Разработка лабораторной модели для оценки влияния оксида азота при эндометриозах кроликов

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего образования
«МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ»



Институт ветеринарно-санитарной экспертизы, биологической и пищевой безопасности
Кафедра «Ветеринарная медицина»
Специальность: 36.05.01 «Ветеринария»

Дипломная работа

«Разработка лабораторной модели для оценки влияния оксида азота                        при эндометриозах кроликов»


«ДОПУЩЕН К ЗАЩИТЕ»

«ДОПУЩЕН К ЗАЩИТЕ»
И.о. директора  ИВСЭБиПБ
д-р вет. наук, профессор, акад. РАН
Уша Б.В.

Заведующий кафедрой
д-р вет. наук, профессор, акад. РАН
Уша Б.В.
________________________________

________________________________
(подпись)


(подпись)





«____»

_____________
2018 г.


«_____»
______________  
2018 г.

	
Дата защиты

Протокол ГЭК

Оценка ГЭК

Секретарь ГЭК:

/Крюковская Г.М./
(подпись)














Руководитель


/д.в.н.,проф.
Ленченко Е.М./

(подпись)








     Студент




/Христидис Я.И./

(подпись)















Москва – 2018

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ФГБОУ ВО «МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ»
Уровень образования:
Специалитет
Направление: 36.05.01  «Ветеринария»



Институт ветеринарно-санитарной экспертизы, биологической и пищевой безопасности
Кафедра «Ветеринарная
медицина»
УТВЕРЖДАЮ


Заведующий кафедрой





д-р вет. наук, профессор, акад. РАН Уша Б.В.


«___» ________ 2018г.
З А Д А Н И Е
на выполнение 
Д И П Л О М Н О Й   Р А Б О Т Ы
студенту Христидис Яне Игоревне
1. Тема: «Разработка лабораторной модели для оценки влияния оксида азота                        при эндометриозах кроликов». 
    Утверждена приказом по университету №           от «   »                    20__ г.
2. Дата сдачи студентом законченной работы «_____» ______________20___г.
3. Специальные указания по работе: разработать лабораторную модель для оценки влияния оксида азота при эндометриозах кроликов.
4. Содержание пояснительной записки: введение, обзор литературы, собственные исследования, экономическая часть, заключение, список литературы 
5. Перечень презентационного материала: презентация  «Разработка лабораторной модели для оценки влияния оксида азота при эндометриозах кроликов»

Дата выдачи задания «___» _________ 20__ г  Руководитель ____________/Ленченко Е.М./
                                                                                                            (подпись)
  
Задание принял к выполнению «___» ______ 20__ г Студент ________/ Христидис Я.И./
                                                                                                                                                    (подпись)

КАЛЕНДАРНЫЙ ПЛАН

№ п/п
Наименование этапа (раздела) работы
% 
от общего объема
Рабочие недели



1
2
3
4
5
1
Изучение литературных данных по теме работы
20





2
Определение объектов исследования
15





3
Отработка методов исследования
5





4
Экспериментальные исследования
30





5
Обработка экспериментальных данных  и анализ результатов исследования
20





6
Оформление дипломной  работы
10





7
Подготовка к защите

10






На основании результатов рассмотрения представленного материала допустить дипломную работу к защите.

Заведующий кафедрой «Ветеринарная медицина» _______________ Уша Б.В.

      
АННОТАЦИЯ
     Христидис Яна Игоревна, студент 5 курса группы 13-ВС-2/1
     Дипломная работа на тему: «Разработка лабораторной модели для оценки влияния оксида азота при эндометриозах кроликов» содержит 91 страниц текста, рисунков – 12, таблиц – 9, использованных источников – 149.
     Ключевые слова: эндометриоз, оксид азота, лабораторная модель, динитрозольный комплекс железа с тиоловыми лигантами.
     Объект исследования: лабораторные крысы линии «Wistar», кролики.
     Предмет исследования: апробация, изыскание, сравнительная оценка влияния ДНКЖ с глутатионом и гормона на индуцированный эндометриоз у крыс.
     Целью работы изучение влияния экзогенных динитрозильных комплексов железа с глутатионом на модель эндометриоза у крыс с оценкой возможности применения этих комплексов для лечения эндометриоза, и сопоставлением их действия с влиянием естественного гормонального регулятора — фолликулярного гормона ингибина. 

     Научный руководитель: д-р вет. наук, проф. Ленченко Екатерина Михайловна
     Рецензент: д-р биол. наук, проф. Удавлиев Дамир Исмаилович
     
     
     
     
     
     
СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ
6
Глава 1.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
8

1.1. Этиология
8

1.2. Патогенез
12

1.3. Диагностика эндометриоза
16


1.3.1. Клинико-морфологические признаки
16


1.3.2. Инструментальные методы исследований
18

1.4. Лечение
19

1.5. Влияние оксида азота на развитие эндометриоза
19

1.6. Влияние ингибина на развитие эндометриоза
28
Глава 2.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
30

2.1. Материалы и методы
30


2.1.1. Экспериментальная модель эндометриоза
30


2.1.2. Приготовление ДНКЖ и образование NO комплексов ингибина
32


2.1.3. Наблюдение поведенческих реакций
35

2.2. Результаты исследований
38


2.2.1. Воздействие ингибина на течение эндометриоза
38


2.2.2. Воздействие ДНКЖ с глутатионом на течение эндометриоза
56


2.2.3.Исследования методом ЭПР-спектроскопии


2.3. Обсуждение полученных результатов

Глава 3
ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ


ВЫВОДЫ


ЗАКЛЮЧЕНИЕ


СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность. Эндометриоз является широко распространенным и социально значимым заболеванием. Несмотря на большое число исследований, посвященных проблеме эндометриоза, до сих пор остаются невыясненными многие вопросы происхождения, патологии, клинических особенностей, диагностики и лечения этого заболевания. В настоящее время единственным методом лечения является хирургический, комбинируемый с терапией гормональными препаратами. Однако эти методы дают много осложнений, оставляют высокую вероятность рецидива заболевания (до 60% случаев). Гормональные лекарственные средства дорогостоящи, обеспечивают лишь временные клинические эффекты и обладают нежелательными побочными действиями [И.А. Адамян, 2003, А.Н. Стрижаков, 2006].                  
     Проблема эндометриоза является также актуальной проблемой и для ветеринарии. У кроликов, лошадей и крупного рогатого скота хронический эндометрит (инфекционный воспалительный процесс во внутреннем слизистом слое матки) часто осложняется эндометриозом [Katkiewicz, 2011]. Если в крупных хозяйствах животное предпочитают не лечить, а сразу выбраковывать, то в случае заболевания ценного производителя бесплодие или смерть могут быть недопустимы. Также болевой синдром и постоянный стресс приводят к существенному снижению продуктивности, в данном случае терапия становится необходимой. Для экзотических и домашних животных (особенно эндометриозом страдают приматы [D'Hooghe, 1996]) убой также неприемлем. 
     Оксид азота — высокоактивное низкомолекулярное соединение, вырабатывающееся в живых организмах ферментативным путем. Это важный универсальный фактор регуляции биохимических и физиологических процессов: служащий нейромедиатором, управляющий релаксацией сосудов, деятельностью иммунных клеток и регулирующий активность множества сигнальных путей в различных клетках. Причем обусловленные им эффекты могут быть весьма многообразны, а зачастую противоположны для разных концентраций, типов клеток и других параметров. Из вышеизложенного следует необходимость разработки принципиально новейших подходов к терапии эндометриоза. Одним из таких подходов возможно применение универсальных эндогенных регуляторов, например, монооксида азота (NO) и его стабильных комплексов с железом. 
     Цель работы: изучение влияния экзогенных динитрозильных комплексов железа с глутатионом на модель эндометриоза у крыс с оценкой возможности применения этих комплексов для терапии эндометриоза, и сопоставлением их действия с влиянием естественного гормонального регулятора — фолликулярного гормона ингибина.
     Задачи исследования:
     1. Оценить концентрацию эндогенных динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ) и оксида азота в органах и тканях крыс с модельным эндометриозом;
     2. Исследовать воздействие низкомолекулярных ДНКЖ с тиоловыми лигандами на течение экспериментального эндометриоза на разных стадиях;
     3. Определить количество восстановленных тиоловых групп в белке ингибине, для оценки степени его нативности и использования его в качестве гормонального лечебного средства.
     4. Исследовать воздействие гормона ингибина на течение экспериментального эндометриоза у крыс.




ГЛАВА 1.  ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Этиология  
     Эндометриоз – хроническое, рецидивирующее заболевание, формирующееся на фоне гормональных и иммунных нарушений, состоящее в разрастании очагов, сходных по строению с эндометрием, за пределами нормальной локализации слизистой оболочки тела матки [В.А. Стрижаков, 1996]. Эндометриоидные очаги чаще всего возникают на брюшине, кишечнике, мочевом пузыре, в легких и других органах. Так называемый «внутренний эндометриоз», или аденомиоз, в последнее время стал считаться отдельным заболеванием, ввиду существенных отличий в клинической картине, диагностике, лечении и профилактике. 
     Эндометриоз – является также актуальной проблемой и для ветеринарии. У кроликов, лошадей и крупного рогатого скота хронический эндометрит (инфекционный воспалительный процесс во внутреннем слизистом слое матки) часто осложняется эндометриозом [Katkiewicz, 2011]. Если в крупных хозяйствах животное предпочитают не лечить, а сразу выбраковывать, то в случае заболевания ценного производителя бесплодие или смерть могут быть недопустимы. Также болевой синдром и постоянный стресс  приводят к существенному снижению продуктивности, в данном случае терапия становится необходимой. Для экзотических  и домашних животных (особенно эндометриозом страдают приматы [D'Hooghe, 1996]) убой также неприемлем. 
     Из вышеизложенного следует необходимость разработки принципиально новейших подходов к терапии эндометриоза. Одним из таких подходов возможно применение универсальных эндогенных регуляторов, например, монооксида азота (NO) и его стабильных комплексов с железом. 
     Разнообразие локализации эндометриоза обусловливает большое количество возможных гипотез о его происхождении. Существенное число концепций стараются разъяснить с разных позиций возникновение и развитие этого заболевания.
            1. Теория  целомической метаплазии R. Meyer (1903 г.) предполагает, что эмбриональные клеточные элементы, располагающиеся между зрелыми клетками серозного покрова брюшины, могут трансформироваться в эпителий матoчно-трубнoгo типа, и образовывать фокусы эндометриоидоподобных желез и стромы. Другими словами, очаги эндометриоза могут происходить из мультипoтентных клеток мезотелия брюшины.
     2.  Нарушение эмбриогенеза с аномальными остатками. Эмбриональная теория возникновения эндометриоза предполагает его формирование из остатков мюллерoвых протоков и первичной почки. В подтверждение дизонтогенетической гипотезы ученые приводят случаи сочетания эндометриоза с врожденными аномалиями половой системы, желудочно-кишечного тракта. Несмотря на то, что отсутствуют факты обнаружения в постнатальном периоде мюллерoвских пороков.
     3. Имплантациионная теория, предложенная J.F. Sampson в 1921 г. Предполагается, что возникновение очагов эндометриоза происходит в результате ретроградного заброса в брюшную полость жизнеспособных клеток эндометрия, которые были отторгнуты во время менструации, и в последствии имплантировались на брюшину и окружающие органы. Частными аспектами транспортной концепции являются лимфогенная и гематогенная теории, акцентирующие внимание на метастазировании очагов по кровеносным и лимфатическим сосудам, что приводит к экстрагенитальному эндометриозу легких, кожи, мышц. Также не вызывает сомнений и возможность ятрогенной этиологии, когда диссеминация имеет место при хирургических манипуляциях, связанных со вскрытием полости матки.
     4. Нарушение гормонального гомеостаза, а именно расстройство гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы. В ряде научных работ замечено, что синдром неовулировавшего фолликула (ЛЮФ-синдром) также может способствовать возникновению эндометриоза. Опосредованную роль в развитии эндометриоидных очагов могут играть и дисфункции щитовидной железы.
     5. Нарушение иммунного баланса. Клетки эндометрия, при попадании в кровь и другие органы, представляют собой аутoантигены. Пролиферация эндoметриоидных клеток в других тканях может возникать в результате повышения уровня эстрогенов, способствующих секреции кортикостероидов. Последние в свою очередь, являются депрессантами, подавляющими местный клеточный и гуморальный иммунитет, и чем обеспечивают благоприятные условия для инвазии, развития и роста жизнеспособных клеток эндометрия. У больных эндометриозом наблюдается иммунодефицит, а именно снижение функций Т-лимфоцитов и NК-клеток.
     6. Концепция межклеточного взаимодействия, предложенная W.P. Damоwski, 1989, с видоизменением R.W. Shaw, 1994. Данная гипотеза, в сущности, представляет собой комбинацию имплантационной, гормональной и иммунологических теорий, каждая из которых взаимно объясняет слабые точки других. Эта концепция утверждает, что жизнеспособные эндометриоидные фрагменты ретроградно перемещаются через маточные трубы у всех, их имплантация или отторжение определяется функцией иммунной системы. В бришной полости они перераспределяются иммунной системой, представленной основным способом перитонеальными макрофагами. Эндометриоз может начинать развиваться в том случае, когда брюшинная распределительная система переполнена из-за возрастающего ретроградного передвижения эндометриоидных элементов. Эндометриоз возникает и тогда, когда брюшинная распределительная система имеет дефекты или несовершенна. Эктопическая эндометриальная пролиферация заканчивается возникновением аутoантител.
      Онкологический аспект эндометриоза является одним из наиболее спорных и неоднозначных. Сама возможность злокачественной трансформации бесспорна, однако частота ее вызывает разногласия. В первую очередь, отсутствует точная оценка частоты самого эндометриоза. С одной точки зрения, эндометриоз проявляет довольно высокую степень малигнизации — 11-24%, а заниженные оценки в литературе вызваны тем, что раковые новообразования поглощают предшествующие тканевые структуры и, следовательно, мешает диагностированию поэтапных изменений малигнизированных очагов эндометриоза. Сторонники противоположной точки зрения указывают на неточности в терминологии: так, диагноз «эндометриоидная карцинома» (наиболее частое злокачественное новобразование эндометриоидного происхождения, встречается в 75% случаев эндометриоидного рака яичников и в 66% при внеяичниковой локализации) вовсе не означает, что возникновению данной опухоли обязательно предшествовал эндометриоз или эндометриоидная киста яичника, а стромальная эндометриоидная саркома имеет предшественником эндометриальную строму, а не эндометриоз. Таким образом, по их мнению, степень маглинизации эндометриоза не превышает 1%. По-видимому, не стоит излишне преувеличивать вероятность злокачественного перерождения эндометриоза [А.Н. Стрижаков, 2006].
    Среди известных факторов риска по возникновению эндометриоза ведущей ролью является гормональные и иммунологические патологии, к менее значимым этиологическим факторам причисляют ожирение,  поздние роды, роды с осложнениями, аборты, позднее наступление менархе [А.Н. Стрижаков, 2006].


1.2. Патогенез
     Распространено мнение, что эндометриоидные процессы являются нормальным физиологическим явлением. Из этого вытекает вопрос, что является границей между таким состоянием и эндометриозом как заболеванием, и что может приводить к патологической степени процесса. Кроме того, широко распространено явление «доброкачественного», бессимптомного эндометриоза, когда образование эндометриоидных очагов не приводило к болевому синдрому, бесплодию и другим выраженным последствиям. Таким образом, отнесение этого бессимптомного процесса к патологии или нормальному явлению неоднозначно [А.Н. Стрижаков, 2006]. Кроме общих признаков иммунодефицита и аутоиммунизации, существуют и другие причины, определяющие возможность инфильтрации эндометриоидных фрагментов. Установлена важная роль в возникновении и анатомической локализации эндoметриоза генетических факторов [И.А. Адамян, 1998]. Основываясь на экспрессии биохимических генетических маркeров возможно установить наличие или отсутствие предрасположенности к эндометриозу или уже развившейся болезни [Kobayashi, 2009].
     Распределение и перемещение поврежденных тканевых фрагментов, в   том числе и эндометриальных клеток, осуществляется тканевыми макрофагами. Так же известно, что, кроме фагоцитарной деятельности, брюшинные макрофаги регулируют местные процессы, в том числе те, которые относятся к репродукции, путем высвобождения простагландинов, протеаз, цитокинов, факторов роста, инициирующих воспалительный процесс в ответ и повреждения тканей. Увеличение концентрации простагландинов в плазме крови предрасполагает к развитию болезни, и влияет на пролиферацию и дифференцировку клеток эндометриоидной ткани. Простагландины, возможно, способствуют росту эндометрия, демонстрируют ключевые клинические симптомы — дисменорею и бесплодие. Другими факторами, влияющими на эндометрий, являются цитокины и факторы роста. При эндометриозе в перитонеальной жидкости увеличивается концентрация таких цитокинов, как интерлейкин-1, интерлейкин-6, основными продуцентами которых являются макрофаги [А.И. Ищенко, 2002]. Также цитокины замыкают цепь обратной связи, вовлекая в процесс новые медиаторы. Таким образом, интерлейкин-1 индуцирует синтез простагландинов, влияет на стимуляцию пролиферации фибробластов, на накопление коллагена и образование фибриногена, т. е. процессы, которые  способствуют образованию фиброза спаячного процесса сопутствующего эндометриозу. Кроме того он также стимулирует пролиферацию В-клеток и индукцию возникновения аутоантител. Высвобождение факторов роста дополняется эффектом других действующих агентов, способствует не только лишь пролиферации, а так же и дистрофическим изменениям в тканях. Также имеет место интракринное действие факторов роста, когда они не секретируются, а остаются в клетке и регулируют внутриклеточные процессы. Процессу накапливания факторов роста и цитокинов способствует то, что они также могут вырабатываться в атакуемых макрофагами клетках тканей [Piva, 2001], прежде всего в эпителиальных клетках и фибробластах. 
     Уровень рецепции исследованных материалов показал снижение рецепторной активности по мере удаления эндометриоидного очага от матки. Следовательно, воздействие гормонов на клеточные элементы очагов эндометриоза не прямое, а опосредованное активацией факторов роста и других элементов паракринной системы [А.Н. Стрижаков, 1996].
     Процессы пролиферации эндометриоидных очагов и образования спаек регулируются с одной стороны цитокинами (IL-1, IL-5), факторами роста (TGF?, IGF, HGF) и белками-протоонкогенами (с-myc, с-fos, с-bcl). С другой стороны выступают антионкогены и проапоптотические факторы, к примеру, p63.
     Помимо врожденных генетических дефектов, возможным фактором возникновения недостаточности иммунитета и гормонального дисбаланса, дающего возможность развития эндометриоза, все чаще называют окислительный стресс [S. Guptа, 2008]. Факторами, его обуславливающими, предпологают неправильное питание, неблагоприятную экологическую обстановку, хронические восполения.
     Активные кислородные метаболиты, подобные гидроксильным радикалам, перекиси водорода, супероксидным анион-радикалам и другим, представляют весьма важную роль в обмене веществ. В низких концентрациях они играют значимую роль сигнальных молекул, регуляторов физиологических процессов. Но при недостаточности либо при перегруженности сдерживающих их антиоксидантных систем организма, при значительном повышении концентраций активных кислородных метаболитов, на первый план выступает их разрушающая роль. Так как активные кислородные метаболиты являются нестабильными и сильными окислителями, они атакуют большинство биомолекул, в том числеп и липиды, белки, нуклеиновые кислоты и пр., инициируя различные формы повреждения клеток. Подобное состояние ткани организма и называется окислительным стрессом [Зентов, 2001]. Ключевая значимость в генерации активных кислородных метаболитов отводится реакции Фентона — разложению перекисей при наличии металлов переменной валентности с возникновением высокореакционных гидроксильных радикалов. Следовательно, причиной окислительного стресса и последующей воспалительной реакции может быть нарушение метаболизма и депонирования железа [И.А. Адамян, 2008, Kobayashi, 2009]. Таким образом, фактором дальнейшего злокачественного перерождения опухоли также обусловливается окислительным стрессом из за избытка свободного железа [Yamaguchi, 2008].
     При условиях окислительного стресса в тканях возможно возникновение воспалительного ответа, приводящего к изменению функции системы иммунитета и еще более сильному ухудшению антиоксидантного статуса ткани. Что приводит к повышению выживаемости и способности к росту спонтанно возникающих эндометриоидных очагов [S. Gupta, 2008].
     Иммунный ответ проявляется в активации в первую очередь B-лимфоцитов и брюшинных макрофагов. В макрофагах и полиморфноядерных лейкоцитах возникает так называемый «окислительный взрыв»: секреция в больших объемах супероксид-аниона и монооксида азота, которые служат основой цитотоксической функцией данных клеток [Vаn Lаngendonckt, 2002]. При эндометриозе показана завышенная экспрессия постоянных продуцентов этих радикалов: ксантиноксидазы [Ota, 2002] и индуцибельной NO-синтазы [Yeo, 2013], соответственно. B-лимфоциты в свою очередь продуцируют аутоантитела к тканям эндометрия [Muse, 1982, Wilson, 1982]. Данное осложнение окислительного стресса является излишней активностью макрофагов и аутоиммунной реакцией, которая наносит вред в первую очередь нормальному эндометрию, что опосредованно способно приводить к бесплодию [Wаng, 1997]. Кроме того отмечают иммунодефицит Т-клеток и естественных киллеров [Otа, 2002], что упрощает имплантацию и разрастание эндометриоидных фрагментов [А.И. Ищенко, 2002].
     Однако в имплантируемых эндометриоидных очагах настолько интенсивный воспалительный ответ действует скорее благоприятно. Сами Эндометриоидные клетки и активированные макрофаги производят цитокины, простагландины и факторы роста,  которые после срабатывания внутриклеточных сигнальных каскадов приводят к действию транскрипционныех факторов. Экспрессия контролируемых ими генов приводит к увеличению выживаемости, стимуляции ангиогенеза, роста, эндометриоидных клеток, пролиферации, противодействия апоптозу [Kobayashi, 2009]
1. 3. Диагностика эндометриоза
     1.3.1. Клинико-морфологические признаки
     Эндометриоз – доброкачественный патологический процесс, который характеризуется разрастанием ткани, похожей по структуре и функции с эндометрием. Эндометриоидные очаги обладают способностью к диссеминации и метастазированию, по кровеносным и лимфатическим сосудам проникют в другие органы и ткани. Макроскопически они представляют собой узлы, инфильтраты и кистозные образования, наполненные геморрагическим содержимым (т.н. «шоколадные кисты»). Деструктивное действие эндометриоза обусловлено разрастанием стромы, она может сдавливать нервные окончания, вызывая боль; спаечные процессы в матке и образование кист в яичниках может привести к бесплодию. Другой причиной бесплодия может стать активная секреторная деятельность эндометриоидных образований, в частности, простагландина F2?. 
     Однако эндометриоз не обладает свойствами истинных опухолей, такими как: атипизм клеток, прогрессивный автономный рост, отсутствие связи клинических проявлений с состоянием гормональной функции. Таким образом, эндометриоз является дисгормональным опухолевидным процессом, обладающим способностью к инфильтративному росту и, в редких случаях, метастазированию [А.Н. Стрижаков, 2006]. 
     За последние пятьдесят лет было предложено около пятнадцати различных систематизаций и классификаций эндометриоза. На сегодняшний день самой распространенной является классификация Американского общества фертильности, пересмотренная в 1985г., которая базируется на оценке лапароскопических данных. Несомненно, что накопление новой информации и сведений об патогенезе и этиологии эндометриоза, клинических, структурных, биологических, функциональных, иммунологических, генетических вариантах данного заболевания даст возможность предложить новые классификации. 
     Согласно классификации J.F. Brоsens (1993)   различают 3 типа поражений гистологических структур: 
         1. Слизистый с жидким содержимым - представляет собой  поверхностные поражения яичника или эндометриоидные кисты; 
         2.  Перитонеальный - диагностируется микроскопически по активным   эндометриоидным участкам (красные, железистые или пузырьковидные, прорастающие в глубь тканей, черные, складчатые и регрессирующие — белые, фиброзные), наблюдающиеся чаще всего в репродуктивном возрасте; 
         3. Узловой — аденома, локализуется между фиброзной тканью и гладкомышечными волокнами, в основном выявляется в ректовагинальной перегородке и связочном аппарате матки. 
     Большинство авторов связывают характерные черты клинических симптомов болезни с глубиной прорастания эндометриоидных имплантатов в подлежащие ткани (яичники, миометрий, параметрий, стенки кишки, мочевой пузырь, брюшину и др.). Глубоким эндометриозом считают очаги, инфильтрирующие пораженную ткань на глубину больше, чем 6мм.                   [И.А. Адамян, 1998]. 
     Гистологически эндометриоидные очаги весьма сходны по строению с нормальным эндометрием: состоят из железистого эпителия и цитогенной стромы. Стоит заметить, что соотношение стромы и железистого эпителия  в эндометриоидных гетеротопиях разной локализации разнообразно. Вне зависимости от размеров и локализации эндометриоидных очагов эндометриоз  гистологически характеризуется доброкачественной пролиферацией железистого эпителия и может напоминать функционирующие железы стромы эндометрия. 
   
   
   1.3.2. Инструментальные методы исследований
     «Золотым стандартом» в диагностике эндометриоза все также остается метод лапароскопии. Лапароскопия – это непростой метод диагностики,                  во время которого специальный инструмент (лапароскоп) посредством небольшого надреза в передней абдоминальной стенке вводят                                         в брюшную полость и исследуют ее на присутствие                                        островков эндометрия. При эндометриозе зоны разрастания                                        эндометрия на брюшине напоминают плоские островки                                              темно-красного цвета. Для подтверждения диагноза эндометриоза                         берется участок подозрительного островка (биопсия)                                                      и проводится его гистохимическая диагностика. 
     Гистологическое исследование эндометриоза базируется                                              на идентификации цилиндрического эпителия и подэпителиальной стромы, похожие на подобные составляющие слизистой оболочки матки.
     Другие инструментальные исследования, например, УЗИ, компьютерная томография, гистерoсальпингoграфия, МРТ, магнитно-ядерный резонанс возможны для использования при                                         диагностике эндометриоза, однако не всегда позволяют поставить точный диагноз. УЗИ при эндометриозе помогает выявить присутствие кист в яичнике, но их природа подтверждается только при проведении биопсии. Обычной осмотр в отдельных случаях позволяет подозревать                             эндометриоз, в особенности, если заболевание развивалась                                          на влагалищной части шейки матки либо непосредственно                                            во влагалище. Также возможно проведение исследования                                              крови на специальные опухолевые маркеры                                             (онкомаркеры) [И.А. Адамян, 1998, А.И. Ищенко, 2002, А.Н. Стрижаков, 1996].


1.4. Лечение 
     Единственным способом терапии эндометриоза в наше время                         является хирургическое вмешательство, непосредственно                          хирургическое удаление очагов эндометриоза посредством                      традиционной лапароскопии, а в отдельных случаях —                         ультразвуковой микрохирургии или электродеструкцией.                                   Однако микроскопические очаги хирургически полностью                            устранить невозможно. Помимо этого, как уже было с                                            казано выше, эндометриоз чаще является «болезнью образа жизни»,                          и ничто не может исключать образования новых очагов.                               Согласно этим причинам заболевание отличается                                             достаточно высокой частотой рецидивов, и требует                                       комплексный послеоперационный курс лечения. Таким образом, при лапароскопии в 60% случаев наблюдается рецидив болезни,                                           в 40% — бесплодие. Прямое воздействие гормональных                           лекарственных препаратов — ингибиторов гонадотропина и                    прогестагeнов (даназола, гестринона и т. п.) практически                                     неэффективно, в связи с низким количеством соответствующих                          рецепторов в эндомeтриоидных клетках; агонисты                                гонадолибeрина (напpимер, Дифeрелин) немного более эффективны.                   В это же время применение гормональных препаратов можно                                   связать со значительными побочными эффектами и осложнениями                         [Адaмян, 1998, А.Н. Стрижаков, 1996]. Иной п                                                        одход лечения — нормализация воспалительной реакции,                                           что возможно достигнуть с помощью применения                               иммуномодуляторов (пентоксифиллинa). Кроме того предлагают                прямое введение антиоксидантов [Portz, 1991].


1.5. Влияние оксида азота на развитие эндометриоза
    Оксид азота NO является парамагнитныим газом с одним неспаренным электроном на внешнеи? разрыхляющеи? ?-орбитали, это обусловливает его достаточно высокую реакционоспособность. Он легко растворим в воде (4,6мл/100мл), при этом липофилен и легко диффундирует в биологических средах. Является достаточно долгоживущим в биологических тканях (среднее время жизни 5,6 с). С учетом времени жизни в физиологическои? среде и скорости диффузии, дальность деи?ствия NO• составляет в среднем 100- 200мкм. Образует постоянные (время жизни 40мин при 37 ?С) комплексы с гемоглобином и вступает в реакции S-нитрозилирования с тиолсодержащими белками, образуя S-нитрозотиолы. Таких белков обнаружено порядка 2500. Таким образом он может транспортироваться в организме, деи?ствуя  эндокринным регулятором. [Ищенкo, 2002]. 
    Аспекты биологического деи?ствия NO: 
      1. Является неи?ромедиатором в центральнои? и периферическои? нервнои? системе; 
      2. Идентифицируется с эндотелиальным фактором релаксации сосудов (EDRF), расслабляющим гладкую мускулатуру, предотвращающим агрегацию тромбоцитов и адгезию неи?трофилов; 
      3. Является основой микробицидного и противоопухолевого деи?ствия фагоцитов;
      4. Регулирует все реакции окислительного фосфорилирования и продукцию АКМ в митохондриях; 
      5. Регулирует активность многих ферментов, концентрацию внутриклеточного Са2+, потребление и транспорт О2 в клетках; 6. является ингибитором свободных радикалов [А.Ф. Ванин, 2001]. 
Синтез NO в организме осуществляется осуществляется цитохром-Р450-подобными гемопротеинами – NО-синтазами (КФ1.14.13.39, систематическое название «L- аргинин, НАДФН: кислород-оксидоредуктаза»). Субстратом служит L-аргинин, окисляемыи? до L-цитруллина и NО при участии NADF, FAD, FMN и тетрагидробиоптерина. Существуют три группы NО-синтаз: 
I тип – неи?рональная (nNОS) – содержится в неи?ронах, активируется глутаматом; II тип – индуцибельная (iNОS) – содержится в макрофагах, гепатоцитах, фибробластах, миоцитах и других клетках. Экспрессируется под действием фактора транскрипции NF-кВ в ответ на действие цитокинов, липополисахаридов, и усиленное производство АКМ, подавляется глюкокортикоидами, цитокинами, простагландинами, а также NО (обратная связь). III тип – эндотелиальная (eNОS) – содержится в эндотелиоцитах, эритроцитах, тромбоцитах, неи?трофилах, активируется под влиянием вазоактивных соединении? или сдвигового напряжения. 
Локализуются в клетке NO-синтазы в микросомах и митохондриях. В разных тканях и у разных видов встречается большое число различных разновидностей? NO-синтаз, значительно различающихся по строению, активности, взаимодействию с ингибиторами и специфическими антителами.
        Антимикробное действие. Синтез индуцибельнои? NO-синтазы в макрофагах и других клетках является основой? неспецифической? резистентности. Особое значение имеют свойства NO как антимикробнои? и противоопухолевои? системы, активной? в отношении грибов, бактерии?, вирусов, паразитов, опухолевых клеток и некоторых чувствительных клеток собственного организма. Цитотоксическии? эффект связывается с нитрозилированием железосерных групп в активных центрах ферментов с образованием окислов азота и пероксинитрита: 

В физиологических условиях в присутствии кислорода NO метаболизируется до стабильных анионов NO2— и NO3—, а также пероксинитрита, что также обеспечивает микробицидное и цитотоксическое действие [Miranda, 2001]. Пероксинитрит – сильный? окислитель, способен окислять SH-группы белков, инициировать ПОЛ, вызывать однонитевые разрывы ДНК, вызывает апоптоз, ингибирует агрегацию тромбоцитов. Кроме того, в кислых условиях в результате нефентоновскои? реакции он может служить источником гидроксильного радикала и синглетного кислорода. Таким образом, если при низких концентрациях NO действует как регулятор и антиоксидант, то в большои? концентрации его воздеи?ствие цитотоксическое и прооксидативное [Martinez, 2009]
    Аутотоксическое деи?ствие. Цитотоксическое деи?ствие NO• распространяется и на клетки и ткани  собственного организма. Особенно уязвимы в этом отношении ?-клетки островков Лангерганса. Повреждение их NO•, синтезируемым макрофагами и самими этими клетками, может приводить к диабету. Повышенныи? синтез NO при ишемии обуславливает смерть клеток [Осипов,2007]. Также могут повреждаться макрофаги, костномозговые предшественники, миобласты, гладкомышечные клетки и другие. Также NO• подавляет пролиферацию неи?трофилов и лимфоцитов. Основным.......................