать перекисные и ОН-радикалы, а также ONOO-.
     Важность двойной связи С2-СЗ для антиоксидантного действия флавоноидов,  определяется образованием диеновой структуры между атомом кислорода в положении С4 и электронной структурой В-кольца, что приводит к делокализации электронной плотности по всей молекуле при образовании радикала. В ходе экспериминтального исследования было установлено, что несколько большее смещение в область С-кольца спиновой плотности неспаренного электрона в радикале кверцетина, имеющем ненасыщенную связь С2-СЗ, по сравнению с аналогичным по структуре радикалом таксифолина, у которого эта связь одинарна. Кроме того, наличие двойной С2-СЗ-связи ограничивает подвижность В-кольца и способствует формированию планарной структуры молекулы, что важно для ингибирования ферментативной продукции АКМ, в частности, в ксантин-ксантиноксидазной реакции.
      
     1.6. Методы анализа основных биологически активных веществ экстракта перги
     1.6.1. Качественные реакции на флавоноиды.
     1. Реакция с хлоридом железа (III). При взаимодействии флавоноидов с хлоридом железа (III) флавонолы (рутин, кверцетин, кемпферол) образуют комплексы, окрашенные в зеленый цвет, а флаваноны (дигидрофлавоны) — комплексы, окрашенные в коричневый цвет.
     Коричнево-зеленую окраску дают экстракты, имеющие в своем составе широкий спектр флавоноидов. Черное окрашивание с кратковременным появлением зеленого связано с присутствием дубильных веществ, содержание которых значительно превосходит содержание флавоноидов. Для лучшего наблюдения за окрашиванием сухие, густые и непрозрачные экстракты необходимо разбавлять в 10–50 раз. Взаимодействие карбонильной группы флавоноидов со свободным водородом приводит к образованию насыщенного пиранового цикла, который под действием соляной кислоты превращается в оксониевые соединения, имеющие окраску от оранжевого до красно-фиолетового цвета.
     2. Общей реакцией на флавоноидные соединения является цианидиновая (проба Шинода). Проводимая с помощью концентрированной соляной кислоты и металлического магния. Действие водорода в момент выделения приводит к восстановлению карбонильной группы и образованию ненасыщенного пиранового цикла, который под действием соляной кислоты превращается в оксониевое соединение, имеющее окраску от оранжевой (флавоны) до красно-фиолетовой (флаваноны, флавонолы, флаванонолы). 
      
      
     Изменение условий восстановления путем замены магния на цинк приводит к изменению окраски. При использовании цинка положительную реакцию дают флавонолы и флавонол-3-гликозиды, а флаваноны не обнаруживают ее.
     3.С борно-лимонным реактивом 5-оксифлавоны и 5-оксифлавонолы образуют (с борной кислотой в присутствии лимонной (щавелевой) кислоты) комплекс ярко-желтой окраски с желто-зеленой флуоресценцией:
      
     4. С треххлористой или с пятихлористой сурьмой в 4-хлористом углероде флавоноиды дают красное или оранжевое окрашивание. 
     Это объясняется тем, что SbCl5 и SbCl3 - кислоты льюисовского типа, которые и вызывают галохромизм подобный реакции с конц. Н2SO4. Халконы дают красное или красно-синее окрашивание, флавоны – оранжевое
     .
     5. С раствором аммиака флавоны, флаваноны, флавонолы, флаванонолы дают оранжевое окрашивание; халконы и ауроны образуют пурпурно-красное окрашивание; антоцианы - синее, фиолетовое; катехины окрашивания не дают.
     6. Со средним ацетатом свинца дают осадки флавоноиды, имеющие в  кольце ортодиоксигруппу.  Флавоны, флавонолы образуют оранжевый осадок, ауроны - красный, антоцианы - красный и синий.
     7. Со щелочью катехины образуют желтые или красные продукты вследствие наличия небольших продуктов окисления. Флаваноны образуют на холоду бесцветные или слабо-желтоватые растворы, но затем в силу изомеризации в халконы появляется ярко- желтая или красная окраски. Халконы и ауроны сразу же образуют красные растворы.
     
     8. Флавоны и флавонолы растворяются в концентрированной Н2SO4 с образованием интенсивно-желтых растворов, которые содержат оксониевые (флавиливые) соли.
     9. При растворении флаванонов в серной кислоте появляются ярко-оранжевые или малиновые окраски. При этом образуются соли соответствующих халконов.
     10. Халконы, ауроны и флавоны дают с концентрированной серной кислотой малиновую окраску.
     11. Присутствие фенольных гидроксилов и карбонильной группы позволяет флавоноидам образовывать комплексы с солями металлов различной степени устойчивости, вступать в реакции с диазосоединениями с образованием азокрасителей [6,11].
      
     1.6.2.Качественные реакции на рутин.
1. При добавлении к спиртовому раствору рутина ацетата свинца выделяются желтые игольчатые кристаллы.
2. К 1 мл раствора, содержащего 0,005 г рутина, прибавляют 2 мл 10%-ного водного раствора нитрита натрия, 0,5 мл 50%-ной серной кислоты, 25 мл 1 н. раствора карбоната калия и 100 мл воды, Появляется красно-коричневое окрашивание.
     3. К 5 мл раствора рутина прибавляют 2 мл 10%-ного раствора молибдата аммония и воды до 100 мл. Появляется лимонно-желтое окрашивание.
     
     1.6.3.Количественное определение флавоноидов.
     1.6.3 Хроматография.
     Для количественного определения флавоновых соединений соединений используют различные виды храмотографий.
     Хроматография (от греч. chroma, chromatos - цвет, краска), физико-химический метод разделения и анализа смесей, основанный на распределении их компонентов между двумя фазами - неподвижной и подвижной (элюент), протекающей через неподвижную. Хроматографический анализ является критерием однородности вещества: если каким-либо хроматографическим способом анализируемое вещество не разделилось, то его считают однородным (без примесей). Принципиальным отличием хроматографических методов от других физико-химических методов анализа является возможность разделения близких по свойствам веществ [1].
     1) Бумажная хроматография
     С целью обнаружения флавоноидов в растительном сырье широко используется бумажная и тонкослойная хроматография. Обнаруживают вещества на хроматограммах после их просматривания в УФ-свете. При этом флавоны, флавонол-3-гликозиды, фла.......................