Состояние проблемы охраны генофондов редких видов растений

Содержание

Введение………………………………………………………………………….3 
1. Состояние проблемы охраны генофондов редких видов растений
    1.1. Характеристика генофондов редких и исчезающих видов растений…5
    1.2. Проблемы молекулярно-генетической идентификации и паспортизации растений…………………………………………………………………………..6
    1.3. Виды сохранения редких и исчезающих видов растений……………...9
2. Специфика выделения ДНК из растительных объектов
    2.1. Особенности выделения ДНК из растительных объектов………….....15
    2.2. Выделение ДНК из обезвоженных (дегидрированных тканей) растений………………………………………………………………………….20
3. Создание банка ДНК редких видов эндемичных растений
    3.1. Характеристика региона исследования…………………………………23
    3.2. Материалы и методы……………………………………………………..25
    3.3.  Анализ генетического разнообразия популяций………………………32
    3.4. Анализ генетической изменчивости…………………………………….36
4. Экспериментальная часть………………………………………………….38
5. Выводы…………………………………………………………………….….49
Список литературы…………………………………………………………….51










Введение
     
     Сохранение и воспроизводство ресурсов – одна из наиболее актуальных проблем XXI века. 
     Многие виды растений, грибов и животных стали редкими: состоят из нескольких малочисленных популяций, распространённых на ограниченной территории. Некоторые виды находятся под угрозой исчезновения, их численность сократилась до критического уровня — это исчезающие виды. Если факторы, вызвавшие сокращение численности, будут продолжать действовать, то сохранение таких видов маловероятно.
     Собирая букеты первоцветов, разных видов гвоздик и колокольчиков, мы лишаем эти растения возможности дать плоды и семена. Заготавливая лекарственные растения (зверобой, душицу, валериану), сборщики часто вырывают их с корнями, а не срезают часть побега. После таких хищнических заготовок популяции растений могут не возобновиться.
     Редкие и исчезающие виды нуждаются в охране, и их заносят в Красные книги. Включение вида в Красную книгу — сигнал о необходимости принятия срочных мер по его спасению.
     Каждая страна, на территории которой обитает вид, включённый в Красную книгу, несёт ответственность перед всем человечеством за его сохранение.
     Несмотря на принимаемые меры в настоящее время не представляется возможным сохранить отдельные исчезающие виды, поэтому предпринимаются попытки сохранить их гены.
     Банк геномов создаётся путём хранения наследственной информации животных и растений в целости методом замораживания их семян, спор, половых и соматических клеток, а также тканей животных. Для этой цели используются методы их консервации — временного приостановления некоторых процессов. Самым эффективным среди них является метод замораживания — криоконсервации (замораживания при очень низкой температуре).
     Банк генов (введение в бактериальную клетку). В результате развития генетической инженерии появилась возможность выделения отдельных ценных генов исчезающих животных и растений, введения их в бактериальную клетку и создания таким путём банка генов.
     Наследственную информацию, сохраняемую в настоящее время в законсервированном виде или в виде банка генов, можно впоследствии размножить (клонировать) и использовать для восстановления этих видов.
     Исследования на уровне ДНК, помимо собственно молекулярной биологии, стали уже рутинной практикой в селекции, таксономии, оценке и сохранении биоразнообразия, эволюции, изучении генетических основ регуляции физиологических процессов и устойчивости к биотическим и абиотическим факторам среды, биотехнологии, биоинженерии и др. Достигнутый современный уровень молекулярно-генетических подходов: генотипирование, секвенирование позволяет анализировать огромное количество растительных организмов с целью выявления полиморфизма, молекулярных основ фенотипической изменчивости и устойчивости к стрессовым факторам среды и др. 
     Это мотивирует международное сотрудничество в области оценки и систематизации мировых генетических ресурсов, в том числе важнейших сельскохозяйственных культур и их диких сородичей.






1. Состояние проблемы охраны генофондов редких видов растений
1.1. Характеристика генофондов редких и исчезающих видов растений

     Распахивая новые земли, строя города, плотины на реках, люди в течение многих веков неосторожно и легкомысленно брали у природы все, что хотели. И во второй половине XX в. оказалось, что некоторые обычные когда-то растения и животные, особенно полезные или очень красивые, начали исчезать. Больше нет на озерах зарослей водяного ореха, или чилима, почти невозможно найти в тайге корень женьшеня, совсем исчез из подмосковных лесов ландыш, стали редкостью желтые розочки купальниц в прибрежных зарослях и прекрасные водяные лилии на лесных прудах. Теперь это редкие, или эндемичные, растения.
     Эндемиками можно назвать и растения-долгожители. Изменился окружающий их ландшафт, на планете появились и исчезли новые виды растений, а они все встречают и провожают целые столетия. На планете осталась лишь небольшая роща ливанских кедров. Многовековым американским секвойям дают собственные имена. Только на Сейшельских островах и нигде больше растет сейшельская пальма. Среди эндемиков есть и растения-хищники. На планете еще остались растения, которые эндемичны из-за своего географического положения. Гранитные Сейшельские острова можно назвать одним из чудес света. Они очень долго существуют в изоляции. Предполагают, что это обломок древнего единого континента Гондвана, который потом “распался”, образовав все современные материки. На Сейшельских островах более 70 эндемичных видов и родов растений.
     В настоящее время общий генофонд редких и исчезающих растений сосредоточен на базовых экспозициях: «Редкие растения Сибири», «Редкие лесные растения», «Каменистая горка», а также на экологической тропе Заповедного парка СибБС и составляет около 300 видов, в том числе 56 видов, включенных в Красную книгу Томской области, 33 – в Красную книгу Российской Федерации.
     С 2003 г. Создается родовой комплекс горечавковых (горечавка, калатиана, циминалис, золототысячник, сверция), насчитывающий более 20 видов. Помимо этого, на экспозициях лаборатории представлены родовой комплекс толстянковых и коллекция медоносных растений.
     Пополнение коллекций осуществляется путем привлечения семенного материала по делектусному обмену, а также в ходе экспедиционных исследований на территории Томской и Кемеровской областей, Республик Алтай, Хакасия, Бурятия, Забайкальского края и др.
     Совместно с сотрудниками других лабораторий ботанического сада ведутся активные работы по экологическому просвещению населения. Заложены экспозиции редких и хозяйственно-ценных растений Сибири на экологической тропе «В Заповедном парке».
     
 
     1.2. Проблемы молекулярно-генетической идентификации и паспортизации растений
     
     Редкие и находящиеся под угрозой исчезновения виды животных, растений и грибов — самая хрупкая, но очень важная часть биоразнообразия, которая нуждается в первоочередной охране [4]. 
     Приоритеты охраны таких видов определены Конвенцией по биоразнообразию и российским природоохранным законодательством, в частности Стратегией сохранения редких и находящихся под угрозой исчезновения видов животных, растений и грибов, принятой Министерством природных ресурсов Российской Федерации в 2004 г. В категории «редкие и находящиеся под угрозой исчезновения виды» выделяются объекты животного и растительного мира с биологической и правовой точек зрения. С биологической точки зрения категория «редкие и находящиеся под угрозой исчезновения виды» включает две основные группы объектов животного и растительного мира: 
     • естественно редкие виды, потенциально уязвимые в силу своих биологических особенностей; 
     • виды, широко распространенные, но находящиеся под угрозой исчезновения или сокращающие свою численность и ареал в результате антропогенного воздействия. С правовой точки зрения категория «редкие и находящиеся под угрозой исчезновения» включает виды, занесенные в Красную книгу Российской Федерации или субъектов Российской Федерации, а также в Приложения к международным соглашениям [4]. 
     Наиболее действенным и чаще всего используемым методом сохранения редких видов лесных экосистем считается их охрана на особо охраняемых природных территориях (ООПТ). На ООПТ хозяйственная деятельность обычно запрещена или ограничена. При этом возможно сохранение популяций редких видов животных, растений и грибов или наиболее важных для сохранения вида местообитаний, таких как репродуктивные зоны, места зимовки, ключевые участки миграционных путей и др. [4]. 
     Важно также, что режим ООПТ позволяет сохранить не только отдельные виды, но и всю лесную экосистему с ее сложной структурой и взаимосвязями. Однако у данного способа охраны редких видов есть и существенные недостатки. 
     Вопервых, организация ООПТ требует длительного времени и часто затягивается на десятилетия. 
     Вовторых, далеко не все редкие виды охраняются на ООПТ. 
     Втретьих, такой «чернобелый» подход, как здесь не рубим и сохраняем, а там рубим и не сохраняем, не способствует развитию экологической ответственности бизнеса, властей, населения. 
     Вчетвертых, вне ООПТ также необходимо сохранять локальные популяции, внутривидовые формы и подвиды, которые являются носителями уникальных адаптаций вида к конкретным условиям среды [4]. 
     Современные молекулярно-генетические технологии позволяют изучать тонкую структурно-функциональную организацию геномов различных организмов. Анализ генетической изменчивости пород животных, сортов растений и штаммов микроорганизмов, идентификация и паспортизация хозяйственно-ценных особей стали возможны благодаря получению специфических геномных маркеров ДНК. С по мощью произвольных праймеров идентифицировали генотипы видов рода Рапах (Araliaceae) [5], а впоследствии и эндемичного вида Oxytropis chankaensis Jurtz. (Fabaceae) [1]. 
     Работы по молекулярно-генетической идентификации сортового материала растений проводятся в основном на важнейших продовольственных [2,4], а также ягодных культурах. 
     Идентификация генотипов растений проводится с помощью ПЦР анализа рассеянных повторяющихся последовательностей R173 [6], разработаны основы паспортизации зерновых  и ягодных культур. 
     Значительно меньше внимания уделяется анализу генетической изменчивости природных популяций, особенно редких и ресурсных видов растений. Весьма актуальной является проблема идентификации растительного сырья у близкородственных лекарственных видов растений, таких как виды рода Adonis. В геномах растений и животных количество микросателлитных повторов очень велико, что делает ISSRметод (Inter-Simple Sequence Repeat) очень эффективным и удобным в генетическом анализе. Основой ISSR-метода или анализа полиморфных участков ДНК между микросателлитами является ПЦР с одним или несколькими праймерами длиной в 15-24 нуклеотида, но праймеры состоят из тандемных коротких 2~4 нуклеотидных повторов и одного селективного нуклеотида на З'-конце праймера [7]. ISSR не требует предварительного клонирования и секвенирования фрагментов для подбора праймеров и хорошо воспроизводим в строгих условиях.
     В качестве повторяющихся последовательностей ретротранспозоны рассеяны по всему геному; в связи с этим они удобны для ДНК-генотипирования растений [7]. При идентификации растительного сырья лекарственных растений, при мониторинге состояния природных популяций редких и исчезающих видов растений, для рекомендаций мер их охраны и при их восстановлении после антропогенных воздействий важна обобщенная генетическая характеристика по типичным для данного рода, вида, популяции ДНК-маркерам.
     
     1.3. Виды сохранения редких и исчезающих видов растений
     
     Наибольшую опасность для разных видов растений, животных и грибов представляет утрата их природных мест обитания. Поэтому сохранить и умножить видовое разнообразие можно только при условии сохранения естественных экосистем. Эту задачу можно решить путём создания охраняемых природных территорий, прежде всего заповедников. Территории заповедников — эталоны нетронутой дикой природы.
     Особая роль отводится биосферным заповедникам. Они были созданы в 1974 г. по решению Организации Объединённых Наций. Их цель — проследить, как меняется дикая природа под влиянием хозяйственной деятельности человека, и прогнозировать вероятные изменения природы в будущем.  
     Всемирная сеть биосферных заповедников охватывает все основные природные зоны. В России организовано 39 биосферных заповедников, среди них лесной — Окский, лесостепной — Воронежский, степной — Центрально-Чернозёмный, горный — Кавказский и др.
     Заповедники играют огромную роль в спасении редких видов.
     Современным и эффективным подходом для ее решения является создание и длительное поддержание живых коллекций клонов in vitro (культуры изолированных протопластов, клеток, тканей, органов и их частей: микрорастений, меристемы и ее производных, каллуса, клеточных и эмбриогенных культур и др.) с привлечением разных методов биотехнологии, которые уже широко используются в мировой практике или находятся на стадии разработки. 
     Коллекции такого рода позволяют in vitro сохранять уникальные и/или хозяйственно ценные генотипы, редкие и исчезающие виды растений, преимущественно те, которые трудно размножаются вегетативно или теряют ценные свойства и/или признаки при семенном размножении. Долговременное хранение коллекций in vitro осуществляется, как правило, в стеклянных емкостях, размещенных на стеллажах небольшой площади с соблюдением правил асептики и постоянного контроля заданных параметров температуры и освещенности. Коллекции клонов in vitro (банк растительного материала) создаются для: 
     - пополнения и продолжительного хранения растительного материала генотипов, характеризующихся уникальными свойствами и/или признаками; 
     - проведения методических, прикладных (в т.ч. селекционных) и фундаментальных исследований; 
     - массового селективного тиражирования ценных трудноразмножаемых генотипов растений; 
     - сокращения сроков выращивания и снижения себестоимости посадочного материала для создания лесных культур целевого назначения или восстановления генофонда редких и/или исчезающих видов. 
     Способы сохранения ex-situ: – Содержание и разведение организмов в питомниках, зоопарках, ботанических садах, генофондных хозяйствах или фермах. – Хранение генетических материалов (гамет, зигот, соматических клеток, зародышей) в низкотемпературных генетических банках, в банках клеточных и тканевых культур, а также в банках семян. – Введение видов в культуру, численность которых сокращается из-за их неумеренной эксплуатации, может ослабить или снять этот пресс с их природных популяций.
     Способы сохранения in-situ – Сохранение редких и находящихся под угрозой исчезновения видов, занесенных в Красную книгу Российской Федерации. 14 – Регламентация промысла эксплуатируемых видов. – Сохранение и восстановление среды обитания видов, реконструкция местообитаний. – Охрана видов на особо охраняемых природных территориях. Этот способ наиболее эффективен в отношении находящихся под угрозой исчезновения узкоареальных видов. – Реакклиматизация (реинтродукция) видов, воссоздание утраченных популяций. Мероприятия по реакклиматизации наиболее актуальны в отношении видов, занесенных в Красную книгу, ареал и численность которых сильно сократились в прежние годы, но сегодня имеют тенденцию к восстановлению.
     Клон – вегетативно размноженное потомство одного растения (или клетки). Это, как правило, генетически однородная группа потомков, образованная путём бесполого размножения от одной особи и обладающая всеми биологическими признаками и свойствами материнского организма (имеют такой же набор генов, или генотип). Однако генетическая однородность клона может быть относительной в случае возникновения сомаклональной изменчивости (например, спонтанных мутаций в культуре каллуса), эпигенетических изменений наследственного материала, влияния условий культивирования и случайных отклонений, возникающих в ходе онтогенеза. Поэтому клон может быть представлен несколькими линиями в случае его расщепления по морфологическим и другим признакам. 
     Линия – изолированная культура протопластов, клеток, тканей, органов или их частей in vitro, полученная от одного таксона (клона), но в разное время, разными исследователями и, возможно, от разных рамет. 
     Депонирование коллекции in vitro – это длительное сохранение коллекций без частых пересадок на свежую питательную среду. Включает приемы, позволяющие изменить скорость роста культуры в сторону его замедления и увеличения длительности интервалов между пересадками. Депонирование растительного образца (например, клона) может использоваться и в другом значении - передача образца депозитором в биоресурсный центр (БРЦ), его регистрация, проверка, обеспечение сохранности и регулируемой доступности в соответствии с установленными правилами. 
     В зависимости от целей осуществления депонирования в БРЦ различают, в частности, следующие основные формы депонирования: «хранение», «гарантийное хранение», «патентное депонирование» (национальное и международное). 
     Криоконсервация – низкотемпературное хранение живых биологических объектов с возможностью восстановления их биологических функций после размораживания. 
     Депозитор – физическое или юридическое лицо, от имени которого клон (образцы живой ткани, клеточные или тканевые культуры) передается на хранение in vitro и (или) для проведения научных исследований в другую организацию.
     Следует отметить, что коллекции клонов in vitro, созданные с привлечением биотехнологий, направлены на сохранение ценных генетических ресурсов и по своей сути не заменяют, а дополняют классические приемы in situ и ex situ консервации. Существуют многочисленные примеры создания и успешного функционирования биотехнологических коллекций растительных объектов, которые действуют: 
     - в виде живой активно растущей пересадочной коллекции (с переносом 1 раз в течение 1–2 месяцев на свежую среду);
      - в состоянии замедленного роста и развития с использованием более длительного (один раз в 5-12 месяцев) интервала пересадки растительного материала; 
     - при полном отсутствии роста при криоконсервации (в жидком азоте) с использованием сверхнизких температур (-196оС). Коллекции подобного типа уже организованы в США, Германии, Франции, Италии, Японии, Индии, Республике Беларусь и других странах. 
     В коллекциях хранятся растительные образцы, принадлежащие к разным систематическим группам (таксонам). Большинство из них – экономически- ценные генотипы или редкие и исчезающие растения, которые считаются национальным достоянием конкретных стран. 
     К примеру, в США (штат Орегон, Корваллис) функционирует репозиторий (National Clonal Germplasm Repository USDA, http://www.ars.usda.gov/pacific-west-area/corvallisor/national-clonal-germplasm-repository/), где содержится 500 000 образцов растений, охватывающих 10 000 видов плодовых, ягодных, декоративных, лекарственных и других культур. В Германии в коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ, German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, https://www.dsmz.de/catalogues.html) поддерживается более 700 образцов различных линий культуры клеток, принадлежащих к 80 семействам растений, причем большинство из них характеризуются активным синтезом фармакологически важных вторичных метаболитов. Коллекция Центрального ботанического сада НАН Республики Беларусь (получившая свидетельство в 2005 г.) включает 241 клон растений: 32 вида и более 200 культиваров из 11 семейств. При этом более 65 % таксонов в ее составе относится к фиторесурсным видам (Решетников, 2014). В России также имеется несколько коллекций, официально зарегистрированных в соответствующих министерствах. 
     В частности, с 1969 г. при финансовой поддержке Министерства образования и науки 3 Российской Федерации функционирует Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов, созданная на базе ФГУП ГосНИИгенетика (г. Москва, http://www.genetika.ru/vkpm/). Всероссийская коллекция микроорганизмов (www.vkm.ru) имеет статус Коллекции национального значения (Постановление Правительства РФ от 24.06.96) и функционирует на базе Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина (г. Пущино, Московская обл.). Наиболее крупный банк растительного материала in vitro находится в Главном ботаническом саду РАН им. Н.В. Цицина (ГБС РАН, г. Москва, http://www.gbsad.ru/people/bioteh/), который содержит более 800 растений: 214 видов, 622 культивара из 35 семейств. Всероссийская коллекция культур клеток высших растений (ВККК ВР) создана в 1985 г. на базе Института физиологии растений РАН им. К.А. Тимирязева (г. Москва, ИФР РАН, http://www.ippras.ru/cfc/alccmp/). Она представлена каллусными и суспензионными культурами клеток, полученными из растений редких и исчезающих видов, линий, штаммов- продуцентов вторичных метаболитов, в том числе фармакологического профиля (60 видов и 30 семейств растений). 
     Коллекции клонов растений in vitro также функционируют на базе ВНИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова (г. Санкт-Петербург, ВИР, http://www.vir.nw.ru/index_r.htm). Одна из первых в России коллекция клонов in vitro ценных генотипов лесных древесных растений была создана в 1991 году в Центральном научно- исследовательском институте лесной генетики и селекции ЦНИИЛГиС (ныне ВНИИЛГИСбиотех, г. Воронеж). Коллекция уникальна по своему составу (включает более 40 клонов ценных генотипов) и продолжительности (свыше 24 лет) хранения живых образцов in vitro. Она ежегодно пополняется новыми генотипами с расширением видового и породного состава (включая клоны, полученные из других НИИ РФ в рамках сотрудничества). 
     Определения Коллекция in vitro (банк растительного материала in vitro) – это искусственно созданная совокупность образцов живого растительного материала in vitro в виде культуры изолированных протопластов, клеток, тканей, органов или целых микрорастений (растений-регенерантов), соответствующая конкретным генотипам разных видов древесных растения, направленная на их сохранение и воспроизводство, и принадлежащая конкретному владельцу (организации). Она предназначена для использования в научно-исследовательских или прикладных целях в различных областях биотехнологии и лесного хозяйства. 
     В коллекциях in vitro, как правило, сохраняют (охарактеризованные, систематизированные и документированные) уникальные и/или хозяйственно ценные генотипы, редкие и исчезающие виды растений, преимущественно те, которые трудно размножаются вегетативно или теряют ценные отличительные свойства (признаки) при семенном размножении. 
2. Специфика выделения ДНК из растительных объектов
2.1. Особенности выделения ДНК из растительных объектов

     Выделение ДНК из растений вызывает ряд трудностей, связанных с разрушением клеток. Растительные ткани содержат полисахариды, полифенолы, танины, которые ингибируют лизис и ухудшают качество ДНК. 
     Выделять ДНК можно из свежих или замороженных (при –70–80 о С) растительных образцов, из частей растений, высушенных в силикагеле, или из гербарных образцов. Не любой гербарий подходит для выделения ДНК. Лучшие результаты достигаются в случае возраста гербария не более 30–40 лет и при условии его правильной и быстрой сушки. Для выделения ДНК обычно используют листья растений, но в связи с тем, что разные органы растений могут иметь отличия в химическом составе, в том числе в содержании вторичных метаболитов, необходимо подбирать орган растения, из которого выделяется более качественная ДНК. При выборе частей растения для выделения ДНК необходимо помнить о том, что нужно выбирать участки, не пораженные грибковыми и другими заболеваниями, чтобы избежать загрязнения проб чужеродной ДНК. Если ДНК из образцов ткани не может быть экстрагирована в ближайшие 48 ч, образец должен быть заморожен при температуре от –20 до –80 оС или подвергнут сушке. Повторение циклов замораживания-оттаивания проводить не рекомендуется из-за возможности разрушения ДНК.
     В основе выделения ДНК лежат как физические, так и химические процессы. При выделении ДНК из растительных объектов необходимо дезактивировать клеточные ферменты, «удалить» запасные вещества, например, полисахариды и вторичные метаболиты: 36 алкалоиды, фенольные соединения, терпены, которые не просто мешают выделению ДНК, но и отрицательно влияют на ее качество. Так, определенные группы полисахаридов при выделении ДНК образуют с ней вязкую желеподобную массу. Серьезное негативное воздействие оказывают окислители различной биохимической природы, а также фенольные соединения. В связи с многообразием метаболитов у представителей различных таксонов, а иногда и представителей одного рода растений, одного оптимального протокола изолирования ДНК не существует. В целом выделение ДНК включает обязательные процедуры:
      – разрушение клеток или лизис;
      – удаление мембранных липидов;
      – удаление вторичных метаболитов и запасных веществ; 
     – удаление белков; 
     – удаление РНК;
      – осаждение ДНК. 
     Первый этап – разрушение клеток, лизис. В отличие от клеток животных, растительные клетки окружены прочной целлюлозной оболочкой. Активная физическая гомогенизация тканей должна разрушить клеточные оболочки, нарушить целостность клеток и внутриклеточных компартментов с целью освобождения компонентов этих компартментов, выделения их в экстрагирующий буфер. Разрушение тканей осуществляется в процессе растирания в ступке или с использованием гомогенизатора. Вследствие того, что нуклеиновые кислоты легко разрушаются на стадии очистки, время между гомогенизацией пробы и добавлением буфера должно быть минимальным. Растительные ткани содержат большое количество полисахаридов, в том числе целлюлозу клеточных стенок, крахмал; полисахариды в комплексе с белками, а также белки в комплексе с липидами, комплексы белков с нуклеиновыми кислотами, полифенолы и другие соединения. Это значительно затрудняет изолирование ДНК из многокомпонентной смеси, элементы которой могут как физически связывать, так и химически разрушать молекулы нуклеиновой кислоты. Погружение тканей в жидкий азот с последующей гомогенизацией облегчает разрушение клеток, тормозя при этом все биохимические и физические процессы, повреждающие ДНК. Если исходная ткань была заморожена, при гомогенизации ни в коем случае не следует допускать ее оттаивания. Для разрушения клеточных оболочек и мембран гомогенизированный образец обрабатывается экстрагирующим буфером, который обычно содержит EDTA, трис-HCl и CTAB. Удаление липидов и мембранных белков. Гомогенизация тканей в присутствии детергентов (поверхностно активных веществ) и хаотропных агентов способствует высвобождению мембранных липидов, белков и лизису клеток. В буферных растворах детергенты разрушают фосфолипидный слой мембран, переводят в растворимое состояние мембранные белки, тем самым разрушая липидно-белковые комплексы, при этом ДНК экстрагируется в буфер, т. е. переходит в растворимое состояние. 
     Выбор детергентов зависит от целей исследования. Классический катионный детергент, используемый при экстракции ДНК, – цетилтриметил бромид аммония (CTAB), содержащийся в экстрагирующем буфере. СТАВ лизирует клеточную мембрану, эффективно разрушает ДНК-белковые комплексы. При определенной концентрации соли (NaCl) CTAB образует нерастворимый комплекс с нуклеиновыми кислотами. Анионные детергенты, например, додецилсульфат натрия (SDS), при значениях рН ниже изоэлектрической точки белка образуют с белками нерастворимые осадки. Додецилсульфат натрия и меркаптоэтанол осаждают белки и полисахариды как нерастворимый комплекс. Меркаптоэтанол разрушает дисульфидные мостики, в том числе и в белках, с нарушением их третичной и четвертичной структуры и действует как биологический антиоксидант, ингибируя окислительные процессы, которые напрямую или косвенно повреждают ДНК. Поскольку наличие дисульфидных мостиков поддерживает стабильность нуклеаз, меркаптоэтанол элиминирует активность освобождаемых при лизисе клеток ферментов. Реже используются неионные детергенты, такие как Тритон X-100, но так как они более «мягкие», белки могут оставаться интактными.  Буфер экстракции может содержать дитиотреитол (ДTT), который так же, как и меркаптоэтанол, является сильным восстанавливающим агентом. Присутствие ДТТ способствует разрушению дисульфидных связей, предотвращая образование димеров «тиолированной» ДНК в растворе. Нагревание и присутствующие в буфере для экстракции хаотропные агенты, такие как соли, денатурируют макромолекулы, нарушая водородные связи, гидрофобные взаимодействия и силы Ван-дер-Ваальса. Высокие концентрации солей осаждают полисахариды, которые в противном случае могут образовывать с ДНК желеобразный комплекс. В присутствии в буфере экстракции этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDТА) – хелатирующего агента, связывающего ионы металлов (Mg2+, Ca2+, Fe3+ и др.), происходит дезактивация металл-зависимых ферментов, находящихся в растительных экстрактах. Наиболее важным является то, что EDTA связывает магний, являющийся кофактором фермента ДНКазы. При связывании магния снижается активность имеющихся ДНК. [14]
     Удаление вторичных метаболитов. Растения характеризуются накоплением в определенных органах большого количества вторичных метаболитов (в первую очередь это относится к ароматическим и лекарственным растениям), которые оказывают существенное негативное влияние на процедуры изолирования, а в дальнейшем могут являться ингибиторами ПЦР-реакции. Полифенолы, присутствующие во многих растениях, при гомогенизации тканей вступают в реакции окисления, ковалентно связываются с белками и нуклеиновыми кислотами, осадок ДНК становится коричневым, такие образцы ДНК непригодны для дальнейших исследований. Связать фенолы и не допустить их взаимодействия с нуклеиновыми кислотами можно с помощью содержащихся в экстрагирующем буфере полимеров: поливинилпирролидона (PVP) или поливинил- поливинилпирролидона (PVPP, модификация PVP с поперечными сшивками). Удаление белков. Степень связывания участков ядерной ДНК с белковыми комплексами зависит от транскрипционного статуса 39 этих участков, транскрипционно неактивная ДНК наиболее плотно «упакована» с соответствующими белками, представляя структуру гетерохроматина. Поэтому следующий важный этап – удаление белков с помощью протеаз. Щелочные протеазы гидролизуют белки, в том числе гистоны, связанные с ДНК, ферменты клеточного содержимого, в том числе нуклеазы. В качестве примера можно привести широко применяемую протеиназу К, которая эффективно инактивирует нуклеазы, будучи устойчивой при этом к денатурирующим (SDS, мочевина), хелатирующим (ЭДТА) и сульфгидрильным агентам, а также к ингибиторам трипсина и хемотрипсина. 
     Данная протеаза работает в широком диапазоне рН (от 4 до 12 единиц). Более того, денатурирующие агенты повышают доступность пептидных связей белков для протеиназы К. Белки также могут быть осаждены солями: ацетатом аммония, натрия, калия – или до осаждения ДНК экстрагированы смесью фенол/хлороформ. 
     Удаление РНК. Большие количества РНК в образцах ДНК могут связывать Mg+2 и тем самым снижать активность ДНК-полимеразы в ПЦР и, следовательно, количество продукта реакции. РНК может быть удалена на соответствующем этапе осаждением хлоридом лития или добавлением РНКазы к растворенному в воде осадку нуклеиновых кислот. 
     Инкубация при 37 °С способствует гидролизу РНК в образцах. Затем ДНК должна быть переосаждена спиртом, так как мелкие фрагменты РНК после обработки РНКазой могут послужить «затравками» в ПЦР-реакции.
     Осаждение ДНК. Нуклеиновые кислоты из экстракционного буфера осаждают охлажденным этанолом или изопропанолом, поскольку полярные молекулы ДНК нерастворимы в неполярном спирте. Концентрация спирта при переосаждении не должна быть меньше 70 % во избежание потерь ДНК. Если в осажденном концентрированном экстракте ДНК все еще присутствуют ингибиторы ПЦР, может быть использована смесь фенол/хлороформ/изоамиловый спирт; при этом смесь разделяется на фазы: водный раствор, в котором содержатся нуклеиновые кислоты; интерфаза вода/фенол – содержатся белки и углеводы; фаза хлороформ/изоамиловый спирт – растворяются липиды. 
     Водный экстракт переносится в чистую пробирку, и нуклеиновая кислота может быть осаждена 3 М ацетатом натрия, с последующим промыванием осадка в спирте (70 % и 100 % этанол). Фенол, хлороформ и изоамиловый спирт – токсичные соединения и требуют утилизации после использования, поэтому их применение становится все более редким. Коммерческие наборы для выделения ДНК не содержат токсичные фенол и хлороформ, но имеют высокую стоимость. ДНК после экстракции может храниться в буферах, совместимых с ПЦР. 
     Следует учитывать, что, например, ТЕ-буфер содержит ЭДТА, связывающий ионы магния, необходимого для работы ДНК-полимеразы (во время ПЦР-реакции). В стерильной дистиллированной воде ДНК представляет собой слабую кислоту, что в конечном итоге приводит к авторазрушению. Фосфатные буферы также могут влиять на структуру ДНК. Трис-буфер сам по себе не оказывает влияния на Taq-полимеразу, но при внесении ДНК в этом стабилизирующем буфере может сдвинуться рН реакционной смеси ПЦР. Экстрагированная ДНК может долгое время храниться при –80 °C. Для непродолжительного хранения ДНК достаточно 4 °С. Крайне не рекомендуется неоднократное замораживание–оттаивание препаратов ДНК, ведущее к разрывам молекулы. 
     Таким образом, метод экстракции ДНК должен быть достаточно простым, удобным, недорогим и при этом воспроизводимым. Полученная чистая ДНК должна быть «доступна» для ферментов рестрикции и реакций амплификации, отвечать требованиям последующего клонирования, секвенирования, гибридизации и др.

2.2. Выделение ДНК из обезвоженных (дегидрированных тканей) растений

     Использование свежего растительного материала в биогеографии, изучении биоразнообразия, в крупномасштабных исследованиях размера генома весьма ограничено. Дегидрированный растительный материал имеет определенное преимущество, поскольку нет необходимости хранить образцы в морозильнике. Такой материал может транспортироваться на далекие расстояния. Гербарные образцы, семена, образцы, лиофильно высушенные или фиксируемые в силикагеле, зачастую используются в целом ряде исследований для выделения из них ДНК. Однако, очевидно, что в подобных экспериментах важно полностью регидрировать ткани для последующей нормальной работы соответствующих ферментов.
     В исследовании [18] высушенные с помощью силикагеля образцы были использованы для оценки размера генома, предполагая взятие образцов географически широко распространенных растений, когда сбор коллекций свежего материала неосуществим. 
     Данный способ, по расчетам исследователей, имеет ошибку (<10%), сравнимую с таковой других используемых методологий, например, определением размера генома с помощью флоуцитометрии; .......................