Оценка антимикробного эффекта по результатам моделирования фотодинамической реакции in vitro

Оценка антимикробного эффекта по результатам моделирования фотодинамической реакции in vitro.

Г.М. Исмаилов1, Е.К. Словоходов2, В.И. Полсачев, В.И. Ярема1, Н.М. Николаев1

1Кафедра «Госпитальной хирургии» лечебного факультета ГБОУ ВПО «МГМСУ им. А.И. Евдокимова» Минздрава России;

2ГБУЗ Городская клиническая больница №40 ДЗ, Москва;



Резюме. Увеличение количества полирезистентных и высоковирулентных штаммов ведет к необходимости поиска альтернативных антибиотикотерапии методов воздействия. Изучено антимикробное действие на госпитальные штаммы фотосенсибилизатора, светодиодной лампы и их совместного влияния, путем моделирования фотодинамической реакции. В качестве фотосенсибилизатора использован Фотосенс в различных концентрациях. В роли источника света использована светодиодная лампа УФФ-630/675-01-«БИОСПЕК» с мощностью излучения 40 мВт/см2 и длиной волны 660-680 нм. Максимальный антимикробный эффект получен при совместном применении фотосенсибилизатора и облучения, при этом установлено оптимальное время облучения сенсибилизированных бактерий.

Ключевые слова: фотодинамическая терапия, госпитальная инфекция, фотосенсибилизаторы.



АНГЛ. Название



G.M. Ismailov, E.K. Slovokhodov, V.I. Polsachov, V.I. Yarema, N.M. Nikolaev 

Moscow State University of Medicine and Dentistry named after A.I. Evdokimov, department of hospital surgery

City clinical hospital #40, Moscow 



Abstract: 



Key words:



Сведения об авторах

Исмаилов Гаджимурат Магомедович – старший лаборант кафедры «Госпитальной хирургии» лечебного факультета ГБОУ ВПО «МГМСУ им. А.И. Евдокимова» Минздрава России. E-mail: ismailovmail@mail.ru

Словоходов Егор Константинович – канд. мед. наук, зав. кабинетом флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии городской клинической больницы №40

Полсачев Виктор Иосифович – д-р мед. наук, профессор

Ярема Владимир Иванович – д-р мед. наук, профессор кафедры «Госпитальной хирургии» лечебного факультета ГБОУ ВПО «МГМСУ им. А.И. Евдокимова» Минздрава России.

Николаев Николай Маркович – д-р мед. наук, профессор кафедры «Госпитальной хирургии» лечебного факультета ГБОУ ВПО «МГМСУ им. А.И. Евдокимова» Минздрава России.



Введение. Клинические и экспериментальные изыскания, направленные на улучшение результатов лечения нозокомиальной инфекции из года в год увеличиваются.  Решение вопроса устойчивости микроорганизмов к антибактериальным препаратам остается актуальным и значимым в медицине. В настоящее время предложено множество способов лечения гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей, альтернативных антибактериальной терапии [7,9,12]. Одним из альтернативных и перспективных является аппликационный метод фотодинамической терапии [3,5,10,11,14]. 

Метод фотодинамической терапии аппликационным способом основан на том, что патогенные микроорганизмы накапливают в себе краситель – фотосенсибилизатор [2]. В сенсибилизированных бактериях под воздействием энергии света соответствующей длины волны, развивается фотохимическая реакция с выделением чужеродных агентов (активная форма кислорода и свободные радикалы) оказывающих повреждающее действие на микроорганизмы, вызывая их гибель [1]. Ограничение практического применения аппликационного способа фотодинамической терапии обусловлено недостаточным количеством экспериментальных исследований в этой области.

По данным Толстых М.П., результаты изучения антибактериальной активности при облучении нелазерным источником света с длиной волны 600-700нм без использования фотосенсибилизатора, показали снижение жизнеспособности микроорганизмов в 20 раз [6]. Другой исследователь, изучая бактерицидную активность светодиодного излучения без фотосенсибилизатора, значимого эффекта ни в качественном, ни в количественном составе микроорганизмов не получил, диапазон длины волн использованных автором 675нм [4]. 

Противоречивость приведенных данных не решает проблему появления высоковирулентных и антибиотикорезистентных штаммов, приводя к росту числа больных с гнойными заболеваниями мягких тканей [8], а только подталкивает исследователей к поиску новых и совершенствованию существующих методов направленных на преодоление сопротивляемости микроорганизмов. 

Цель работы. Изучить in vitro фотохимическое воздействие на сенсибилизированные штаммы микроорганизмов, выделенных из послеоперационных ран осложнившихся развитием гнойно-воспалительного процесса.

Задачи. 1. Определить длительность облучения сенсибилизированных Фотосенсом бактерий для получения бактерицидного эффекта. 2. Изучить в отдельности бактерицидную активность облучения микроорганизмов светодиодной лампой, фотосенсибилизатора и их совместное влияние.

Материал и методы. В качестве объекта воздействия использовались наиболее значимые, вызывающие  нозокомиальную инфекцию, резистентные к антибиотикам, чистые культуры микроорганизмов. Из грамположительных: St. aureus, St. epidermidis, грамотрицательные:  Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, а так же грибы: Candida, Aspergillus. 

В качестве проникающего вещества выступал анионный синтетический фотосенсибилизатор II поколения Фотосенс, концентрат для приготовления раствора 2 мг/мл разработанный в ГНЦ «НИОПИК». Препарат предварительно разбавляли с физиологическим раствором и применяли в следующих концентрациях 500мкг/мл (1:4); 250мкг/мл (1:8); 200мкг/мл (1:10); 125мкг/мл (1:16). Для определения степени накопления Фотосенса в бактериях, использовали лазерный электроно-спектральный анализатор «ЛЭСА-6». Данная установка регистрирует флюоресценцию вещества. 

Для облучения бактерий и активации фотохимической реакции в сенсибилизированных штаммах использовалась светодиодная лампа УФФ-630/675-01-«БИОСПЕК» с диапазоном длины волн 660-680нм и мощностью излучения не менее 40 мВт/см2;.

Суточные агаровые культуры тест-организмов суспендировали в стерильной дистиллированной воде и доводили до плотности 5,0х106 КОЕ/мл. Питательную среду в чашках Петри засевали тест-культурами методом «газона», распределяли суспензию по поверхности питательной среды покачиванием.

Чашки Петри были поделены на 6 групп с разным временем облучения. В каждой группе по 4 чашки с разной концентрацией фотосенсибилизатора, всего 24 для одного вида бактерий.

Следует отметить, что наличие фотосенсибилизатора в бактериях, даже в небольшом количестве, при воздействии энергии света приводит к активации фотохимической реакции. Однако концентрация образующихся агрессивных элементов (активная форма кислорода и свободные радикалы), может произвести недостаточный антибактериальный эффект, а пролонгированное облучение приводит к выгоранию фотосенсибилизатора – фотобличинг. В связи с чем, наличие фотосенсибилизатора в бактериях должна достигать той концентрации, при которой возможно проведение фотодинамической реакции с антимикробным эффектом [2].

После регистрации флюоресценции определялось оптимальное время облучения для получения максимального антибактериального эффекта. Для этого сенсибилизированные микроорганизмы подвергались воздействию с помощью лампы УФФ-630/675-01-«БИОСПЕК» в течение 10, 20, 25, 30, 35 и 40 мин (табл. 1.)



Таблица 1. Концентрация Фотосенса и длительность облучения микроорганизмов

    Время облучения,

мин

Доза ФС

10 

(1группа) 

20

(2группа)

25

(3группа)

30

(4группа)

35

(5группа)

40

(6группа)

1:4

500 мкг/мл

*

*

*

*

*

*

1:8

250 мкг/мл

*

*

*

*

*

*

1:10

200 мкг/мл

*

*

*

*

*

*

1:16

125 мкг/мл

*

*

*

*

*

*

*5,0х106 ± 0,02   КОЕ/мл                            

Для раздельного изучения антимикробного действия светодиодной лампы, Фотосенса и их совместного влияния, проведено исследование на 4-х группах колоний чистой культуры, высеянных из послеоперационных ран осложненных гноеродной инфекцией. 

Непосредственно после облучения,  чашки  Петри   инкубировались  в  течение  18 - 24 ч, после чего проводилось количественное микробиологическое исследование в динамике.

Результаты и их обсуждение. После облучения грамположительных штаммов, антибактериальный эффект в одинаково высокой степени выявлен при концентрациях Фотосенса 500 и 250 мкг/мл и длительности светового воздействия не менее 25 мин, в остальных случаях количественный состав патогенной микрофлоры не изменился (табл. 2). 

Таблица 2. Доза Фотосенса и длительность облучения грамположительных штаммов

    Время облучения,

мин

Доза ФС

10 

20

25

30

35

40

125 мкг/мл

5,6х106*

4,8х106*

4,9х106*

7,2х106*

5,4х106*

6,4х106*

200 мкг/мл

5,9х106*

5,7х106*

6,3х106*

2,4х106*

2,9х106*

5,5х106*

250 мкг/мл

3,8х106*

6,7х106*

**

**

**

**

500 мкг/мл

6,4х106*

7,4х106*

**

**

**

**

*±0,5; **единичные колонии

При облучении грамотрицательных штаммов бактерицидное действие выявлено с 4-й по 6-ую группы с аналогичной предыдущему опыту дозой Фотосенса и временем воздействия не менее 30 минут, однако, не в такой яркой форме, как у грамположительной флоры (табл. 3). Видимо, это связано с некоторыми принципиальными различиями в строении клеточной  стенки  грамположительных и грамотрицательных бактерий, что требует  дальнейшего  изучения. В первой, второй и третьей группах, а так же в чашках с экспозицией фотосенсибилизатора в концентрациях 125 и 200 мкг/мл количественный состав колоний не изменился. 



Таблица 3. Доза Фотосенса и длительность облучения грамотрицательных штаммов 

    Время облучения,

мин

Доза ФС

10 

20

25

30

35

40

125 мкг/мл

5,9х106*

4,7х106*

3,9х106*

7,2х106*

5,4х106*

8,4х106*

200 мкг/мл

4,9х106*

5,4х106*

6,3х106*

2,4х106*

2,9х106*

5,5х106*

250 мкг/мл

3,3х106*

5,7х105*

8,9х105*

7,2х102**

5,4х102**

3,4х102**

500 мкг/мл

6,4х106*

7,2х105*

7,3х105*

6,4х102**

5,9х102**

5,5х102**

*±0,5; **±0,2

Таким образом, необходимое время облучения светодиодной лампой для получения бактерицидного эффекта фотодинамической реакции, для грампозитивных бактерий 25 мин, грамнегативных 30 мин, с дозой  Фотосенса не менее 250 мкг/мл.  

Нередко грибы входят как в ассоциации микроорганизмов инфекционного очага, так и могут быть первопричиной развития нозокомиальных инфекций [13]. В связи с чем, на данном этапе эксперимента исследовалось облучение грибов. Полученные результаты оказались схожими с таковыми у грамположительных штаммов. 

Максимальный антимикотический эффект данной группы получен при длительности облучения не менее 25 мин (табл. 4). 



Таблица 4. Доза Фотосенса и длительность облучения грибов

    Время облучения,

мин

Доза ФС

10 

20

25

30

35

40

125 мкг/мл

7,3х106*

5,6х106*

3,9х106*

6,7х106*

6,2х106*

6,9х106*

200 мкг/мл

5,9х106*

6,7х106*

6,9х106*

4,4х106*

3,9х106*

7,5х106*

250 мкг/мл

3,8х106*

6,7х106*

**

**

**

**

500 мкг/мл

5,8х106*

6,4х106*

**

**

**

**

*±0,5; **единичные колонии

Подтверждением приведенных данных является диагностика флюоресцентного сигнала грибов. Во всех шести группах после экспозиции с разведением раствора Фотосенса до 200 мкг/мл и 125 мкг/мл, зарегистрирована недостаточная для активации губительной фотохимической реакции концентрация Фотосенса. 

Анализируя данные первого этапа экспериментального исследования, установлено, что не зависимо от вида микроорганизма, максимальный антимикробный эффект получен через 30 минут облучения после экспозиции с Фотосенсом в концентрации 250 мкг/мл. Увеличение концентрации более 250 мкг/мл не приводит к увеличению его накопления в бактериях, а держится на определенном уровне.

 На следующем этапе экспериментальных исследований отдельно изучалось антибактериальное действие светодиодной лампы, Фотосенса и их совместное влияние (табл. №5-8). 

1 группа – 10 чашек с колониями чистой культуры (грамположительные, грамотрицательные, грибы) предварительно накопившие фотосенсибилизатор, подвергались воздействию светового излучения. Длительность облучения, как уже определено, составило 30 мин. 

2 группа - 10 чашек (аналогичных микроорганизмов), изучалось непосредственное воздействие светодиодного излучения с длиной волны 676 нм и мощностью излучения 40мВт/см2 в течение 30 мин, без нанесения фотосенсибилизатора на микрофлору. 

3 группа - по 10 чашек с микроорганизмами была необходима для исследования бактерицидного действия самого Фотосенса в концентрации 500 и 250 мкг/мл (без светодиодного воздействия).

4  группа – 10 чашек,  с целью контроля  устанавливалась  в  термостат  без  светодиодного  воздействия  или  добавления  Фотосенса.



Таблица № 5. Изменение количественного состава грамотрицательных палочек

          Воздействие



Штаммы,КОЕ/г

LbFs 30

Lb

Fs

Контроль

E.Coli 

3,4х102

4,4х106

2,4х106*

5,4х106

Enterobacter agglomerans 

2,1х102

7,4х105

3,4х105*

4,3х106

Klebsiella 

3,8х102

5,7х106

1,4х105*

5,9х105

*±1,5

Таблица № 6. Изменение количественного состава грамположительной флоры

Воздействие



Штаммы,КОЕ/г

LbFs 30

Lb

Fs

Контроль

St. aureus 

Единич. Колон.

4,4х106

3,9х106*

5,4х106

St. epidermidis 

Единич. Колон.

7,4х106

8,8х106*

6,3х106

Enterococcus 

Единич. Колон.

5,7х106

4,4х106*

7,1х106

*±1,5

Таблица № 7. Изменение количественного состава неферментирующих штаммов

Воздействие



Штаммы,КОЕ/г

LbFs 30

Lb

Fs

Контроль

Pseudomonas а. 

2,4х102 

2,4х106

5,9х106*

7,4х106

Acinetobacter sp.

3,4х102

5,1х106

6,8х106*

6,3х106

*±1,5

Таблица № 8. Изменение количественного состава грибов

          Воздействие                



Штаммы,КОЕ/г 

LbFs 30

Lb

Fs

Контроль

Candida 

Единич. Колон.

3,2х107

3,7х107*

3,4х107 

Aspergillus 

Единич. Колон.

4,1х107

3,4х107*

4,3х107

*±1,5



Примечание: 

Контроль – штаммы,  на  которые  не оказывалось какое-нибудь  воздействие. 

Lb – микроорганизмы, на которые воздействовали светодиодной лампой, без фотосенсибилизатора.

Fs – микробы, на которые воздействовали фотосенсибилизатором Фотосенс с концентрацией 500 и 250 мкг/мл, без лампы.

LbFs 30 – бактерии, подвергшиеся воздействию светодиодной лампы, после экспозиции с раствором Фотосенса с длительностью облучения 30 мин.



При  изучении  бактерицидной  активности Фотосенса и светодиодного  излучения в отдельности друг от друга, изменений в количественном  составе  микроорганизмов в обоих случаях не выявлено. 

Значимые изменения в количественном составе бактерий обнаружены при сочетании облучения и Фотосенса. Существенный губительный эффект зарегистрирован в грибах и грамположительных штаммах. 

Заключение. В результате экспериментального исследования, на основании полученных данных об эффективности фотодинамического воздействия на нозокомиальные  бактерии обоснован метод лечения гнойных ран. Бактерицидный  эффект  от  фотохимического  воздействия эффективен для грамположительных и грамотрицательных  штаммов, а так же грибов, только при сочетанном воздействии Фотосенса в концентрации 250 мкг/мл и облучения, с длительностью  проведения  последнего в течение 30 минут. Это позволяет применить аппликационную антимикробную фотодинамическую терапию нагноившихся послеоперационных ран с определенными параметрами, не учитывая видовую принадлежность бактерий и чувствительности к антибактериальным препаратам.  



Список литературы:

Васильев Н.Е., Огиренко А.П.  «Антимикробная фотодинамическая терапия». Лазерная медицина, 2002, т.6, вып.1, стр. 32-38.

Исмаилов Г.М., Словоходов Е.К. Накопление фотосенсибилизатора второго поколения грамположительными и грамотрицательными микроорганизмами в эксперименте // Хирург 2016г., №4. –С13-18.

Кулешов И.Ю. Лазерная фотохимическая терапия ран мягких тканей (гнойных, термических и огнестрельных) // Автореф. дисс. ... док. мед. наук Москва 2013г.; С. 20.

Лапченко А.А. Антимикробная фотодинамическая терапия в комплексном лечении гнойного воспаления околоносовых пазух: Дис. … канд. мед. наук. Москва, 2009г. -С.57.

Сагдиев Р.Д. Применение фотодинамической терапии в комплексном лечении гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей // Хирург 2016г. №4. –С19-22.

Толстых М.П. Проблема комплексного лечения гнойных ран различного генеза и трофических язв (экспериментально-клиническое исследование): Дис. … докт. мед. наук. Москва, 2002г. -С.113.

Шабловская Т.А., Панченков Д.Н. Современные подходы к комплексному лечению гнойно-некротических заболеваний мягких тканей // Вестник экспериментальной и клинической хирургии том IV, 2013г. №4. -С. 498-518.  

Шляфер С.И. Показатели деятельности стационарозамещающих форм организации медицинских помощи в Российской Федерации и результаты приема годовых статистических отчетов за 2008 год. М., 2009; 8.

Andersson JA, Fitts EC, Kirtley ML… New Role for FDA-Approved Drugs in Combating Antibiotic-Resistant Bacteria // Antimicrob Agents Chemother. 2016 May 23; 60(6):3717-29.

Carmello JC, Alves F, G. Basso F, de Souza Costa CA, Bagnato VS, Mima EGdO, et al. (2016) Treatment of Oral Candidiasis Using Photodithazine®- Mediated Photodynamic Therapy In Vivo. PLoS ONE 11(6).

Gitika B. Kharkwal, Sulbha K. Sharma, Ying-Ying Huang, Tianhong Dai, and Michael R. Hamblin, Photodynamic Therapy for Infections: Clinical Applications // Lasers Surg Med. 2011 September ; 43(7): 755–767.

Pereira R?ben F. and B?rtolo Paulo J.. Advances in Wound Care. May 2016, 5(5): 208-229.

Sardi J. C. O., L. Scorzoni, T. Bernard et al. Candida species current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. J. Med. Microbiol., 2013, 62: 10-24

Xiu-jun Fu, Yong Fang, and Min Yao Antimicrobial Photodynamic Therapy for Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infection // BioMed Research International 2013, 9 p........................