Особенности поведения Р-элементов в Р-М системе гибридного дисгенеза рода Drosophila

7



Оглавление

Введение…………………………………………………………………………………..

3

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………………………...

6

1.1 Мобильные генетические элементы и их роль в функционировании генома ...…...

6

1.2 Особенности поведения Р-элементов в Р-М системе гибридного дисгенеза рода Drosophila ..........................…………………………………………………………………

9

2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ……………..……………………….………………………...

16

2.1 Биология дрозофилы……………………………………………………………………

16

2.2 Содержание дрозофилы…………………………………………………………………

18

2.3 Линии D. melanogaster, использованные в работе……………………………………………..

18

2.4 Методы, применяемые в работе и их характеристика………………………………...

18

2.5 Статистическая обработка………………………………………………………………

19

Результаты……………………………………………………………………………….

21

ВЫВОДЫ……………………………………………………………………………………

28

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………………………..

29




Введение

Исследования роли и функциональных особенностей мобильных генетических элементов (МГЭ) в геномах эукариот исчисляются несколькими десятилетиями. С одной стороны, их рассматривают как внутриклеточные стресс-факторы, приводящие к необратимым изменениям генетического материала (двойным разрывам ДНК, мутациям). С другой, мутагенные свойства МГЭ могут являться источником адаптивной генетической изменчивости. Это связано со способностью МГЭ влиять на экспрессию генов, отвечающих за стрессоустойчивость организма. 

Известна еще одна особенность МГЭ — снижение количества их копий с возрастом, что благоприятно сказывается на эмбриональной выживаемости [9]. Данный факт открыт только для I-ретроэлемента, индуцирующий дисгенные нарушения по типу I-R. 

Влияние транспозиционной активности МГЭ, как одного из механизмов эпигенетической регуляции, на возраст-зависимые физиологические, онтогенетические, цитогенетические показатели мало изучено. На сегодняшний день доминирует мнение, что на генетическом уровне предрасположенность к заболеваниям зависит от изменений линейной структуры ДНК в результате мутаций, в основе которых лежат не только делеции, тамдемные дупликации, амплификация генов, но и транспозиции МГЭ [47][48]. В случаях одновременного воздействия внешнесредовых факторов и индукции МГЭ происходит увеличение темпа мутирования, числа генетических повреждений и, вследствие этого, возникновение определенных заболеваний. 

Drosophila melanogaster является удобным объектом исследования возраст-зависимых изменений дисгенной активности МГЭ поскольку имеет определенные генотипы (с наличием/отсутствием функциональных копий мобильных элементов), при комбинации которых можно произвести массовую индукцию транспозиций МГЭ.

Р-элементы представляют собой II класс транспозонов, характеризующиеся непосредственной транспозицией ДНК ? ДНК с участием транспозаз — ферментами, кодируемыми самими транспозонами. Перемещения Р-элементов происходят по механизму “разрезания и сшивания”, в результате которых возникают двуцепочечные разрывы ДНК [52]. Дестабилизируя, таким образом, геном, транспозиции Р-элементов приводят к нарушениям в функционировании клеток, что, в свою очередь, как мы предполагаем, может вызвать различные патологические процессы репродуктивной системы и преждевременное старение.

Отметим, что Р-элементы широко распространены в популяциях дрозофилы и имеют гомологов у позвоночных животных (Pgga, Pdre) и человека (Phsa).

В связи с этим цель настоящей работы заключается в изучении возрастной динамики транспозиционной активности Р-элементов у дисгенных особей Drosophila melanogaster.

Для осуществления поставленной цели необходимо решить следующие задачи: 

Исследовать влияние индуцированной активности Р-элементов на возраст-зависимый показатель — плодовитость, включая  относительную ее величину.

Оценить возраст-зависимую динамику транспозиционной активности Р-элементов в системе Р-М гибридного дисгенеза по основным параметрам морфологического анализа репродуктивной системы (стерильность и уровень овариального резерва).

Изучить действие возрастной динамики дисгенной активности Р-элементов на эмбриональную смертность.

По полученным результатам дать общую оценку возраст-зависимого изменения индуцированной транспозиционной активности Р-элементов у D. melanogaster.




1 Обзор литературы

1.1 Мобильные генетические элементы и их роль в функционировании генома

Мобильный элемент (transposable element) - элемент генома, способный перемещаться из сайта в сайт, либо в процессе прямого вырезания вставки ДНК (по крайней мере, в прокариотах), либо путем транскрипции элемента, обратной транскрипции образовавшейся РНК с образованием ДНК-копии и ее внедрением в другое место генома.

Мобильные генетические элементы (МГЭ), или «прыгающие гены» были открыты в 1947 г. Барбарой Мак-Клинток, американской исследовательницой, при изучении наследственности у кукурузы. Но долгое время её открытие не признавалось научным сообществом. Сложно было предположить, каким образом участок хромосомы покидает свое место и переходит совсем на другое в той же или даже в другой хромосоме, и при этом хромосома не теряет своей целостности. Но в середине 70-х годов советские ученые Г.П. Георгиев и В.А. Гвоздев обнаружили "прыгающие гены" у дрозофилы. Таким образом, открытие Мак-Клинток получило подтверждение. Кроме того, было показано, что прыгающие гены есть не только у кукурузы. В дальнейшем такие гены были открыты и у других организмов. Сами по себе они не кодируют каких-либо белков, поэтому и называть их генами можно лишь с большой натяжкой. Термин мобильные генетические элементы (МГЭ) гораздо точнее, но название "прыгающие гены" более выразительно. Когда «прыгающий ген» встраивается внутрь какого-то обычного гена, он нарушает его работу, иными словами, вызывает мутацию нормального гена. Когда прыгающий ген уходит на другое место, мутация исчезает, и возобновляется нормальная работа гена. Существует гипотеза, согласно которой предшественником мобильных генетических элементов была вирусная ДНК, так как многие вирусы могут как встраиваться в ДНК клетки хозяина, так и покидать ее.

С середины прошлого века стали накапливаться данные о существовании большого числа мобильных генетических элементов, присутствие которых в геноме не является обязательным, а их топография и количество могут меняться в различных клетках, тканях и у разных организмов [42]. У прокариот такие генетические последовательности были названы транспозонами.

Характерная особенность МГЭ заключается в их способности находиться как в интегрированном с хромосомой виде, так и в виде отдельных макромолекул - эписом, плазмид, вирусных частиц.

Считают, что МГЭ, в частности Р-элементы, являются причиной большинства спонтанных мутаций, при этом они способны выззывать мутации сразу в нескольких генах, поставляя разнообразный материал для отбора [11].

На данный момент известно, что геном D. melanogaster содержит около 50-ти различных семейств МГЭ, которые вместе составляют до 30% генома и обнаружены в клетках млекопитающих, насекомых, высших растений, бактерий, дрожжей и грибов [29][30][34][20]. У человека ДНК транспозонного происхождения составляет более 42%, и геномные перестройки, сопровождающие перемещение транспозонов, могут вызывать такие болезни, как рак груди и гемофилия [36][50]. Число копий элементов отдельных семейств варьирует от нескольких до сотни у разных видов и линий, более того, характер распределения их в хромосомах наследуется в ряду поколений и связан с уровнем приспособленности особей [2]. При активации мобильные элементы могут оказывать большое влияние на функционирование генома, а также на генетическую изменчивость и видообразование [21][38][8].

К мобильным генетическим элементам генома рода Drosophila можно отнести Р-элемент, интерес к которому очень велик. Р-элемент был выделен Рубиным и соавторами в составе локуса white. Р-элемент может варьировать по длине. Основным элементом является последовательность длиной в 3 т.н.п. Из неё в результате простой делеции центрального участка могут возникать малые Р-элементы от 0,5 до 1,6 т.н.п. Однако, концы всех элементов гомологичны - это инвертированные повторы, содержащие 31 нуклеотид. Есть мнение, что инвертированные повторы являются сайтами узнавания транспозаз. Для Р-элемента, как и для других типов мобильных элементов, характерна множественная варьирующая локализация.

В настоящее время еще рано говорить о подробном сравнительном анализе структуры различных семейств мобильных генетических элементов у D. melanogaster. Данные по структуре многих семейств мобильных генетических элементов являются далеко не полными. Несмотря на это, в структуре различных типов МГЭ прослеживается определённое сходство. Почти для всех мобильных элементов характерно наличие центрального района, который с обеих сторон окружён повторяющимися последовательностями различной длины, вовлечённые, вероятно, непосредственно в процесс транспозиции.

Мобильные генетические элементы являются неотъемлимым компонентом генома человека. Они принимают участие в процессах мутагенеза и рекомбинации, активны при образовании делеций, инсерций и хромосомных перестроек, что в свою очередь приводит к появлению наследственных и соматических заболеваний человека.

Показано, что присутствие нестабильных повторов внутри генов изменяет и их функциональную активность. Так, нестабильные ДНК-элементы недавно идентифицированы как основа болезни, по крайней мере, в случае четырех наследственных заболеваний: синдрома фрагильной Х-хромосомы, синдрома Кеннеди, миотонической дистрофии  и болезни Хантингтон. Указанные заболевания связаны с мутациями нестабильных тринуклеотидных повторов в результате их амплификации в 3'- или 5'-нетранслируемых участках соответствующих генов [12].

1.2 Особенности поведения Р-элементов в Р-М системе гибридного дисгенеза рода Drosophila

Открытие Р-элементов как мобильных факторов, ответственных за Р-М систему гибридного дисгенеза у дрозофилы, было опубликовано в нескольких статьях [39][28][51][56]. Эти мобильные элементы активируется в Р-линиях (Paternal contributing) на фоне цитоплазмы линий М-цитотипа (Maternal contributing). Это говорит о том, что в системах гибридного дисгенеза имеется механизм цитоплазматической регуляции транспозиций мобильных элементов, наследуемый по материнской линии [6; 7]. Кроме того, в процессе дисгенных скрещиваний резко возрастает не только скорость перемещений Р-элементов, но и индуцируется перемещение других мобильных элементов генома [54][44][45].

Обнаружено избирательное сродство Р-элемента к ряду локусов и, прежде всего, к локусу singed [27]. Причем в природных популяциях дрозофилы мишенями для транспозиций Р-элемента могут являться гены hps70. Известно, что промоторы генов hps70 являются «горячей точкой» для инсерций Р-элемента, который встраивается в свободные от нуклеосомной организации участки ДНК, обогащенные CG-повторами. И, наконец, М.Д. Голубовский и Е.С. Беляева установили, что более 50% выделенных из природы нестабильных аллелей локуса оказались связанными с внедрением Р-элемента [4; 5].

На данный момент известны три независимые системы гибридного дисгенеза, которые обусловленные активностью мобильных элементов Р, I и hobo [39][23]. Мы обратили внимание на Р-М систему гибридного дисгенеза, т.к. в природных популяциях дрозофилы она занимает ведущее место среди других генетических систем и обладает рядом особенностей, а именно наличием кроссинговера у самцов, у которых он в норме не происходит [48] . Синдром гибридного дисгенеза (ГД) представляет собой комплекс генетических нарушений, включающих высокий уровень мутаций, рекомбинаций, а также нерасхождение хромосом в мейозе и стерильность особей. При этом транспозиционная активность мобильных элементов индуцируется в результате определенных типов скрещивания и усиливается при повышении температуры ( больше 24оС), т.е. является температуро-зависимым процессом [39][56]. В реципрокных (обратных) скрещиваниях гибридный дисгенез отсутствует [27].

Стерильность особей, которую мы наблюдаем в условиях Р-М системы гибридного дисгенеза, является следствием гибели клеток зародышевой линии на ранних стадиях индивидуального развития. Максимальная гибель клеток происходит на первой личиночной стадии развития, когда зародышевые клетки испытывают экспоненциальную митотическую пролиферацию. Однако, незначительная клеточная гибель уже наблюдается у 5-6-ти часовых эмбрионов при миграции полярных клеток в мезодерму гонад. В конце концов, это приводит к отсутствию половых клеток в яичниках, семенниках и общему недоразвитию их у взрослого гибридного потомства [46]. Можно выделить полную и частичную стерильность [39]. Особи стерильны, если атрофированы обе гонады и частично фертильны, если атрофирована только одна гонада. Дисгенные гибриды с односторонней атрофией гонад часто отстают в своем развитии и содержат меньшее количество яиц или сперматоцитов по сравнению с недисгенными особями. Есть мнение, что у дрозофилы транспозиции полноразмерного Р-элемента, длиной 2907 п.н., могут служить причиной снижения продолжительности жизни самцов в зависимости от количества активных копий на геном [58].

Последовательность Р-элемента содержит четыре открытые рамки считывания, из которых одна кодирует фермент транспозазу, другая — репрессор транспозиции [47][22]. Известно, что МГЭ содержат сайты различных знаков пунктуации и управления основными генетическими процессами — транскрипции, репликации, рекомбинации, процессинга и др. [15]. У Р-элемента помимо тканеспецифичных сайтов и сайтов рецепции внешних сигналов выявлены участки альтернативного сплайсинга [27], а также цис-действующие сайты, необходимые для их транспозиции [19][24]. При этом частота спонтанных транспозиций Р-фактора в недисгенных скрещиваниях составляет 2.5 х 10-3 на геном за поколение [25][33]. Р-элементы, также как и hobo, mariner, относятся к транспозонам II класса, характеризующиеся непосредственной транспозицией ДНК ? ДНК, что обеспечивается ферментами транспозазами, кодируемыми самими транспозонами, перемещение которых происходит с помощью “cut and paste” (“разрезания и сшивания”) механизма [35][38][52]. Тогда как транспозоны I класса или ретротранспозоны (gypsy, Stalker, copia и Dm412) размножаются посредством РНК с участием ферментов интеграции, включая обратные транскриптазы [31][26].

Благодаря нерепликативному способу перемещения Р-элемент вырезается из своего первоначального положения за счет двунитевых разрезов и встраивается в новый локус мишени. Разорванная донорная молекула после вырезания, как правило, или деградирует, или восстанавливается путем гомологичной рекомбинации в G2 фазе клеточного цикла, или с помощью прямого негомологичного воссоединения разорванных концов на протяжении всех стадий деления клетки [57]. Транспозиция одного Р-элемента оставляет за собой двуцепочечные разрывы с 3?-концами длиной в 17 п.н. [17].

Для описания процесса рекомбинационной репарации двунитевых разрывов (ДР) ДНК, индуцированных перемещениями мобильных элементов типа Р-транспозонов, были предложены различные модели. В частности, модель, раскрывающая SDSA-механизм (synthesis-dependent strand annealing): конец разорванной ДНК взаимодействует с гомологичным участком матрицы посредством белка DmRad51 и служит праймером для синтеза [27][18]. Другой путь рекомбинационной репарации ДР, называемый SSA-механизм (single strand annealing), включается, когда при образовании ДР с обеих сторон от разрыва присутствуют прямые повторы [48]. В таких случаях образованные в результате воздействия экзонуклеаз свободные концы могут комплементарно соединиться друг с другом с потерей одного из повторов. При очень больших разрывах матричной нити, в несколько тысяч пар нуклеотидов, механизм SSA работает в комплексе с белками, осуществляющими вспомогательные функции. У дрозофилы гомолог Rad1 белок mei-9 также участвует в репарации ДР [17]. В отличие от соматических клеток, в клетках зародышевого пути дрозофилы процессы Rad51-зависимой репарации и SSA-репарации являются основными механизмами в залечивании Р-элемент-индуцированных ДР [48][55]. В то время как Р-элементные ДР в соматических клетках зашиваются преимущественно путем негомологичного воссоединения концов, в генетическом контроле которого ген Rad51С не участвует [17]. В негомологичном соединении концов ДНК принимают участие белки, специфичные только для данного процесса и конкретного вида организма. Например, у дрозофилы в репарацию ДР, индуцированных активностью Р-элементов, вовлечен белок DmKu70, кодируемый геном mus309. Данный белок обладает способностью связываться с инвертированными повторами Р-элемента. Другой белок, синтезируемый геном CG3448, взаимодействуя с лигазой IV дрозофилы, в меньшей степени участвует в этом типе репарации и, как полагают, существует Lig4-независимый путь негомологичного воссоединения концов ДНК [43].

Показано, что в генеративных тканях действует хромосомный механизм, контролирующий перемещение семейства Р-мобильных элементов [7]. В геноме линий, выделенных из природных популяций, помимо полноразмерных Р-элементов обнаружено большое количество (до 30 на геном) их дефектных копий (КР, А12, D50). Эти элементы оказались гомологичными между собой по последовательности нуклеотидов, но гетерогенными по размерам, варьируя от 0.5 до 1.6 т. п.н., и являющиеся сайтами узнавания транспозаз [41][47]. Этот факт и широкое географическое распространение делетированных производных Р-элемента позволило некоторым авторам сделать предположение о важной роли их в подавлении дисгенной стерильности и селекции особей с относительно высоким содержанием его копий в геноме [38]. Данный механизм включает ряд последовательных событий: при проникновении в клетку, лишенную каких-либо Р-факторов, полные Р-элементы начинают синтезировать транспозазу, которая осуществляет его транспозицию в другие места локализации, а также участвует в процессе образования дефектных копий за счет внутренних делеций. Затем с полных и неполных копий Р-элемента считываются РНК разного размера, на которых синтезируются нормальные и мутантные молекулы транспозазы. Нормальная транспозаза обеспечивает перемещение мобильных элементов, мутантная, связываясь с нормальной, инактивирует ее и подавляет активность подвижных Р-факторов.

Известно, что транспозиции МГЭ могут вызывать повреждения генетического материала, приводя тем самым к различным морфологическим, физиологическим нарушениям и повышенному уровню мутирования [32][7][12]. Однако не всегда массовые транспозиции оказываются негативными. Так, при переходе от сильного инбридинга к свободному скрещиванию в ряде линий дрозофилы за  одно-два поколения происходят множественные кооперативные миграции МГЭ, и одновременно резко возрастает жизнеспособность. Также известны геномные системы МГЭ, имеющие некоторые «пороги катастроф транспозиционных потерь», которые ограничивают возможности протекания некоторых процессов с участием МГЭ. Примером такой геномной катастрофы можно считать явление гибридного дисгенеза, возникающего в ходе индукции массовых перемещений Р-элементов после дисгенных скрещиваний [14].

Роль мобильных элементов, включая Р-транспозонов, в эволюции и функционировании хромосом до конца не выяснена. Предполагается, что данные МГЭ относятся к так называемой «эгоистической» ДНК, у которой нет определенных функций, и она существует в «хозяйской» ДНК как паразит. Однако в процессе эволюции определенные комбинации в расположении мобильных генетических элементов, которые возникли в результате их транспозиций, могли закрепиться отбором. Возможно, например, что устойчивость к инсектицидам природных популяций дрозофилы возникла из-за удачного размещения Р-элементов [38]. Удачные комбинации мобильных элементов, вероятно, могли сохраняться в геноме дрозофилы из-за одновременного формирования систем, запрещающих их транспозиции. Уже отсюда ясно, что «эгоистическая» ДНК, согласно этим представлениям, участвует в эволюционных преобразованиях генома и определяет темп мутирования. По мнению других авторов, единственной функцией МГЭ является кодирование ферментов, обеспечивающих поддержание этих элементов в геноме и их перемещение [5]. Кроме того, одной из функций мобильных элементов может быть создание структурной гетерозиготности гомологичных хромосом. Это может вести к поддержанию оптимального уровня рекомбинации, что особенно важно в районах повторяющихся генов [21].

Также высказывается мнение, что Р-элементы и гибридный дисгенез рассматриваются как один из механизмов изоляции популяций, так как в результате дисгенных скрещиваний появляется стерильное потомство и возникновение у него хромосомных аберраций [26]. Другая функция Р-элементов заключается в способности вызывать изменчивость на границах ареалов субпопуляций, облегчая приспособляемость организмов в этих районах. Предполагают, что за вспышкой изменчивости может вскоре наступить нормализация и последующее снижение ее темпа. Массовое распространение в природе Р-цитотипа по сравнению с М-цитотипом указывает на возможное селективное преимущество Р-цитотипа. Это cогласуется с тем, что в смешанных культурах (Р+М) популяцию завоевывает Р-цитотип [39].

Мобильные элементы, активируя некоторые генетические системы, играют определенную роль в установлении уровня приспособленности (адаптивной ценности) особей, являющейся ключевым при рассмотрении вопросов эволюции популяций [2]. Немаловажным, на наш взгляд является и то, что дисгенные системы дрозофилы могут служить прототипом тех событий, которые возможны у других организмов. Об этом свидетельствует работа D.C. Rio, представившая доказательства активности транспозазы Р-элемента дрозофилы в клетках млекопитающих и дрожжей [49].






2 Материал и методы

2.1 Биология дрозофилы

Дрозофила (Drosophila melanogaster) также известная, как плодовая, банановая или уксусная муха это представитель отряда Двукрылых(Diptera) насекомых, относится к семейству Drosophilidae.

В природе обитает «дикий тип – wild type» дрозофилы (нормальный, Normal). У особей данного типа красные глаза и жёлто-коричневая либо серая окраска с поперечными черными кольцами поперёк брюшка.

У особей данного вида ярко выражен половой диморфизм (рис. 1): cамки дрозофил как правило крупнее самцов. Еще одним половым отличием является форма брюшка у дрозофил - у самок она заостренная, у самцов же более округлая и темная (большая пигментная точка). У самцов имеются так называемые половые гребешки, которые располагаются в виде ряда крепких хитиновых щетинок на первом членике передних ног. Последний признак можно различить под бинокулярной лупой. Конец брюшка у самок имеет заострённую форму, а у самцов - более округлую. Последние брюшные сегменты у самца сильно пигментированы (чёрная точка на конце брюшка).



Рисунок 1 — Половой диморфизм D.melanogaster: 1-самка; 2-самец.

Взрослая самка дрозофилы имеет пару яичников, каждый из которых состоит из нескольких десятков яйцевых трубочек (овариол). На одном конце трубочек находятся оогонии. В теле самки дрозофилы хранятся сотни спермиев, которые постепенно используются. Поэтому одно спаривание может привести к образованию сотни потомков.





Рисунок 2 — Жизненный цикл D.melanogaster.



Дрозофила развивается по пути сложного онтогенеза (метафорфоза), начиная со стадии яйца и заканчивая стадией имаго (взрослой особи). Промежуточными фазами онтогенеза являются стадии личинки первого, второго, третьего возраста и куклочная стадия (рис. 2).

2.2 Содержание дрозофилы

Питательная среда для дрозофилы. Подготовку стандартизированного корма осуществляли по рецепту (на 1 л воды): 30 г манной крупы, 30 г сахара, 8 г дрожжей, 7 г агар-агара, 1 мл 70 %-ной пропионовой кислоты. Для поддержания коллекции использовали питательную среду с добавлением изюма.

Стандартные условия содержания. Для создания одинаковых условий использовали термостат со строго установленными режимами температуры (25 ?С) и фотопериодизма (12 ч свет/12 ч темнота).

Наркотизация животных. Наркотизирование проводили в морилке с применением диэтилового эфира.

2.3 Линии D. melanogaster, использованные в работе

Сanton-S (CS) ? М-линия дикого типа, не имеющая в генотипе Р-элементы. Применяется в Р-М дисгенных скрещиваниях как реактивная линия (Bingham et al., 1982).

Harwich (Har) ? референсная сильная Р-линия дикого типа, имеющая в генотипе функциональные копии Р-элемента и отличающаяся свойствами индукторной линии в Р-М системе гибридного дисгенеза (Kidwell, 1979; Ronsseray, 1986).

Скрещивания проводили по следующим схемам: дисгенное — ??CS х ??Har и реципрокное (недисгенное) — ??Har х ??CS в соотношении 3??:1??. Скрещивались 5, 10,15, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 суточные особи.

2.4 Методы, применяемые в работе, и их характеристика



Метод атрофии гонад (стерильности). Уровень стерильности проводили у самок первого поколения (F1), полученных в результате дисгенных и реципрокных скрещиваний. Анализ морфологии яичников гибридных самок осуществляли вскрытием их брюшка препарированной иглой под бинокуляром. Подсчитывали особей с односторонней (А1) и двусторонней атрофией (А0). Частоту атрофии гонад (АГ) вычисляли как % АГ=% А0 + 1/2 % А1 (Marin et al., 2000).

Метод оценки плодовитости. На каждую пробирку отбирали по 5 самок и 5 самцов соответствующего возраста. Каждый день оплодотворенных самок помещали на свежую питательную среду, подкрашенную активированным углем, на протяжении 5 суток. Во всех полученных кладках анализировали количество эмбрионов, отложенных самками за сутки. Плодовитость оценивали как среднее число эмбрионов на 1 самку [13].

Метод оценки количества овариол в яичнике (уровень овариального резерва). Данный метод проводили одновременно с анализом атрофии гонад самок. В каждом яичнике подсчитывали количество овариол (Sokolova et al., 2013).

Метод оценки эмбриональной выживаемости. Данный метод проводили одновременно с оценкой плодовитости. После подсчета количества яиц через 1-2 суток подсчитывали количество прозрачных и окрашенных (темно-коричневого цвета) яиц [10].

2.5 Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Statistica (версия 7.0.61.0, StatSoft, Inc., США). Значимость различий между средними значениями зависимых выборок определяли по критерию Стьюдента. Статистическую зависимость между варьирующими признаками, а также тесноту связи между повторностями в каждом варианте оценивали с помощью корреляционного и регрессионного анализов.

Различия между повторностями эксперимента определяли с использованием регрессионного анализа. Для оценки достоверности различий по исследуемым показателям (выживаемости, атрофии гонад, уровню овариального резерва) применяли непараметрический критерий Колмогорова-Смирнова (для сравнения распределения смертности, стерильности, количества овариол в выборках). При анализе плодовитости достоверность различий оценивали по критерию хи-квадрат (или критерию Фишера, если N меньше 30).


3 Результаты

Анализ атрофии гонад косвенно указывает на наличие и активность Р-элементов в геноме дрозофилы. Проведены три повторности эксперимента (данные объединены), согласно которым показано, что транспозиционная активность Р-элементов находится на одном и том же высоком уровне независимо от возраста (Рис. 3). 



Рисунок 3 — Атрофия гонад в дисгенных и недисгенных условиях. * — различия достоверны при р < 0.05.

В контроле показатель “атрофия гонад” варьировал от 0 до 6.8 %, что укладывается в нормы, наблюдаемые при спонтанной стерильности (Рис. 3). Известно, что стерильность особей в условиях Р-М дисгенной системы является следствием гибели клеток зародышевой линии на ранних стадиях онтогенеза. В итоге, это приводит к отсутствию половых клеток в гонадах самцов и самок, что является причиной общего недоразвития их у потомков F1. 

Однако, несмотря на то, что с возрастом активность Р-элементов была неизменна (по тесту “атрофия гонад”), уровень овариального резерва дисгенных самок достоверно падал, начиная с 25-суточного их возраста (Рис. 4). Так, к концу эксперимента количество овариол на самку было снижено практически в 10 раз. В контроле (без индукции Р-элементов) количество овариол на самку имело тенденцию к постепенному снижению и к концу опыта упало примерно в 1.5-2.7 раза в зависимости от возраста.   



Рисунок 4 — Относительная величина овариального резерва в дисгенных и недисгенных  условиях. 

Общая плодовитость дисгенных самок, начиная с 25-суточного возраста, снизилась до нулевого значения (Рис. 5), что согласуется с данными овариального резерва. В контроле наблюдали выраженную динамику (с резкими подъемами и спадами) общей плодовитости, независящую от активности Р транспозонов. Но если рассматривать относительную величину плодовитости в течение всего периода наблюдений (5 суток) в эксперименте (Рис. 6 и 7), то можно сказать, что флуктуации в яйцепродукции выражены у молодых самок (5-30-суточного возраста) независимо от того, присутствуют ли в их генотипах Р-элементы или нет.



Рисунок 5 — Влияние транспозиционной активности Р-элементов на  общую яйцепродукцию дисгенных и недисгенных самок Drosophila melanogaster в зависимости от возраста; * – p<0.01 (по критерию хи-квадрат).

По показателю «общая эмбриональная смертность» (Рис. 8), наблюдается аналогичная картина, что и с предыдущими параметрами, особенно в условиях дисгенеза — с увеличением возраста выживаемость дисгенных эмбрионов падает. Это подтверждается данными кривых суточной динамики эмбриональной смертности (Рис. 9).

В то время как в контроле общая эмбриональная смертность находится на низком уровне (Рис. 8), но при рассмотрении кривых суточной динамики (Рис. 10) можно увидеть резкие спады и подъемы значений исследуемого показателя. И показано, что с возрастом эмбриональная смертность имеет тенденцию к повышению.









Рисунок 6 — Суточная динамика относительной плодовитости недисгенных самок Drosophila melanogaster в зависимости от возраста; * – p<0.05 (по критерию хи-квадрат).



Рисунок 7 — Суточная динамика относительной плодовитости дисгенных самок Drosophila melanogaster в зависимости от возраста; * – p<0.01 (по критерию хи-квадрат).



Рисунок 8 — Уровень общей эмбриональной смертности особей Drosophila melanogaster в зависимости от возраста; * – p<0.001 (по критерию Колмогорова-Смирнова).



Рисунок 9 — Суточная динамика эмбриональной смертности дисгенных особей Drosophila melanogaster в зависимости от возраста; * – p<0.001 (по критерию Колмогорова-Смирнова).



Рисунок 10 — Суточная динамика эмбриональной смертности недисгенных особей Drosophila melanogaster в зависимости от возраста; * – p<0.001 (по критерию Колмогорова-Смирнова).




Выводы

Исследовано влияние индуцированной активности Р-элементов на возраст-зависимый показатель — плодовитость и относительную ее величину. Показано, что общая плодовитость дисгенных самок снижается с их возрастом. При этом у молодых особей суточная динамика относительной плодовитости более выражена.

Установлено, что, несмотря на высокую дисгенную транспозиционную активность Р-элементов (по тесту «атрофия гонад»), не меняющуюся с возрастом, уровень овариального резерва старых самок был ниже такового у молодых особей примерно в 10 раз. 

Изучено действие возрастной динамики дисгенной активности Р-элементов на эмбриональную смертность. Выявлено, что количество жизнеспособных эмбрионов уменьшается с возрастом родительских форм, претерпевающих Р-транспозиции.

Полученные результаты свидетельствуют, что с возрастом  индуцированная транспозиционная активность Р-элементов у D. melanogaster не меняется (по показателю «атрофия гонад»), но может влиять на возраст-зависимые показатели репродуктивной системы и выживаемости........................