Формирование гидрогелевых скаффолдов с использованием природных и синтетических фотосенсибилизаторов

Волгоградский государственный университет

Институт математики и информационных технологий



Кафедра лазерной физики



МАМЕДОВА ВИКТОРИЯ НАСИБОВНА



«ФОРМИРОВАНИЕ ГИДРОГЕЛЕВЫХ СКАФФОЛДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПРИРОДНЫХ И СИНТЕТИЧЕСКИХ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ»


Выпускная квалификационная работа

по направлению

13.03.05 «Лазерная техника и лазерные

технологии»



Научный руководитель:

к. ф.-м.н., старший научный сотрудник ИФТ РАН ФНИЦ «КРИСТАЛЛОГРАФИЯ И ФОТОНИКА» РАН

_________________ Е.В.Хайдуков

РАБОТА ДОПУЩЕНА К ЗАЩИТЕ Зав. Кафедрой лазерной физики, к.ф.-м. н.,доцент

_________________ В.Н. Храмов Протокол заседания кафедры №____от «____» ________2018г.



Волгоград, 2018

Содержание

ВВЕДЕНИЕ ..................................................................................................................
3
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР .....................................................................................
5
1.1.
Тканевая инженерия.........................................................................................
5
1.2.
Методы формирования скаффолдов ..............................................................
6
1.2.1. Микромолдинг ...........................................................................................
6
1.2.2. Лазерная стереолитография .....................................................................
7
1.2.3. Электроспиннинг ......................................................................................
7
1.2.4. Селективное лазерное спекание ............................................................
10
1.2.5. Струйная трехмерная печать..................................................................
11
1.2.6. Антисольвентная печать .........................................................................
11
1.2.7. Двухфотонная полимеризация ...............................................................
11
1.2.8. Полимеризация с помощью апконвертирующих частиц ....................
12
1.3.
Материалы для формирования скаффолдов ................................................
12
1.3.1. Гидрогели .................................................................................................
12
1.3.2. Биосовместимые полимеры ...................................................................
13
1.3.3.Фотоинициатор .........................................................................................
15
2. ЭКСПЕРЕМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ .....................................................................
17
2.1.
Прямое лазерное рисование ..........................................................................
17
2.2.
Стереолитография ..........................................................................................
17
2.3.
Исследование  зависимости  высоты  гидрогелевого  скаффолда  от  дозы
лазерного излучения .............................................................................................
18
2.4.
Электроспиннинг ...........................................................................................
19
2.5.
Перфорация скаффолдов ...............................................................................
20
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ......................................................................
22
3.1.
Создание композиций ....................................................................................
22
3.2.
Изготовление скаффолдов .............................................................................
22
ЗАКЛЮЧЕНИЕ .....................................................................................................
30
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ .................................................
31

2


ВВЕДЕНИЕ

    Прогресс в медицине привел к увеличению продолжительности жизни человека. Вместе с тем, возрастает количество различных заболеваний. Для решения проблем, возникающих с утратой или деградацией тканей и органов, в последние годы активно используются технологии регенеративной медицины, основанные на достижениях современной тканевой инженерии.

    Одним из современных подходов для замены и восстановления поврежденных тканей является их замещение тканеинженерной конструкцией (ТИК) состоящей из живых клеток и биологически активных веществ, помещенных внутри трехмерного матрикса, называемого скаффолдом [10]. Основная функция скаффолда заключается в формировании механического каркаса, обеспечивающего пролиферацию и свободную миграцию клеток.

Такие структуры должны одновременно удовлетворять физико-химическим

и биологическим требованиям, например, по скорости биодеградации и по адгезии поверхности определенных типов клеток [19]. Биологически стабильные материалы, даже если они являются биосовместимыми, не всегда могут полностью интегрироваться в единое целое с тканями. Поэтому используемые полимеры должны быть биосовместимыми, а продукты их распада не токсичными. Кроме того, они не должны вызывать иммунных реакций при введении в ткани. Скорость биодеградации скаффолда необходимо контролировать в зависимости от скорости синтеза новой ткани на месте устраняемого дефекта.

    Наиболее перспективными биосовместимыми материалами являются гидрогели на основе коллагена, хитозана, гиалуроновой кислоты и других эндогенных полимеров. Их использование позволяет создавать скаффолды в наибольшей степени соответствующие предъявляемым требованиям.

    Целью данной работы является создание биосовместимых скаффолдов на основе модифицированной гиалуроновой кислоты и коллагена, формируемых методами прямого лазерного рисования, лазерной стереолитографии с

3

использованием хлорина P6 в качестве фотосенсибилизатора и электроспиннинга.

В работе поставлены следующие задачи:

1. Создание фотоотверждаемых композиций (ФОК).

2. Изготовление структурированных скаффолдов с помощью метода прямого лазерного рисования.

3. Формирование биосовместимых трехмерных гидрогелевых скаффолдов методом лазерной стереолитографии.

4. Исследование зависимости высоты гидрогелевого скаффолда от дозы лазерного излучения.

5. Изготовление скаффолдов методом электроспиннинга и определение оптимальных способов их перфорации.










































4

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

     В литературном обзоре рассмотрены основные аспекты современной тканевой инженерии, материалы и методы изготовления скаффолдов,

преимущества и недостатки различных подходов к созданию биосовместимых гидрогелевых скаффолдов.

1.1. Тканевая инженерия

     Тканевая инженерия – это междисциплинарная область, которая использует методы инженерных и биологических наук для восстановления, сохранения или улучшения поврежденных органов [19]. Одним из современных подходов для замены поврежденных тканей является их замещение на ТИК, сформированных на основе биосовместимого скаффолда с клетками, который имплантируется пациенту. Такая ТИК обладает способностью адаптироваться к различным физиологическим условиям в организме. В результате происходит формирование новой ткани в пространстве скаффолда в соответствии с заложенной генетической информацией.

    Кинетика биодеградации скаффолда должна позволять высеянным клеткам пролиферировать и секретировать их собственный внеклеточный матрикс на этапе нахождения в биореакторе. В это время полимерная матрица постепенно исчезает, оставляя достаточно места для новых клеток и роста ткани. Физическая поддержка трехмерной матрицы имеет существенное значение только до тех пор, пока новообразованная ткань не будет обладать достаточной механической целостностью для самоподдержания. После этого она может быть имплантирована в организм.

    Таким образом, ТИК должны удовлетворять совокупности различных физических и биохимическим требований [25–28]:

1. биосовместимость, не токсичность и отсутствие неблагоприятных иммунных реакций;

2. способность к биологическому разложению с контролируемой скоростью деградации;

5

3. скаффолды должны обладать взаимосвязанной пористой структурой для роста клеток, транспорта питательных веществ и отвода продуктов их жизнедеятельности;

4. обеспечение адгезии клеток к поверхности ТИК;

5. механические  параметры  матриц  должны  быть  близки  к  механическим

параметрам ткани, в которую они имплантируются.

1.2. Методы формирования скаффолдов

     В настоящее время существует множество методов для создания полимерных структур с заданной архитектурой, обеспечивающих требуемую скорость формирования. Далее представлено краткое описание и характеристика основных технологий перспективных для формирования скаффолдов.
1.2.1. Микромолдинг

     Этот метод является универсальным и позволяет создавать скаффолды с одинаковой геометрией. Для начала необходимо изготовить силиконовую мастер-форму, в которую затем помещается способная к фотоотверждению композиция. Мастер-форма накрывается стеклом, через которое производится экспонирование УФ-излучением. После этого сборка разделяется и на стекле остается сшитая структура зеркально повторяющая рисунок мастер-формы [29]. Схематическое изображение процесса представлено на рисунке 1.1.














Рис. 1. 1. Схематическое изображение метода микромолдинга: силиконовая мастер-форма (А); наполнение мастер-формы способной к фотоотверждению композицией (Б); экспонирование УФ-излучением через стекло (В); готовый скаффолд (Г).


6

1.2.2. Лазерная стереолитография

    Лазерная стереолитография (SLA) в настоящее время одна из самых распространённых методик быстрого прототипирования. Трехмерная структура строится на платформе, погруженной в фотоотверждаемую композицию (ФОК) путем экспонирования лазерного излучения. После формирования первого слоя платформа опускается, тем самым давая возможность ФОК заполнить пространство поверх первого слоя, после чего так же при помощи лазерного излучения формируется второй слой. Процесс повторяется многократно до завершения, после чего образец промывается [9].




















Рис.1.2. Схематическое представление получения гидрогелевых

скаффолдов методом SLA.

     Этот метод позволяет за короткий промежуток времени изготавливать трехмерные модели заданной архитектуры. Среди других преимуществ лазерной стереолитографии можно выделить возможность построения моделей сложной формы и структуры, высокую точность и прочность модели [9].

1.2.3. Электроспиннинг

     Электроспиннинг – это способ получения волокон в результате действия электростатического напряжения (примерно: 10-25 кВ) на полимерный раствор, который подается из капилляра под давлением. Высокое напряжение индуцирует
в растворе полимера одноименные электрические заряды, которые, в результате




7

кулоновского электростатического взаимодействия, приводят к вытягиванию раствора полимера в тонкую струю (рис.1.3.).





















Рис.1.3.Схематическое представление получения волокон полимеров методом электроспиннинга.

 В результате струя формируется в виде «конуса Тейлора» (рис.1.4.). Это выступ на заряженной поверхности жидкости, образующийся на нелинейной стадии реализации ее неустойчивости, с вершины которого идет сброс избыточного заряда путем эмиссии высокодисперсных сильно заряженных капель [30].














Рис. 1.4. Образование конуса Тейлора при

формировании первичной струи [1].

В процессе вытягивания полимерная струя может претерпевать ряд последовательных расщеплений на более тонкие струи при определенном соотношении значений вязкости. Полученные струи отвердевают за счет испарения растворителя или в результате охлаждения, превращаясь в волокна, и



8

под действием электростатических сил дрейфуют к заземленной подложке, имеющей противоположное значение электрического потенциала [1].

Условия существования первичной струи

     Впервые условия существования стационарной струи были отчетливо сформулированы и найдены в работе [3]. Ее авторы предложили для этого две взаимно дополняющие приближенные теоретические модели. В первой из них капельная ньютоновская жидкость с плотностью ?, вязкостью ?, относительной диэлектрической проницаемостью ? и удельной объемной электропроводностью

? вытекает с объемным расходом Q из нижнего конца вертикально расположенного металлического капиллярного сопла внешним радиусом rс в пространство с однородным внешним электрическим полем напряженностью Е.

Достигнув некоторого максимального объема Vk, капли жидкости будут отрываться от капилляра с периодом:
=
Vk
,
(1)






1
Q






Если  пренебречь  противодействующими  электрической  и  капиллярной


силами, а для силы вязкости принять приближение Стокса, то уравнение движения капли будет иметь вид:
m(
dU
) = mg – ar ?U, U(0) = 0 ,
(2)
dt	с
где U - скорость капли, m - ее масса и а - константа порядка ?. Тогда при ? > 0,1
Па·с, r  < 2 мм и t1>10?3с скорость капли можно считать стационарной, а для
с


времени жизни перемычки получается выражение:

t2 = rk = arkrс? ,
(3)
U
mg



где rk – радиус капли максимального объема Vk (в сферическом приближении). Непрерывная стационарная струя устанавливается, когда это время равно периоду отрыва капель, т.е. они не успевают разделиться. Составив баланс сил на нижнем срезе сопла - электрической (4), гравитационной (5) и поверхностной

(6):
F

= =
9
2r
2
(4)


э









16
k











9







F
=
4
?r 3?g
(5)



3



г


k


Fп = 2??rс,
(6)


при соблюдении которого наступает отрыв капли, можно получить следующую систему уравнений, описывающих условия перехода капельного течения в стационарную струю:

Fэ +Fг= Fп
(7)
t1= t2

Таким  образом,  в  первой  теоретической  модели,
кроме  коэффициента

поверхностного натяжения, плотности и вязкости жидкости, учитывается влияние ее объемной удельной электропроводности и относительной диэлектрической проницаемости.

     Метод позволяет получать полимерные волокна диаметром порядка нескольких сотен нанометров [2] как с хаотичным, так и с ориентированным распределением [4]. Ориентированная структура дает возможность задавать

направление роста клеток, что особенно важно при работе с мышечной или

нервной тканью. Кроме того, этот метод позволяет создавать структуры со структурой, схожей с архитектурой костной ткани, что указывает на перспективы его использования в восстановлении кости [4]. К основным достоинствам метода можно отнести значительную пористость получаемых скаффолдов, улучшенные физико-механические свойства, возможность варьирования толщины волокна. Этот метод широко применяется в современных исследованиях для создания искусственных сухожилий [5], восстановления нервной ткани [6], получения сосудистых имплантатов [7] и регенерации кости [8].

1.2.4. Селективное лазерное спекание

    В основе создания трехмерных структур лежит использование лазерного излучения для нагрева и спекания частиц порошка. На подложку наносится слой порошка, затем лазерное излучение фокусируется на этом слое при этом происходит выборочное спекание частиц порошка, попадающих под лазерное

10

воздействие. Не спеченный порошок остаётся на своём месте и служит поддерживающим материалом. После этого подложка опускается на толщину следующего слоя, который наносится специальным валиком поверх первого слоя. Такая технология носит название селективное лазерное спекание (СЛС), то есть технология лазерного спекания порошкообразных материалов. Последующая обработка готовой матрицы может включать в себя удаление неспеченных частиц, чтобы добиться микропористости внутри структуры [9].

1.2.5. Струйная трехмерная печать

    Исходное вещество представлено в виде порошка. Однако в отличие от селективного лазерного спекания, порошок склеивается при помощи специального связующего вещества. При этом головка принтера ходит над распределённым на одном уровне порошком и селективно наносит адгезивное вещество, склеивая вместе частицы. Окружающий порошок становится поддерживающим материалом [9].

1.2.6. Антисольвентная печать

В данном   методе   твердый   полимер,   формирующий   скаффолд,

смешивается с растворителем и используется для послойного создания объекта по цифровой 3D-модели. При этом печать происходит в воде. Растворитель выбирается таким образом, чтобы, попадая в воду растворенный полимер затвердевал. После завершения процедуры 3D-печати образцы отделяются от побочных продуктов реакции промыванием в дистиллированной воде. Для завершения процесса образцы помещаются в термостат [11].

написать, что послойное формирование структуры происходит с помощью выдавливания растворенного полимера через сопло. При попадании в воду растворитель выходит в воду из полимера и происходит отверждение (растворитель подбирается таким образом, чтобы он мог выходить в воду из раствора полимера как можно быстрее)

1.2.7. Двухфотонная полимеризация

Главной	особенностью	двухфотонной	полимеризации	(2PP)	является

использование	светочувствительного	гидрогеля	для	создания	трехмерных

11

структур. Оно требует для полимеризации поглощения сразу двух фотонов. Такой процесс является маловероятным, поэтому для того чтобы оно произошло необходима высокая интенсивность лазерного излучения. Для построения трехмерных структур в таком гидрогеле используется фемтосекундный лазер, фокусировка луча которого управляется зеркалами с прецизионной системой позиционирования [12].

       1.2.8. Полимеризация с помощью апконвертирующих частиц ыфасывпмвпива

1.3. Материалы для формирования скаффолдов

     В тканевой инженерии матрицы ТИК формируются на основе биодеградируемых и биосовместимых материалов. Скаффолды должны обеспечивать необходимую механическую прочность в процессе хирургической операции и на начальном постоперационном этапе. Затем в процессе резорбции ТИК происходит замещение материала скаффолда собственной тканью пациента. Таким образом, не возникает необходимости повторной операции для
ее удаления [26].

1.3.1. Гидрогели

     Гидрогели представляют собой сшитые сетки, способные удерживать большое количество жидкости, а также легко реагировать на незначительные изменения внешних параметров [14]. В настоящее время они активно используются в качестве мембран для разделения растворенных веществ и скаффолдов в тканевой инженерии [15]. Гидрогелевые скаффолды способны обеспечивать механические характеристики близкие к свойствам живой ткани и служить трехмерным каркасом, на чьей поверхности и внутри которого клетки

определенных типов могут свободно мигрировать, эффективно дифференцироваться и пролиферировать [16]. В качестве материалов для создания гидрогелей используются фотоотверждаемых композиций (ФОК). Фотоотверждаемой называется композиция, состоящая из природных или



12

синтетических полимеров, растворителя и фотоинициатора или фотосенсибилизатора.

      Основными методами формирования тканеинженерных гидрогелевых скаффолдов являются методы, основанные на процессах полимеризации ФОК. К их числу можно отнести описанные выше лазерную стереолитографию [17], двухфотонную полимеризацию [12] и микромолдинг [18]. Механические свойства формируемых материалов и структур, а также скорость их биодеградации можно контролировать, варьируя состав исходной ФОК. Наиболее часто используемыми полимерами являются биосовместимые производные акрилатов и метакрилатов полиэтилен гликоля (ПЭГ) [20–23] и производные гиалуроновой кислоты (ГК) [12].

              1.3.2. Биосовместимые полимеры Гиалуроновая кислота

     ГК относится к группе полисахаридов, синтезируемых клетками большинства живых организмов и является важным компонентом кожи, мышц, нервов и других тканей человека. Она является природным, биосовместимым и биодеградируемым линейным полисахаридом, состоящим из повторяющихся неразветвленных звеньев глюкуроновой кислоты и N-ацетилглюкозамина (рис.1.5) [12].













Рис.1.5. Структурная формула гиалуроновой кислоты.

За счет межмолекулярного взаимодействия длинные гибкие молекулы ГК

в водных растворах способны образовывать трехмерную структуру. Дисперсный матрикс образует канальцы для селективной диффузии водорастворимых молекул. В макромолекуле регулярно повторяются гидрофобные области,

13

способствующие взаимодействию с клеточными мембранами и белками гидрофобного типа. Это свойство растворов ГК имеет большое значение для обеспечения подвижности клеток.

     Для получения производных ГК, способных к фотосшиванию под действием света, были разработаны способы химической модификации метакрилатными производными. В частности, введение метакрилатных групп в состав ГК может быть осуществлено путем модификации ГК глицидилметакрилатом в результате чего образуется глицидил метакрилат гиалуроновой кислоты (ГК-ГМА). Таким образом, была разработана методика модификации натриевой соли гиалуроновой кислоты соединением, содержащим двойную связь (рис.1.6.) Поэтому она представляет особый интерес как материал для применений в регенеративной медицине.


















Рис.1.6. Структурная формула ГК-ГМА.

     Полученный полимер, содержащий двойные связи, которые могут раскрываться под действием света, является основой для получения гидрогелей в присутствии сшивающего агента, такого как полиэтиленгликоль диакрилат (ПЭГ-ДА). Физико-химические и механические свойства таких гидрогелей можно регулировать путем изменения в изначальной композиции концентрации сшивающего агента ПЭГ-ДА и условий фотополимеризации [1].

Коллаген

     Коллаген - один из наиболее распространенных природных материалов, на основе которых получают скаффолды. Это фибриллярный белок (рис.1.7.),

14

составляющий основу соединительной ткани организма и обеспечивающий ее прочность, и эластичность.














Рис.1.7. Структурная схема коллагена.

Он биосовместим, имеет очень слабую иммуногенность и является хорошим субстратом для всех типов клеток. Это обусловило его широкое применение в медицине. Структура коллагена в настоящее время хорошо известна. Продуктом денатурации коллагена является желатин.

1.3.3.Фотоинициатор

     Для получения гидрогелей с помощью фотополимеризации необходимо присутствие фотоинициатора или фотосенсибилизатора в композиции. Одним из таких является рибофлавин-мононуклеотид (ФМН) (рис.1.8.) [25]. Он растворим

в воде и является витамином, что стимулирует рост и развитие клеток, оказывает метаболическое действие. Полосы поглощения ФМН лежат в УФ и видимой областях спектра.



















Рис.1.8. Структурная формула рибофлавина- мононуклеотида.




15

Однако фотосшивание композиций с его помощью происходит медленно, что является существенным недостатком. Альтернативой может выступать хлорин P6, который является производным хлорофилла. Спектр поглощения содержит характерную полосу в области 405 нм [13]. С его помощью возможно увеличение скорости полимеризации и сечения поглощения, тем самым позволяя применить метод прямого лазерного рисования и лазерной стереолитографии для формирования гидрогелевых скаффолдов.

Фотоотверждаемые композиции (ФОК)

     ФОК представляет собой водный раствор полимера, который при экспонировании светом переходит в состояние гидрогеля. Процесс, который при этом происходит, называется желированием. При формировании скаффолдов на основе сшитых гидрогелей необходимо контролировать свойства набухания материала в водной среде. С одной стороны, скаффолд должен впитывать в себя жидкие продукты жизнедеятельности клеток, снижая отечность, но в то же время набухание скаффолда не должна быть чрезмерным, чтобы жидкость не смогла разорвать сшитый гидрогель. Коэффициент набухания рассчитывается по следующей формуле:
SWR(%)=(Ws-Wd) /Wd   ?100%
(8)

Где Ws - масса образца, сорбировавшего воду, а Wd – масса образца, высушенного

с помощью лиофильной сушки. Так, в частности, сшитая ГК-ГМА имеет коэффициент набухания порядка 2500 %, что приводит к чрезмерному впитыванию жидкости вплоть до разрушения скаффолда. Поэтому, для уменьшения коэффициента набухания сшитых гидрогелей в их состав должен вводиться сшивающий агент, например, ПЭГ-ДА, позволяющий снизить SWR

примерно в 5 раз.












16

2. ЭКСПЕРЕМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Прямое лазерное рисование

     Установка прямого лазерного рисования состоит из лазерного модуля с длиной волны 405 нм и мощностью излучения 22 мВт, диафрагмы, сканаторной системы, фокусной линзы и подвижного столика в 3 координатах (рис.2.1.).























Рис.2.1. Схема и фотография установки прямого лазерного рисования: 1 - лазерный модуль, 2 - диафрагма, 3- система из двух перпендикулярно расположенных зеркал, 4 - фокусная линза, 5- столик.

Работа данной установки происходит следующим образом: на компьютере с помощью программы Ldesigner редактор 5.0 осуществляется дизайн будущих структур. Далее происходит юстировка лазерного пучка и задается положение нуля. Затем заранее подготовленную ФОК помещают на подвижный столик и задают количество проходов этой структуры для достижения оптимальной дозы.
2.2. Стереолитография

     При формировании скаффолда методом стереолитографии используется установка на рисунке.2.1. На столик 5 помещается резервуар с ФОК и неподвижное стекло на опоре. Движение по оси Z происходит таким образом, что стекло покрывается ФОК на 300 мкм. Заранее подготовленный дизайн скаффолда проецируется на стекло формируя 1 слой, затем происходит подъем резервуара с ФОК на 300 мкм и формируются последующий слой. Процесс

17

повторяется многократно до завершения, после чего образец промывается в растворе дистиллированной воды.

     Модуль Юнга является важной характеристикой гидрогелевого скаффолда потому что СТАТЬЯ. Различная концентрация ГК-ГМА, ПЭГ-ДА и ГК-ГМА с ПЭГ-ДА дает возможность управлять модулем Юнга (рис.2.2.) [24].
























Рис.2.2. График зависимости модуля юнга гидрогеля от концентрации макромолекул в изначальной ФОК.

2.3. Исследование зависимости высоты гидрогелевого скаффолда от дозы лазерного излучения

     Объемные характеристики формируемого гидрогелевого скаффолда определяются составом исходного вещества и свойствами лазерного излучения.

В ходе экспериментов варьируемыми параметрами экспонирования были интенсивность и длительность излучение, исследовалась зависимость высоты желированного слоя от дозы. Доза лазерного излучения W определяется формулой (9).
=

?   ,
(9)


2    2









где - мощность лазерного излучения, - диаметр лазерного пучка, - время воздействия лазера.

Для исследования использовался лазер с длиной волны 405 нм, мощностью

излучения 22 мВт и ФОК на основе ПЭГ-ДА с хлорином Р6. С помощью лазера

18

формировался сшитый гидрогель. Зависимость высоты получаемого гидрогелевого слоя от дозы лазерного излучения приведена на рисунке 2.3.




























Рис.2.3. График зависимости высоты скаффолда от дозы.

     На рисунке видно, что зависимость имеет монотонный близкий к линейному характер, что позволяет подбирать параметры лазерного излучения, требуемые для формирования гидрогелевых скаффолдов с необходимыми объемными характеристиками.

2.4. Электроспиннинг

     Приготовленный раствор коллагена в гексафторизопропаноле был помещен в 5 мл шприц с диаметром иглы 1 мм (рис.2.5).

















Рис.2.5. Рабочая установка для электроспиннинга.

19

Скорость подачи полимера составляла 2 мл/ч, напряжение между остриём иглы и катодом, представляющим собой металлическую фольгу, составляло 10-20 кВ. Расстояние от конца иглы до заземлённого коллектора варьировалось в диапазоне 7-23 см.

2.5. Перфорация скаффолдов

     Благодаря перфорации клетки могут проникать вглубь конструкций. Перфорация осуществлялась с помощью Nd: YAG лазера, волоконного лазера и микроигл [31]. Nd: YAG лазер (рис.2.6.) имеет длину волны 1064 нм, длительностью импульса 5 нс, Е= 100 мкДж с частотой 20 Гц.

















Рис.2.6. Фотография Nd: YAG лазера для перфорации скаффолдов.

Волоконный лазер (рис.2.7.) имеет длину волны 1120 нм.





























20






























  Рис. 2.7. Фото волоконного лазера для перфорации скаффолдов. Микроиглы - это простой и безоперационный способ борьбы против

морщин, шрамов и других неровностей кожного покрова [31]. Размеры игл зависят от их материала и варьируются в пределах 300-2000 мкм. Этим простым способом можно создавать перфорацию в скаффолдах различной толщины.

















Рис.2.8. Фото микроигл.










21

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

                     3.1. Создание композиций Композиции с ГК-ГМА:

     Первым этапом происходит создание композиций, на основе которых получают нужные структуры. Экспериментальным методом были подобраны оптимальные параметры для 2 композиций:

     1) ФОК содержит хлорин P6 (0,01%) растворенный в воде (29,99%) с добавлением ПЭГ-ДА 575 (70%). Смешивание проходит в ультразвуковой ванне

в течение 10 минут и после с добавлением ПЭГ-ДА 575 15 минут до полного смешивания. Этот раствор служит для определения нужных параметров, и для прорабатывания структуры скаффолда.

     2) ФОК содержит модифицированную гиалуроновою кислоту (16%) с добавлением ПЭГ-ДА 575 (5%) и хлорин P6 (0.01%), растворенный в воде (79%).

Смешивание проходило в ультразвуковой ванне в течение часа до полного растворения гиалуроновой кислоты.

Композиции с коллагеном:

     Предварительно коллаген был растворен в уксусной кислоте. Для удаления растворителя исходный раствор высушивался с помощью сублимационной сушки. В качестве полимерного раствора для электроспиннинга использовался 10% раствор коллагена в гексафторизопропаноле. Смешивание проходило в ультразвуковой ванне в течение 30 минут.

                   3.2. Изготовление скаффолдов Метод прямого лазерного рисования

     Поскольку количество ГК-ГМА ограничено первичные исследования новых архитектур скаффолдов происходят с использованием композиции 1) описанной выше. На рисунке 3.1. изображены фотографии 5 образцов гидрогелевых скаффолдов на основе композиции 1), изготовленных при количестве проходов 150, при скорости сканирования лазера 100 мм/с.




22











1)	2)














3)	4)















5)

Рис. 3.1. Фотографии 5 образцов гидрогелевых скаффолдов. На всех

фотографиях цена деления шкалы 1 мм.



Для образца 1) общее время полимеризации составило 03:56 мин, для образца 2)

– 04:40 мин, для образца 3) – 03:26 мин, для образца 4) – 04:21 мин, для образца

5) – 05:36 мин.











23













1)	2)














3)

Рис. 3.2. Фотографии 3 образцов гидрогелевых скаффолдов. На всех

фотографиях цена деления шкалы 1 мм.

     На рисунке 3.2. приведены фотографии 3 гидрогелевых скаффолдов на основе композиции 2). Для образца 1) общее время полимеризации составило 04:40 мин, для образца 2) – 04:21 мин, для образца 3) – 05:36 мин.

     Наблюдается сильное искажение структуры скаффолдов, что вызвано не правильными условиями эксперимента. Определение оптимальных параметров лазерного излучения и состава композиции для правильного структурирования гидрогелевых скаффолдов методом прямого лазерного рисования требует дальнейших исследований.

Метод стереолитографии

     Для формирования трехмерной структуры скаффолда состоящей из 5 слоев использовался метод лазерной стереолитографии. На рисунке 3.3. приведена фотография изготовленного гидрогелевого скаффолда.






24





















Рис. 3.3. Фотография скаффолда изготовленного с помощью метода лазерной стереолитографии. Цена деления шкалы 1 мм.

     Для формирования скаффолда (рис.3.3.) использовалась скорость сканирования лазера 50 мм/с при количестве проходов на один слой 150. Расстояние между слоями составило 300 мкм. На этом рисунке структура скаффолда слабо искажена, что говорит о корректности подобранных параметров лазерного излучения и композиции.


Электроспиннинг волокон

Образец 1

     Для данного образца раствор для электроспининнга был взят в соотношении 2 мг сухого коллагена на 10 мкл растворителя. Напряжение составляло 14-16 кВ, а расстояние между острием иглы и катодом 15 см. На рисунке 3.4 приведена фотография структуры скаффолда образца 1, полученная

с помощью оптического микроскопа. Размер волокна составляет приблизительно 3 мкм.











25






















Рис. 3.4. Фотография структуры образца 1 полученная с помощью оптического микроскопа. Цена деления шкалы 5 мкм. Образец 2

     Для образца 2 был взят раствор в соотношении 2 мг сухого коллагена на 14 мкл растворителя. Напряжение составляло 19-23 кВ, а расстояние между острием иглы и катодом 21 см. На рисунке 3.5 приведена фотография структуры скаффолда образца 2, полученная с помощью оптического микроскопа. Размер волокна составляет около 1 мкм.























Рис.3.5. Фотография структуры образца 2 полученная с помощью оптического микроскопа. Цена деления данной шкалы 5 мкм.

26

Образец 3

Для образца 3 раствор был взят в соотношении 2 мг сухого коллагена на 9

мкл растворителя. Напряжение составляло 16-18 кВ, а расстояние между иглой

и катодом 17 см. На рисунке 3.5 приведена фотография структуры скаффолда образца 3, полученная с помощью оптического микроскопа. Размер волокна составляет приблизительно 5 мкм.





















Рис. 3. 6. Фотография структуры образца 3 полученная с помощью оптического микроскопа. Цена деления шкалы 5 мкм.

     На рисунках 3.4-3.6 видно, что созданные скаффолды представляют собой хаотическую пористую структуру, внутри которой возможно транспортирование питательных веществ. Однако для внедрения клеток в такой скаффолд необходимо создать вакантные места. Для этого используются различные методы перфорирования.

     Образцы были перфорированы с помощью Nd: YAG и волоконного лазеров. Исследования показали, что для любых допустимых параметров лазерного излучения граница созданного вакантного места оказывается обугленной. Это препятствует транспортировке питательных веществ к находящейся там клетке. На рисунке 3.7. приведены фотографии перфорированных лазерами скаффолдов.





27














а)	б)
















в)

Рис.3.7. Перфорированные лазером скаффолды.

     Образцы также перфорировались с помощью микроигл. Диаметр острия микроигл составлял 50 мкм. Ролик с микроиглами и результат перфорации приведены на рисунке 3.8.

















Рис.3.8. Фотография перфорированного скаффолда с помощью микроигл. Эксперименты  показали,  что  такой  простой  способ  перфорации  является наиболее удобным, а размеры вакантных мест примерно соот.......................