Влияние старения на механизмы ишемической толерантности почки у крыс

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования
«Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова»
Министерства здравоохранения Российской Федерации
(ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России)

Медико-биологический факультет
Кафедра биохимии

Дипломная работа
по специальности 30.05.01 (060601) «Медицинская биохимия»

Андрианова Надежда Владимировна

Тема: Влияние старения на механизмы ишемической                     толерантности почки у крыс


Работа выполнена:
НИИ Физико-Химической Биологии имени А.Н.Белозерского МГУ
Научный руководитель:
Титов Б.В., к.м.н., ассистент кафедры молекулярной биологии и медицинской биотехнологии	
Научный консультант:
Янкаускас С.С., к.б.н., н.с. лаборатории структуры и функций митохондрий НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского МГУ


Москва 2017 г.
СОДЕРЖАНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ	2
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ	3
1. ВВЕДЕНИЕ	5
2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР	10
2.1 Ишемическое ОПП	10
2.1.1 Изменения на клеточном уровне	11
2.1.2 Изменения на органном уровне	15
2.1.3 Изменения на функциональном уровне	18
2.1.4 Восстановление после повреждения	18
2.2 Ишемическое прекондиционирование	20
2.3 Изменения в структуре и функциях почки при старении	24
2.4 Процессы аутофагии	25
2.4.1 Аутофагия и ОПП	26
2.4.2 Аутофагия и старение	28
2.5 Процессы ацетилирования	29
2.5.1 Ацетилирование и ОПП	30
2.5.2 Ацетилирование и старение	31
2.6 Связь ацетилирования белков и аутофагии	31
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ	33
3.1 Используемые реактивы	33
3.2 Лабораторные животные	33
3.3 Экспериментальная модель	34
3.4 Оценка тяжести ОПП	35
3.5 Определение уровня ацетилирования белков почки	35
3.6 Оценка количества лизосом и аутофаголизосом	36
3.7 Статистическая обработка	37
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ	38
4.1 Оценка почечной функции после И/Р и И/Р с предварительным ИПК	38
4.2 Исследование уровня ацетилирования белков	47
4.3 Исследование количества лизосом и аутофаголизосом	59
4.4 Заключение	65
ВЫВОДЫ	67
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ	68
БЛАГОДАРНОСТИ	81





СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АМФ – аденозинмонофосфат
АДФ – аденозиндифосфат
АТФ – аденозинтрифосфат
АФК – активные формы кислорода
БСА – бычий сывороточный альбумин
ИЛ – интерлейкин
И/Р – ишемия/реперфузия
ОПП – острое почечное повреждение
НАД – никотинамидадениндинуклеотид
ПНПМ – пора неспецифической проницаемости митохондрий
СКФ – скорость клубочковой фильтрации
ФНО-? – фактор некроза опухоли-альфа
AMPK – 5'-АМФ-активируемая протеинкиназа
Atg – ген, связанный с аутофагией
BAD - Bcl-2-ассоциированный белок смерти
BAX – Bcl-2-ассоциированный белок Х
Bcl-2 – белок 2 В-клеточной лимфомы
CD – кластер дифференцировки
DMEM – Дальбеко модифицированная среда Игла
GSK-3? – 3?-изоформа киназы гликогенсинтазы
eNOS – эндотелиальная NO–синтаза
HAT – гистоновая ацетилтрансфераза
HBO1 – гистоновая ацетилтрансфераза, связывающая комплекс узнавания ориджина-1 
HDAC – гистоновая деацетилаза 
HIF – фактор, индуцируемый гипоксией
Hsp – белок теплового шока
Ig – иммуноглобулин
JADE1S – ген апоптоза и дифференцировки-1
JAK – Янус-киназа 
KDIGO – улучшение глобальных результатов лечения заболеваний почек
Kim–1 – молекула повреждения почек–1
L-FABP – белок, связывающий жирные кислоты, печеночная форма
MDRD – изменение диеты при почечных заболеваниях
MHC – главный комплекс гистосовместимости
mTOR – мишень рапамицина у млекопитающих
mTORC1 – комплекс 1 мишень рапамицина у млекопитающих
NGAL – липокалин, ассоциированный с желатиназой
PARL – пресенилин-ассоциированный ромбоидоподобный белок
PBS – фосфатно-солевой буфер
PI3K – фосфоинозитид-3-киназа
PINK1 – PTEN-индуцируемая киназа 1
RISK – reperfusion injury salvage kinase
SAFE – survivor activating factor enhancement
SIRT – сиртуин
STAT – сигнальный трансдуктор и активатор транскрипции 
TCR – Т-клеточный рецептор
ULK1 – UNC51-подобная киназа
UT – транспортер мочевины 
1. ВВЕДЕНИЕ
     Острое почечное повреждение (ОПП) определяют как потенциально обратимое острое прекращение жизнеобеспечивающей функции почек, сопровождающееся нарушениями водно-электролитного, азот-выделительного и кислотно-щелочного гомеостаза у прежде здоровых людей [36].  
     Наибольшая частота встречаемости ОПП наблюдается у больных в критическом состоянии и ассоциируется у данной категории людей с очень высокой летальностью [34]. В целом, смертность зависит от этиологии и тяжести ОПП, характера основной и сопутствующей патологии, возраста больных, от особенностей организма, например, наличия или отсутствия ожирения. Фактором риска является такие сопутствующие патологии как сахарный диабет, сердечно-сосудистые заболевания, хронические заболевания печени, опухоли, проведенные хирургические вмешательства. Также риск развития ОПП повышается при синдроме длительного сдавления, уменьшении объема циркулирующей крови и при уже ранее случавшемся почечном повреждении [15].
     Согласно последним международным рекомендациям по Улучшению Глобальных Результатов Лечения Заболеваний Почек (Kidney Disease: Improving Global Outcomes - KDIGO), ОПП – это состояние, влияющее на структуру и функцию почек, при котором наблюдается одно или несколько из следующих явлений [118]: 
     • Повышение креатинина сыворотки на ? 0,3 мг/дл (? 26,5 мкмоль/л) в течение 48 часов; 
     • Повышение креатинина сыворотки более чем в 1,5 раза по сравнению с исходным уровнем (если это известно, или предполагается, что это произошло в течение предшествующих 7 дней); 
     • Объем мочи <0,5 мл/кг/час за 6 часов.
     Заболеваемость ОПП в общей популяции, по разным оценкам, составляет 3000-5000 человек на миллион населения [22]. То есть ежегодно с этим состоянием сталкиваются 13,3 миллиона человек, и умирает 1,7 миллиона [16].
     ОПП признается одним из самых серьезных осложнений у госпитализированных людей: с ним сталкивается 21% больных [22, 192]. Чаще всего данное состояние наблюдается у пациентов в палатах интенсивной терапии, там встречаемость составляет 32%, а смертность достигает 27% [26]. 
     Особый интерес представляют пожилые пациенты. Средний возраст развития ОПП в развитых странах составляет 64 года, и возраст пациентов с данной патологией постоянно увеличивается [22]. По крайней мере две трети больных уже переступают рубеж 65 лет, когда сталкиваются с почечным повреждением. По сравнению с молодыми людьми, пожилые пациенты обладают большим риском развития ОПП, более высокой смертностью и более длительным периодом восстановления [13]. В том числе, пожилым чаще назначают лекарственные препараты, токсичные для почечной ткани, а также они чаще прибегают к хирургической помощи [24].
      Некоторые авторы предполагают, что почечная ткань в пожилом возрасте уже не может считаться интактной, т.к. со старением наблюдается структурные, функциональные и молекулярные изменения, что уменьшает физиологический резерв и увеличивает восприимчивость к повреждению [24]. Происходит ряд изменений, включающих в себя уменьшение количества функционирующих гломерул, уменьшение скорости клубочковой фильтрации и почечного кровотока, ухудшение вазодилатации и выработки оксида азота. Также сопутствующие заболевания, такие, как сердечная недостаточность, гипертоническая болезнь, сахарный диабет, ассоциированы с хроническим ухудшением функции почек. Поэтому, по сравнению с молодыми людьми, пожилые больше подвержены развитию ОПП, и более легкое воздействие способно вызвать повреждение почки [9]. Почечная ткань у таких пациентов легче повреждается и хуже восстанавливается [24].
     Чаще всего ОПП является следствием таких состояний как сепсис, сердечная недостаточность, острый инфаркт миокарда, пневмония, а также часто встречается в постоперационном периоде [192]. В зависимости от механизма уменьшения фильтрационного давления в клубочках, выделяют три формы ОПП: преренальную, ренальную и постренальную. Преренальная форма встречается чаще всего, примерно в 40-70% случаев. Она возникает при уменьшении давления крови в приносящей артериоле, что может быть вызвано уменьшением сердечного выброса, потерей крови, обезвоживанием, системной вазодилатацией, стенозом или тромбозом почечной артерии [36]. Данная форма ассоциирована с гипоперфузией ткани, и, в случае сильного падения кровотока, возникает состояние ишемии, которое при восстановлении кровотока сменяется состоянием реперфузии [3]. 
     Ренальная форма связана с непосредственным повреждением почечной ткани. Она может быть вызвана ишемией, нефротоксическими веществами, миоглобинурией при рабдомиолизе или гемоглобинурией при гемолизе, а также при воспалительных заболевания почек, сепсисе, обширных травмах, операциях на сердце или при пересадке почки. На ренальную форму приходится 25-40% случаев. Самая малая доля встречаемости принадлежит постренальной форме, на нее приходится лишь 5% случаев. Основная причина - обструкция мочевыводящих путей, которая может быть следствием поражения мочевого пузыря, уретры или мочеточников [36].
     В отличие от внутреннего поражения почки, своевременная реверсия преренальных и постренальных причин обычно приводит к быстрому восстановлению функции органа. В случае длительного действия этих этиологических факторов происходит повреждение почечной паренхимы и, следовательно, переход пре- и постренальной формы ОПП в ренальную [36]. 
     Т.к. ишемическое повреждение является самым распространенным повреждающим фактором при ОПП [21], разрабатываются методы достижения ишемической толерантности почки. Одним из таких методов является ишемическое прекондиционирование. Его эффективность показана на многих экспериментальных системах в различных органах, в том числе в почке [114]. Однако, при проведении клинических испытаний данный метод не всегда показывает целесообразность применения у пациентов с ОПП [27, 182]. В связи с тем, что ОПП чаще всего встречается у людей в пожилом возрасте [22], следовало выяснить, сохраняет ли ИПК свои положительные свойства на старых организмах.
     Ключевыми характеристиками, меняющимися при старении, являются процессы ацетилирования и аутофагии [142]. Во многих модельных организмах подходы, направленные на снижение ацетилирования белков (путем активации деацетилаз) и активацию аутофагии, служат основными методами продления продолжительность жизни лабораторных животных [19].
     
     Целью данной работы было исследование роли процессов ацетилирования и аутофагии в механизме формирования ишемической толерантности почки, а также влияния на эти процессы старения.
     
     Задачи:
    1. Определение тяжести ОПП у разных групп крыс (молодые, старые и линии OXYS) при различных воздействиях – после ишемии/реперфузии (И/Р) и после И/Р с предварительным ИПК;
     2. Исследование с помощью метода иммунофлуоресценции уровня ацетилирования в ткани почки у разных групп крыс (молодые, старые и линии OXYS) при различных воздействиях – после И/Р и после И/Р с предварительным ИПК;
     3. Исследование при помощи витальной окраски флуоресцентными зондами (краситель LysoTracker Green) интенсивности процессов аутофагии в ткани почки у разных групп крыс (молодые, старые и линии OXYS) при различных воздействиях – после И/Р и после И/Р с предварительным ИПК;




2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
2.1 Ишемическое ОПП
     Несмотря на многообразие причин развития ОПП, основным поражающим фактором в большинстве случаев является ишемическое повреждение [21]. Исходя из клинических данных, в 55-75% случаев ОПП именно ишемическое повреждение служит причиной возникновения острого канальциевого некроза. Чаще всего с ишемическим ОПП сталкиваются пациенты с сердечно-сосудистыми заболеваниями, шоком или после хирургических операций. Отдельную группу представляют реципиенты почечных трансплантатов, т.к. пересаживаемые почки неизбежно проходят этап ишемии [14].
     Скорость клубочковой фильтрации (СКФ) и почечный кровоток - ауторегулируемые процессы, и они не зависят от системного кровотока при артериальном давлении в диапазоне 80-170 мм рт.ст. Однако, при падении давления ниже 80 мм рт.ст., механизмы ауторегуляции не могут поддерживать разницу давления между приносящей и выносящей артериолами, что приводит к уменьшению кровотока в клубочках. Невозможность поддержания эффективного фильтрационного давления ведет к прекращению фильтрации в клубочках. Снижение кровотока влияет также на функцию реабсорбции. Недостаточное поступление кислорода связано со снижением образования аденозинтрифосфата (АТФ), который необходим для поддержания работы Na+/K+-АТФ-азы, создающей градиент ионов между эпителиальной клеткой и интерстицием. Созданный градиент является основой вторично-активного транспорта, за счет которого происходит реабсорбция различных веществ и воды. Нарушение фильтрации и реабсорбции будет вести к накоплению в крови метаболитов, которые в норме выводятся с мочой, например, мочевины и креатинина [37, 82].
     Процессы, происходящие в течение ишемии и последующей реперфузии, неразрывно связаны между собой, поэтому нередко их обозначают как ишемически-реперфузионное (И/Р) повреждение [166].
     
     2.1.1 Изменения на клеточном уровне
     Одну из первостепенных ролей в процессах ишемии и реперфузии, а также вызываемых ими повреждений играют митохондрии. При нормальной оксигенации и достаточной концентрации субстрата на дыхательной цепи происходит выработка АТФ [25]. Помимо АТФ, митохондрии также являются источниками активных форм кислорода (АФК). Выработка АФК осуществляется комплексами дыхательной цепи, дегидрогеназами в матриксе и моноамин-оксидазами внешней митохондриальной мембраны [163]. В физиологических условиях их количество строго контролируется несколькими антиоксидантными системами, интенсивность работы которых зависит от типа ткани, функциональной активности и состояния органа. Неконтролируемое образование большого количества АФК наносит урон митохондриям и клетке, но их продукция в ряде случаев несет полезные функции, например, они участвуют в передаче внутриклеточных сигналов, играют роль в клеточном иммунитете [194]. 
     При прекращении доставки кислорода к клеткам происходит переключение окислительного фосфорилирования, протекающего в митохондриях, на субстратное, которое не требует участия кислорода. Однако, поддержание нормальных функций только за счет АТФ, полученного в результате процесса гликолиза, невозможно для ткани с высоким метаболизмом. Уровень АТФ в клетке постепенно падает, идет накопление лактата. Понижение рН и уменьшение количества АТФ приводят к дестабилизации мембран лизосом и разрушению гидролазами части клеточных структур. Ингибируется работа ионных помп, в частности, Na+/K+-АТФ-азы, за счет чего в клетке нарушается соотношение ионов. Возрастание внутриклеточной концентрации ионов натрия ведет к нарушению работы Na+/Ca2+-антипортера и приостановке переноса ионов кальция в межклеточное пространство. Еще один путь накопления Ca2+ в цитоплазме – прекращение его активного транспорта в эндоплазматический ретикулум из-за нехватки АТФ для нормальной работы каналов [4].
     Накопление ионов кальция является важным звеном в развитии последствий ишемии. В частности, повышение их концентрации приводит к активации Ca2+-зависимых протеаз - кальпаинов. Низкий рН временно ингибирует кальпаины, но при его нормализации происходит их немедленная активация [103]. Также накопление Na+ и Ca2+ в клетке приводит к вынужденному удерживанию ионов кальция в матриксе митохондрий. Повышение количества данных ионов внутри митохондрии приводит к конкурентному взаимодействию с сайтом связывания кардиолипина и цитохрома с и активации первого шага высвобождения цитохрома с в процессе открытия поры неспецифической проницаемости митохондрий (ПНПМ). Отсоединение цитохрома с от внутренней мембраны за счет этих двух процессов приводит к замедлению транспорта электронов с комплекса III на комплекс IV дыхательной цепи, и возрастанию образования АФК в Q-цикле [76]. Таким образом, повышенный синтез АФК может проявляться даже раньше, чем выход цитохрома с из митохондрии [159].
     В целом, процесс ишемии не ведет к глобальной гибели клеток, основной урон наносится ткани в период реперфузии. Например, на сердечной ткани показано, что 4 часа ишемии вызывают гибель только 17% миокардиоцитов, тогда как после 3 часов ишемии и последующей реперфузией в течение 1 часа гибнет 73% клеток [101].
     В период реперфузии наблюдается резкое увеличение образования АФК. При изменении условий функционирования дыхательной цепи (например, при гипоксии) в ней, кроме четырехэлектронного восстановления кислорода на цитохром с-оксидазе, также возможно одноэлектронное восстановление, ведущее к накоплению супероксидного радикала. Этот метаболит является высокореакционным соединением, которое при протонировании может образовывать пероксильный радикал или самостоятельно осуществлять окисление макромолекул [184]. Есть данные, показывающие ингибирование супероксидным радикалом ферментов, содержащих железо-серные кластеры в активном центре, такие, как аконитаза, фумараза, НАДН-дегидрогеназа, креатинкиназа [110]. Он принимает участие в кальциевом сигналинге в артериолах почки и усиливает вазоконстрикцию, вызванную ангиотензином II, эндотелином-1 и тромбоксаном А2 [4]. Это связано с реакцией связывания оксида азота с супероксидным радикалом и образованием пероксинитрита. Также супероксид-анион увеличивают вход кальция через каналы L-типа [184]. Кроме того, возможно дальнейшее преобразование супероксид анион-радикала, дающее начало целому ряду АФК. Таким образом, после возобновления поступления кислорода происходит лавинообразное накопление в клетке АФК, которые повреждают липиды, белки и нуклеиновые кислоты [35]. 
     Одним из механизмов повреждения митохондрий является открытие ПНПМ [33]. Данная пора является неселективным каналом, который играет значительную роль в кальциевом обмене между митохондриями и цитоплазмой. Открытие ПНПМ индуцируется Ca2+  при его повышенном накоплении в митохондрия и циклофиллином D, который активируется ионами кальция [39]. Индукторами ПНПМ также являются АФК, увеличение аденозинди- и монофосфатов (АДФ и АМФ), снижение мембранного потенциала, проапоптотические белки семейства 2 В-клеточной лимфомы (B-cell lymphoma 2 - Bcl-2), возбуждающие аминоксилоты, стероидные гормоны [91]. 
     Выброс Ca2+ через пору является механизмом, предотвращающим перегрузку митохондрий ионами кальция и гиперпродукцию АФК. Однако, открытие ПНПМ также облегчает выход цитохрома с в цитоплазму, что приводит к апоптозу [108]. Хотя пока не все белковые структуры и элементы, регулирующие открытие ПНПМ описаны, показано, что существует один, отвечающий за активацию/деактивацию комплекса. Этим белком является 3?-изоформа киназы гликогенсинтазы (glycogen synthase kinase 3-beta, GSK-3?). Активации данной киназы путем дефосфорилирования серина в 9 положении ведет к открытию ПНПМ, тогда как ингибирование предотвращает образование поры [25].
     Значительное падение кровотока или его полная остановка ведет к прекращению снабжения ткани кислородом и питательными веществами. В норме ткани имеют определенный запас питательных веществ, которые могут окисляться, пока еще есть некоторый резерв кислорода. Как было показано, клетки способны выживать даже после длительной ишемии и возвращаться к выполнению своих физиологических функций [101]. Этот период, в течение которого ткань способна нивелировать последствия гипоксии, называют толерантностью ткани к ишемическому повреждению. Длительность данного периода очень специфична для каждого органа. Это окно очень значимо для разработки терапевтической тактики, в данный момент идут разработки методов его увеличения [25].
     В целом, нарушение работы комплексов дыхательной цепи, падение митохондриального потенциала, повышение проницаемости мембран митохондрии и высвобождение апоптотических белков приводят к повреждению этих органелл. Результатом является уменьшение количества АТФ, повышенное содержание АФК, опосредующих перекисное окисление липидов, белков и ДНК. В итоге, повреждение затрагивает всю клетку. Таким образом, митохондрии играют ключевую роль в развитии повреждения после И/Р и могут служить возможным звеном для терапии ОПП [85].
     
     2.1.2 Изменения на органном уровне
     Изменения, протекающие при ишемии/реперфузии, пагубно сказываются на функционировании нефрона. Длительная ишемия и последующая реперфузия ведут, прежде всего, к гибели разных видов клеток почки [34]. 
     Клетки обладают разной чувствительностью к ишемическому повреждению. Считается, что самыми уязвимыми являются эндотелиоциты [122]. На фоне И/Р они набухают (уменьшая просвет сосуда), теряют гликокаликс, в них наблюдается разрушение цитоскетета, плотных контактов и потеря взаимодействия с периваскулярным матриксом, изменяется экспрессия генов [3]. К тому же, И/Р вызывает вазоконстрикцию за счет стимуляции выработки эндотелием тромбоцитарного фактора роста и эндотелина-1 [83]. Вазоконстрикция усиливается и за счет снижения выработки оксида азота в период реперфузии, которое наблюдается из-за уменьшении экспрессии eNOS (endothelial nitric oxide synthase) и других вазодилатирующих эндотелиальных факторов, а также в результате образования пероксинитрита [124]. После ишемии повышается восприимчивость эндотелия к эндогенным вазоконстрикторам, таким как ангиотензин II, тромбоксан А2, простагландин Н2, лейкотриены С4 и Д4 [3].
     Клетки нефрона по-разному реагируют на изменения оксигенации. Это связано с тем, что в норме в нефроне существует градиент парциального давления кислорода [81]. Наблюдается разность метаболической активности в разных участках нефрона, например, может по-разному происходить метаболизм жирных кислот, быть различной интенсивность образования лактата [46], кетоновых тел и аминокислот [4]. В связи с этим некоторые участки нефрона адаптированы к пониженным концентрациям кислорода. Есть данные, показывающие что эпителий внутреннего мозгового вещества мало зависит от окислительного фосфорилирования и получает АТФ преимущественно за счет гликолиза [59]. Эпителиальные клетки внешнего коркового вещества тоже имеют большой запас кислорода, поэтому этот регион является одним из самых устойчивых к повреждению. Наиболее подвержены поражению эпителиоциты внешнего мозгового вещества, т.к. они и при физиологических условиях находятся на грани аноксии, но при этом вынуждены активно выполнять функции реабсорбции. Там же обнаруживают наибольшее скопление клеток иммунной системы после реперфузии [98]. Участок, наиболее чувствительный к повреждению – S3-сегмент [133]. Однако, несмотря на разную чувствительность, при очень длительной ишемии страдают все области почки [4].
     Основными морфологическими изменениями, происходящими в эпителиоцитах при И/Р, являются потеря щеточной каемки и полярности, т.е. начинает наблюдаться аномальное распределение трансмембранных белков (интегрины, Na+/K+-АТФ-аза) [49]. Клетки слущиваются, оголяя базальную мембрану, в просвете канальцев накапливается дебрис с появлением слепков, вызывающих его обструкцию и повышение внутриканальцевого давления [3].
     Повреждение эндотелия и эпителиоцитов ведет к активации экспрессии молекул адгезии, которые узнают тромбоциты и клетки иммунной системы. Связывание тромбоцитов и лейкоцитов с поврежденными клетками эндотелия ведет к образованию микротромбов, обструкции капилляров и активации лейкоцитов с усилением выработки цитокинов [111]. Погибшие клетки являются триггером для развития воспаления, в ответ на их обнаружение начинают образовываться провоспалительные и хемотаксические цитокины (ФНО-?, ИЛ1, ИЛ6, ИЛ8 и другие) [57]. Клетки почечной ткани, оказавшись в зоне воспаления, также начинают вырабатывать провоспалительные цитокины и экспрессировать TLRs, белки и рецепторы системы комплемента, костимулирующие молекулы. На их поверхности появляются рецепторы MHCII, презентирующие антигены Т-клеткам [3].
     Первыми в очаг повреждения привлекаются клетки врожденного иммунитета – нейтрофилы [45]. Несмотря на то, что присутствие нейтрофилов необходимо для фагоцитоза погибших клеток и дальнейшего привлечения клеток иммунной системы, они опосредуют еще большее повреждение почечной ткани. В процессе активации они производят протеазы, миелопероксидазу, АФК и цитокины, которые увеличивают проницаемость сосудов и могут нарушать целостность вышивших клеток [4]. Нейтрофилы привлекают другие клетки, в первую очередь, моноциты, которые в очаге воспаления превращаются в макрофаги. Их появление в ткани регистрируют через 30 минут после начала реперфузии, максимум численности наблюдают через 24 часа, а значительное уменьшение через 7 суток [130]. Макрофаги выполняют свою основную функцию, фагоцитируют разрушенные клетки, а также участвуют в презентации антигенов [112]. Присутствие макрофагов в поврежденном участке важно для его репарации, однако, у мышей их подавление в почке и селезенке до И/Р уменьшало тяжесть ОПП, а перенос макрофагов от контрольной мыши возвращал исходные показатели [3].
     Затем идет активация адаптивного ответа, происходит созревание Т- и В-лимфоцитов. Их присутствие, как и макрофагов, ухудшает показатели почечных функций, но играет важную роль в репарации после И/Р [136]. Например, мыши, дефицитные по CD4 и CD8, через двое суток после И/Р обладали меньшей тяжестью ОПП, меньшим инфильтрированием ткани нейтрофилами и значительным уменьшением острого канальциевого некроза [165]. Другое исследование показало улучшение гистологической картины и серологических показателей только у мышей с дефицитом Т-клеток или Т-хелперов, отсутствие CD8+-клеток не обладали функциональными или структурными маркерами повреждения [60]. Также было проведено исследование нокаута Т-клеточных рецепторов – ??-TCR. Мыши с дефектом ??-TCR через 24 часа после И/Р по значению креатинина были защищены от повреждения, по сравнению с интатными животными [100].
     Аналогично, В-лимфоциты также играют двоякую роль при И/Р почки [137]. Мыши с нокаутом рецептора комплемента 2-го типа обладали нефункциональной субпопуляцией В1, и поэтому более низким содержанием IgM, что было ассоциировано с меньшим повреждением при И/Р [44]. Несмотря на то что многие исследования связывают действие лимфоцитов с поражением ткани в процессе ишемически-реперфузионного повреждения, они также участвуют в восстановлении ткани почки [137].
     
     2.1.3 Изменения на функциональном уровне
     Ишемическое ОПП ассоциировано с такими состояниями как острый канальциевый некроз, уменьшение скорости клубочковой фильтрации, увеличение креатинина сыворотки крови и олигурия [3]. Серьезные изменения происходят в сосудистом русле почки после И/Р. За счет повреждения эндотелия, увеличения базального тонуса сосудов, привлечения тромбоцитов и лейкоцитов наблюдаются такие последствия как уменьшение кровотока и СКФ, удлинение периода ишемии в отдельных участках почки [111].
     За счет поражения эндотелиоцитов страдает фильтрационная функция и реабсорбция [112]. Поврежденные проксимальные канальцы не способны должным образом реабсорбировать ионы натрия, в связи с чем плотное пятно дистального отдела нефрона активирует тубуло-гломерулярную обратную связь, происходит сужение приносящей артериолы и наблюдается еще большее падение СКФ [17].
     
     2.1.4 Восстановление после повреждения
     Если повреждающий фактор воздействует короткое время и физиологические резервы почечной ткани не истощены, есть вероятность восстановления почки без ухудшения ее функционирования [34]. Есть несколько типов клеток, которые могли бы пролиферировать в ответ на повреждение почки, - выжившие эпителиальные клетки, стромальные клетки костного мозга, внутрипочечные прогениторы или интерстициальные клетки [4, 109]. Исследования, проведенные на трансгенных мышах показывают, что именно выжившие эпителиальные клетки ответственны за восполнение необходимого количества клеток канальцев после И/Р [77]. Пораженные элементы в этом случае удаляются, эпителиоциты в нефронах дедифференцируются, делятся необходимое число раз до восполнения численность клеток в нефроне, и восстанавливают свою дифференцировку. Маркеры при восстановлении аналогичны тем, что участвуют в органогенезе почки, и их активность не наблюдается в органе в норме [78].
     Несмотря на большое количество изменений, происходящих в почечной ткани при И/Р, возможно два исхода. Один из них заключается в восстановлении поврежденной ткани, другой – в замещении погибших участков фиброзной тканью [111]. 
     При остром повреждении почечной ткани нормальное функционирование эпителиоцитов и эндотелия нарушается. При длительном или тяжелом повреждении погибает большое количество клеток, развивается сильный воспалительный ответ [3]. В поврежденных клетках почки из-за повреждений останавливается клеточный цикл на стадии G2/M [190]. Привлеченные клетки иммунной системы и эпителиоциты начинают вырабатывать провоспалительные цитокины и факторы роста. Развивается воспалительный процесс, стимулирующий фибробласты к активному делению. Перициты мигрируют от сосудов, повышая проницаемость сосудов и тем самым усугубляя эндотелиальную дисфункцию [3]. Сосуды еще больше повреждаются, это ведет к потере микроциркуляторной сети и ухудшению кровоснабжения ткани. Уменьшение количества сосудов ассоциировано с хронической гипоксией, которая пролонгирует канальцевое повреждение и тубулоинтерстициальный фиброз [50]. Новые капилляры не образуются, т.к. идет угнетение синтеза ангиогенных факторов и усиление выработки ингибиторов ангиогенеза [51].
     Создается порочный круг, фибробласты постепенно замещают поврежденную ткань и еще больше угнетают кровоток. Нарушение доступа кислорода и питательных веществ к клеткам канальцев мешает регенеративному процессу и приводит к еще большему фиброзу. Данные изменения уменьшают количество функционирующих нефронов и ведут к развитию хронической болезни почек [15;22]. Особенно часто фиброз выявляют при хроническом почечном повреждении или в почках пожилых пациентов [34].
     На важность пролиферативной способности клеток при репарации после повреждения еще раз указывают данные о роли длины теломер в регенерации после И/Р-повреждения. Мыши, дефицитные по участку РНК в теломеразе и, соответственно, имевшие в каждом поколении уменьшающуюся длину теломер, обладали меньшей пролиферативной способностью к восстановлению клубочков, канальцев и интерстициальных клеток после повреждения [7]. 
     
2.2 Ишемическое прекондиционирование
     Хотя потребность в разработке терапии ишемического ОПП очень высока, подходов существует не много. Есть только две стратегии, рассматривающие как мишень для воздействия митохондриальный ретикулум. Первая основана на использовании антиоксидантов и уменьшении количества АФК [40].  Однако, в связи с тем, что АФК выполняют в клетке также физиологические функции, полное их элиминирование может нанести вред [194]. Поэтому идет разработка антиоксидантов, селективно накапливающихся в митохондриях и способных за счет адресной доставки нейтрализовать избыток АФК в этих органеллах [47]. Другой стратегий является воссоздание феномена ишемического прекондиционирования (ИПК), запускающего активацию сигнальных путей, приводящих к увеличению толерантности клетки к уже образовавшимся АФК [40]. 
     ИПК определяют как повышение толерантности органов и тканей к действию тяжелой длительной гипоксии (ишемии) с помощью предварительного воздействия одного или нескольких эпизодов кратковременной ишемии и реперфузии [38]. Впервые феномен был описан Murry для миокарда [153]. ИПК может осуществляться как при помощи механических, так и фармакологических манипуляций. Механическое ИПК разделяют на локальное и удаленное [180].
     В разных исследованиях используют различное количество циклов ИПК, варьирует их длительность и интервалы между циклами. В механизме действия ИПК выделяют 2 фазы [114]. Ранняя фаза опосредуется открытием ионных каналов и сигнальными молекулами, образующимися в период ишемии [94]. Поздняя фаза включает в себя изменение транскрипции генов, ответственных за метаболизм глюкозы, изменение активности работы митохондрий, ингибирование экспрессии проапоптотических молекул, уменьшение воспаления и выработки АФК [107]. 
     В механизме ИПК ранней фазы задействованы различные сигнальные пути. В частности, эпизоды ИПК стимулируют выработку ФНО? и паракринных веществ - аутакоидов (аденозин, опиоиды, брадикинин). После связывания ФНО? с рецепторами активируется SAFE (survivor activating factor enhancement)-киназный путь, включающий в себя каскад JAK-STAT (janus kinase - signal transducers and activators of transcription) [126]. Связывание аутакоидов с G-рецепторами активирует RISK (reperfusion injury salvage kinase)-киназный путь, опосредующий во время периодов реперфузии увеличение экспрессии сигнальных киназ. Этот путь является цитопротекторным, т.к. усиливает экспрессию антиапоптотических генов (Bcl-2), уменьшает экспрессию проапоптотических генов (BAX/BAD), стимулирует выход Са2+  из клетки, активирует eNOS, 3?-изоформа киназы гликогенсинтазы (glycogen synthase kinase 3-? - GSK-3?) и митохондриальный калиевый канал [95]. Оба эти пути, SAFE и RISK, пересекаются и ингибируют ПНПМ, что, как полагают, является основным механизмом защиты от повреждения [187]. Предложены и другие кандидаты на роль медиаторов ИПК – белок теплового шока 27 (heat shock protein 27 – Hsp27), Hsp70, гем-оксигеназа, АФК [3].
     Основными белками, опосредующими позднюю фазу ИПК, являются факторы, индуцируемые гипоксией (hypoxia-inducible transcription factors- HIFs) [141]. В ответ на гипоксию данные факторы транслоцируются в ядро, где активируют гены белков, ответственных за адаптацию к пониженной концентрации кислорода, например, митохондриальных белков или факторов роста, стимулирующих эритро-, ангиопоэз и пролиферацию клеток [90]. HIF-2 играет защитную роль при ИПК почки за счет регулирования молекул адгезии сосудистого эндотелия и, соответственно, уменьшения узнавания клетками иммунной системы поврежденных клеток сосудов [113]. Он также участвует в активации антиоксидантных ферментов (каталазы, глутатион пероксидазы, супероксиддисмутазы) [170].
     Действие HIFs при ИПК почки заключается в адаптации метаболизма к пониженному уровню кислорода, уменьшении воспаления и окислительного стресса, антиапоптотическом эффекте, усилении синтеза цитопротекторных факторов (эритропоэтина, аденозина, NO) [114]. Данные изменения ведут к лучшей выживаемости клеток и репарации, уменьшению апоптоза и воспаления, что, в конечном итоге, приводит к уменьшению тяжести ОПП. Применение на крысах повторяющихся эпизодов гипоксического прекондиционирования, повышающих экспрессию HIF-1?, вызывает устойчивость эпителиоцитов к апоптозу после И/Р [189]. Наоборот, мыши, нокаутные по HIF-1? и HIF-2?, более чувствительны к И/Р сердца, и проведение предварительного ИПК не показывает положительного эффекта [61, 99]. 
     В целом, ИПК активирует антиоксидантные механизмы защиты, уменьшает окислительный стресс и выход в цитозоль цитохрома с, повышает содержани.......................