Моделирование зависимости величины оптической плотности культуры микроводорослей от биомассы

Министерство образования и науки Российской Федерации
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение 
высшего образования 
«Севастопольский государственный университет»
Институт радиоэлектроники и информационной безопасности
Кафедра «Физика»





ОТЧЕТ
по научно-исследовательской практике

на тему «Моделирование зависимости величины оптической плотности культуры микроводорослей от биомассы»

Выполнил: студент 4 курса, группы Фб-41д
направления подготовки 03.03.02 Физика
(профиль Биохимическая физика)

Набойщиков Виталий Сергеевич
Место прохождения практики: лаборатория молекулярной и клеточной биофизики СевГУ
Срок прохождения практики: 1 февраля –24 апреля 2016 г.



Руководитель практики  ________________ Лелеков А.С., старший научный                сотрудник к.б.н                                     




МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение 
высшего образования 
«Севастопольский государственный университет»

Институт радиоэлектроники и информационной безопасности
Кафедра «Физика»
Направление подготовки 03.03.02 Физика
Профиль Биохимическая физика
      УТВЕРЖДАЮ
Заведующий кафедрой Физика
________________  М.П. Евстигнеев
“___ “_________________ 2015 года
ЗАДАНИЕ 
на учебную практику студенту
НАБОЙЩИКОВУ Виталию Сергеевичу
1. Тема работы: Моделирование зависимости величины оптической плотности культуры микроводорослей от биомассы
2. Срок сдачи студентом отчета по практике: 28 апреля  2016 г.
3. Исходные данные к работе: литературные данные о биомассе микроводорослей а также их состав. Закон Бугера-Ламберта-Бура
4. Содержание отчета: 
литературный обзор, материалы и методы, теоретическая часть, результаты.
5. Перечень графического материала: 
таблицы, графики, рисунки.
6. Консультанты по практике, с указанием относящихся к ним разделов отчета
Раздел
Консультант
Подпись, дата


Задание выдал
Задание принял принял





7. Дата выдачи задания:  24 февраля 2016 г.

К А Л Е Н Д А Р Н Ы Й  П Л А Н


№
п/п
Наименование этапов практики
Срок выполнения этапов практики

Примеч.
1
Приготовление среды обитания для выращивания микроводорослей Spirulina (Arthrospira) platensis и Phaeodactylum tricornutum. Запуск культиватора с микроводорослями
1.02.16

2
Снятие оптической плотности биомассы микроводорослей
10.02.16 

4
Оформление отчета по практике 
12.03.16 – 15.04.16




Студент      _____________  В.С. Набойщиков
       (подпись)      
Руководитель    _____________  А.С. Лелеков 
                                                                                      (подпись)      

 
     
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ	5
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 	7
     1.1. Spirulina (Arthrospira) platensis (Nordst.) Geitler	7
     1.2. Phaeodactylum tricornutum Teod.	12
 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ	14
     2.1. Объект исследования	14
     2.2. Культиватор	14
     2.3. Приборы	16
      2.3.1. КФК-2	16
          2.3.2. Проточный датчик для определения оптической плотности культуры микроводорослей	19
     2.4. Питательные среды	21
     2.5. Измеряемые величины	23
     2.6. Условия проведения эксперимента	25
3. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ	26
     3.1. Математическая модель	29
4. РЕЗУЛЬТАТЫ	35
ЗАКЛЮЧЕНИЕ	38
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ	39
ПРИЛОЖЕНИЕ А	42

ВВЕДЕНИЕ
     
     Актуальность работы. Оптические методы широко используются в биологии. В первую очередь свое применение они находят в оценках концентрации тех или иных поглощающих свет объектов: фитопланктона, растворенной органики, бактерий и пр. Идея измерения концентрации поглощающих частиц оптическим методом берет свое начало от методов физической химии, в основе которых лежит один из основополагающих законов оптики – закон Бугера-Ламберта-Бера. Однако непосредственное приложение этого закона в биологической практике не всегда представляется возможным, поскольку, имея дело с любым живым объектом, мы сталкиваемся с целым рядом трудно поддающихся формализации факторов, которые так или иначе приводят к значительным погрешностям. Существует немало попыток снижения ошибок измерений за счет введения различного рода поправок и уточнений, которые продолжаются и по сей день. 
     Большое внимание оптическим методам уделяется в лабораторной практике культивирования микроводорослей, особенно, когда дело касается автоматизации управления процессов культивирования в непрерывном режиме. Используются оптические методы и для определения плотности культуры. С этой целью проводят специальные исследования для каждого конкретного случая: для каждого оптического устройства-измерителя, вида микроводорослей, режима культивирования и пр. Как правило, подобные исследования не являются основной целью работы и расцениваются как вспомогательные, оставаясь без должного внимания. К примеру, нет сомнений в том, что зависимость между оптической плотностью и величиной абсолютно сухого веса, полученная в работе [17], неприменима для культур низкой плотности. Тем не менее, в некоторых работах [6, 7]  авторы свое внимание на этот факт не обращают. Экспериментально доказано, что оптическая плотность (D750) суспензии микроводорослей и абсолютно сухой вес связаны линейной зависимостью, коэффициент пропорциональности которой принадлежит  промежутку 1,1…. 0,66 [4]. В работе также отмечено, что оценка биомассы посредствам измерения оптической плотности культуры с использованием фотоэлектрокалориметра КФК-2 требует осторожности.
     Проблема оценки биомассы по измерениям оптической плотности культуры особенно остро стоит при культивировании микроводорослей в промышленных масштабах. Существует специально разработанная аппаратура и оптические приборы, однако, такие разработки весьма дорогостоящие и, как правило, носят эксклюзивный характер, что препятствует их распространению. Приобретение специальной аппаратуры не всегда возможно для большинства лабораторий тепличных комплексов. Поэтому возникает необходимость в разработке метода определения плотности биомассы, используя наиболее популярный оптический прибор, который доступен практически каждой химической лаборатории.
     Целью данной работы являлась разработка математической модели зависимости величины пропускания света (оптической плотности) от биомассы микроводорослей.
     Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1. Освоить методики выращивания микроводорослей в условиях оптически плотных культур;
2. Освоить методики определения биомассы микроводорослей;
3. Разработать математическую модель, зависимости величины пропускания света (оптической плотности) от биомассы микроводорослей;
4. Провести верификацию предложенной модели, определить коэффициенты модели для различных видов микроводорослей.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Spirulina (arthrospira) platensis (xordst.) Geitler
     Arthrospira  (лат.) – род цианобактерий (синезелёных водорослей) порядка осциллаториевых (Oscillatoriales). Человеком и различными видами животных употребляются в пищу в основном два вида: Arthrospira platensis и Arthrospira maxima, имеющие коммерческое название «Спирулина». Название Спирулина (лат. Spirulina) по мнению разных систематиков либо закреплено за отдельным родом цианобактерий, либо является синонимом рода Arthrospira.
     Представители рода Arthrospira культивируются по всему миру, используются в качестве пищевой добавки и самостоятельного продукта, доступна в форме таблеток, хлопьев и порошка, а также в качестве кормовой добавки при разведении рыб и в птицеводстве. Издавна многие народы употребляли Spirulina в пищу. Однако триумф этого растения наступил около 20 лет назад, после многочисленных исследований воздействия Spirulina на организм животных и человека. Полученные результаты позволили ученым говорить о том, что Spirulina – это «пища двадцать первого века». По мнению японских, американских и других исследователей, Spirulina – потенциальный пищевой продукт в случае пищевого кризиса. Значительное увеличение количества здоровых людей преклонного возраста, которое наблюдается в последнее время в Японии, связывают с употреблением качественных продуктов питания, в том числе и спирулины. В настоящее время БАД «Спирулина» употребляют в пищу более чем в 80 странах мира. 
     Spirulina хранит в себе множество веществ, которые нужны человеку для оптимальной жизнедеятельности. Эта микроводоросль является очень хорошим биопротектором и биокорректором общего действия обеспечивая надежную ликвидацию более чем 300 нарушений в организме на разных стадиях– от самых ранних, какие еще не распознают методы диагностики, до этапов формирования очевидных признаков патологии. В состав Spirulina входит более чем 2000 витаминов, минералов, аминокислот, полиненасыщенных жирных кислот и ферментов.
     Белки. Содержание белка доходит до 70%: в 10 г его столько же, сколько в килограмме говядины. Клеточные стенки не содержат жесткой целлюлозы, а состоят из муко-полисахаридов, что дает возможность усваивать до 87% белка, имеющегося в ней. Это очень важно для пожилых людей со сниженным функционированием кишечника. Spirulina содержит весь набор аминокислот в необходимых пропорциях, охватывая восемь незаменимых.
     Жиры (липиды). Присутствие у Spirulina липидов сульфолипидов увеличиввает ее имуностимулирующее действие. Кроме того они представлены вжнейшими жирными кислотами.
     Углеводы. Наличие углеводов в Spirulina составляет 10-20%. В клеточной стенке имеются альгинаты – уникальные биосовместимые кислые полисахариды, имеющие детоксикационный эффект и содействуют выведению из организма человека и животных радионуклеотидов и тяжелых элементов таких как свинец.
     Витамины. В микроводоросли собраны в оптимальных соотношениях важнейшие витамины – натуральные, синтезированные живыми клетками. Употребление их более эффективно, чем использование синтетических поливитаминов. Витаминов группы В в Spirulina гораздо больше, чем в мясных продуктах, бобовых и различных крупах. Наличие витамина РР (В3) в этой водоросли намного больше чем в говяжьей печени, почках, языке, мясе птицы и кролика.
     Минеральные вещества. Она обогащена макро и микроэлементами, которые способствуют улучшению обменных процессов в организме. Все минеральные вещества, которые имеются в Spirulina легко усваиваются. Для примера железо из микроводоросли усваивается организмом на 60% эффективнее, чем из других источников. Употребление Spirulina в сутки 3-4 г увеличивает количество гемоглобина.
     Пигменты. Spirulina имеет в составе три пигмента-красителя: каротиноиды, хлорофилл и фикоцианин, эти вещества помогают синтезировать многие ферменты которые в свою очередь регилуруют метаболизм в организме. Одним из самых важных для человека пигментов является – голубой пигмент фикоцианин. Обладая иммуностимулирующим эффектом пигмент способствует оптимальной работе различных органов, предупреждает возникновение рака, язвы и многих других. В других продуктах которые имеются на Земле фикоцианин не найден.
     Хелатные агенты (сидерохромы). Обеспечивающие защиту организма от воздействия радиации в том числе способствуют выводить тяжелые металлы из организма (плутоний, стронций и др.).
     Свойства:
* Владеет иммуностимулирующим эффектом, помогает справиться с витаминной и минеральной недостаточностью
* Нормализует кислотно-щелочное равновесие, белковый, углеводный и водно-солевой обмены организма;
* Снижает риск развития рака, хорошие результаты получены в комплексной терапии мастопатии
     Клинические исследования. В специальных источниках появилась информация о благотворном влиянии Spirulina на состояние детей дошкольного и школьного возраста, родившихся в Чернобыле после катастрофы. Spirulina прописывалась в дозе 1 г в день в течении от 1 месяца до 1 года. В группе употреблявших Spirulina в течении года, не болело 74,8% детей, а в контрольной— лишь 30%. В другом эксперименте при исследовании влияния Spirulina на людей, подвергшихся воздействию радиации, в том числе в рамках программы «Дети Чернобыля», обнаружено, что ежедневное употребление Spirulina содействует полному возобновлению функций костного мозга в течении нескольких месяцев и очищает организм от остаточных радионуклидов. Опубликовано масса статей, подтверждающих, что 3-каротин, который имеется в Spirulina в большом количестве, значительно снижает риск заболевания всеми видами рака, включая рак легких, гортани, желудка, толстой кишки, молочных желез и шейки матки. Пациенты с повышенным содержанием общего холестерина в крови и артериальной гипертензией на протяжении 8 недель получали по 4 Spirulina в день. Через месяц приема уровень общего холестерина уменьшился на треть, а по истечению 2-х месяцев— наполовину. Обнаружен положительный эффект употребления Spirulina при нарушениях функций щитовидной железы, набпочечников, тимуса, половых желез у мужчин и женщин, а также при сахарном диабете. Ее рекомендовано использовать в качестве эффективного лекарственного средства комплексной терапии железодефицитной анемии. Легкоусвояемое железо содействует быстрому увеличению содержания гемоглобина в крови при употреблении Spirulina по 3-4 г в день. Она должна быть значимой составной частью рациона беременных и кормящих женщин. В Индии и Вьетнаме ее отпускают кормящим матерям, так как она оказывает содействие на синтез полноценного молока. Все больше Spirulina используется в педиатрии. При употреблении у детей улучшается аппетит; хорошо поддаются коррекции функциональные расстройства желудочно-кишечного тракта. При склонности к запорам замечена нормализация функционирования кишечника. Наблюдается иммуностимулирующий эффект: как правило, во время приема этой БАД частота ОРВИ уменьшается почти в 1,5 раза. Дети почти не болеют или переносят ОРВИ в легкой форме, не прибегая к употреблению медикаментов. Также БАД хорошо переносится даже детьми до 1 года. Все вышеуказанное позволяет использовать Spirulina в педагогической практике.
     Рекомендации по применению. Рекомендовано употреблять Spirulina при комплексной терапии хронических гепатитов, холециститов, цирроза печени, гастритов, колитов, язвенной болезни желудка. Все это из-за способности БАД поднимать аппетит, предупреждать развитие инфекций, снижать желудочную секрецию, подавлять активность пепсина. Она содействует регулярному опорожнению кишечника. Употребляя ее, организм может быстро приобрести нужные ему питательные вещества в концентрированном виде, не загружая пищеварительную систему.
     Избыточная масса тела. Spirulina используется и в диетических целях. Имеющиеся в ней протеиновая субстанция помогает понемногу и безвредно уменьшить массу тела, не затрачивая для этого больших усилий. Выпитая внутрь за 30-40 минут до еды, она обволакивает желудок и создает впечатление его наполненности. Отчего вы не съедите много пищи.
     Аллергии. Значительный уровень Р-каротинов, витаминов C и E позволяет снизить риск развития аллергических реакций и роста злокачественных новообразований, замедлить процессы старения благодаря антиоксидантному эффекту.
     Психические и нервные болезни.  Spirulina применяется также и в комплексной терапии психических и нервных заболеваний (маниакально-депрессивного психоза, шизофрении, последствий перенесенного стресса, депрессии любой этиологии, болезни Альцгеймера, алкоголизма) и неврологических состояний с потерей памяти.
     Кардиологическая практика. На данный момент в мире есть необходимость в снижении уровня общего холестерина в организме для понижения риска возникновения сердечно-сосудистых заболеваний. [1]
     
     
     1.2. Phaeodactylum tricornutum
     Морские диатомовые микроводоросли, Phaeodactylum tricornutum, могут использоваться в качестве сырья для получения биодизеля [8], так как они способны синтезировать и накапливать триацилглицерины. Проведённые в рамках Aquatic Species Program исследования показали, что диатомовые микроводоросли при определённых условиях культивирования способны накапливать триацилглицерины до 60 % их клеточной массы, которые легко могут быть преобразованы в биотопливо с помощью цепи химических реакций. Максимальное накопление данных веществ в клетках микроводорослей обычно происходит при стрессовых условиях, таких как недостаток азота или низкая температура. Следует отметить, что различные стрессовые условия могут оказывать различное влияние на процессы биосинтеза триацилглицеринов. Например, если происходит увеличение синтеза ферментов, участвующих в реакциях синтеза триацилглицеринов, то мы имеем дело с азотным голоданием.[9]
     Среди большого количества производимых из водорослей веществ особое место занимают полиненасыщенны жирные кислоты (PUFA), среди которых наиболее ценной является ?-3 группа, которая необходима для развития морских организмов, и является незаменимой для сбалансированного питания человека [15]. На сегодняшний день полиненасыщенные жирные кислоты получают из рыбьего жира, однако микроводоросли могут использоваться как альтернативный источник их получения. Особое внимание среди большого количества PUFA заслуживает эйкозапентаеновая кислота (EPA), которая встречается во многих видах морских микроводорослей [14]. Только несколько видов можно использовать для промышленного культивирования. В этом случае на первое место выходит те виды, которые обладают большими скоростями роста. Например, Phaeodactylum tricornutum показывает большие скорости роста, высокое клеточное содержание EPA при низком содержании докозагексаеновой кислоты. Также достоинством промышленного получения ЕРА из Ph. tricornutum является низкое содержание в его жирнокислотном составе докозагексаеновой и арахидоновой кислоты, которые усложняют процесс выделения ЕРА [10]. Выделение данного вещества возможно и из других видов микроводорослей, например, Porphyridium cruentum и Spirulina platensis, а также некоторых грибов, но только из диатомовых Isochrysis galbana и Ph. tricornutum получение ЕРА возможно осуществить в три стадии, в то время как из других видов – не менее пяти. [11]
     Клеточные экстракты из морской диатомовой микроводоросли Phaeodactylum tricornutum Bohlin обладают антибактериальным действием для многих штаммов бактерий, причём основным компонентом является эйкозапентаеновая кислота. Эйкозапентаеновая кислота (ЕРА) и докозагексаеновая кислота (DHA), относящиеся к ?-3 жирным кислотам, обладают мощным оздоровительным эффектом на человеческий организм [12]. Современные медицинские исследования этих веществ показывают, что они могут предотвращать болезни сердца, системы кровообращения, облегчать течение воспалительных процессов. Впервые это было обнаружено у пациентов, в питании которых присутствовала рыба или рыбий жир. При этом первичными продуцентами жирных кислот являются морские микроводоросли, являющихся кормом рыб. [13]
      Ph. tricornutum является потенциальным источником ЕРА так как данная микроводоросль обладает высокими темпами роста и высокой способностью к накоплению полиненасыщенных жирных кислот, причём ЕРА может составлять значительную часть от их общего количества. [15] 
 
 
 
 
 
 
 
 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
                                              
     2.1. Объект исследования
     Объектом исследования послужили сине-зелёные водоросли Spirulina platensis, а также диатомовые Phaeodactylum tricornutum из коллекции культур ИМБИ РАН. 
     
     2.2. Культиватор
     Для выращивания культур использовали один культиватор плоско- параллельного типа из стекла, который имел форму параллелепипеда со скошенным дном (см. рисунок 2.1) [2], геометрические размеры культиватора: ширина —26 см, высота —55 см, скос дна —9 см. Рабочий слой суспензии —1 см. Культиватор рассчитан на 1,2 л суспензии. Культиватор снабжен подачей воздуха с помощью компрессор для аквариума Resun (резун) air-4000 (смотри рисунок 2.2)

Рисунок 2.1– Общий вид экспериментального культиватора. Барботаж среды воздухом, объём культуры равен 1 л.

 Рисунок 2.2 – Компрессор для аквариума Resun air-4000

Характеристики компрессора:
* Мощность – 4 Вт. 

* Производительность - 320 л/ч 

* Кол-во рабочих каналов - 2 

* Регулировка производительности: Есть 

* Воздушный фильтр: Есть 
     
     2.3. Приборы
* Ртутный термометр, 0-100°с, абсолютная погрешность ±0,5°с;
* Концентрационный фотоэлектроколориметр КФК-2, абсолютная погрешность при измерении величины пропускания не превышает 1,0%, размах показаний, определяющий сну чайную погрешность, не превышает 0,3%, в комплекте стеклянные кюветы 1 см;
* Весы плечевые
* Люксметр Ю-116 с погрешностью не более 5% от измеряемой величины;
* Аквариумный компрессор «Resun» air-4000 производительностью 
          320 л/ч;
* Пипетка 5 ± 0,05 мл.
* Проточный датчик для определения оптической плотности культуры микроводорослей
     
     2.3.1. КФК-2 
     КФК-2 (Рисунок 2.3) является однолучевым прибором и предназначен для измерения коэффициентов пропускания и абсорбционности растворов и твердых тел в отдельных участках диапазона длин волн 315...980 нм, выделяемых светофильтрами, а также для определения концентрации веществ в растворах. Кроме того, колориметр позволяет измерять коэффициенты пропускания взвесей, эмульсий и коллоидных растворов в проходящем свете. 
     
     КФК-2 применяют на предприятиях водоснабжения, в медицинской, химической, пищевой, металлургической промышленности и в сельском хозяйстве.

Рисунок 2.3 – Внешний вид прибора КФК-2:
1 — микроамперметр; 2 — крышка кюветного отделения; 3 — ручка «Установка 100 грубо»; 4 — ручка установки чувствительности прибора; 5 — ручка перестановки кювет; 6 — ручка установки светофильтра; 7 — источник света
     Устройство прибора. Колориметр состоит из блока питания и оптического блока. В оптический блок входят осветитель, оправа с оптикой, светофильтры, кюветное отделение с кюветодержателем, фотометрическое устройство с усилителем постоянного тока и элементами регулирования, регистрирующий прибор. Осветитель представляет собой лампу типа КГМ. Конструкция осветителя обеспечивает перемещение лампы в трех взаимно перпендикулярных направлениях для ее правильной установки. В оправу встроены конденсор, диафрагма и объектив. Цветные светофильтры вмонтированы в диск. Светофильтр вводят в световой пучок с помощью ручки. Рабочее положение каждого светофильтра фиксируется. Кюветодержатель расположен под крышкой в кюветном отделении. При работе в кюветном отделении одновременно находятся две кюветы – с растворителем (или нулевым раствором) и окрашенным раствором. Перестановку кювет в световом пучке осуществляют поворотом ручки до упора. В фотометрическое устройство входят фотоэлемент Ф-26, фотодиод ФД-24К, светоделительная пластинка и усилитель. Включение фотоприемников производится с помощью ручки. В качестве регистрирующего прибора используется микроамперметр типа М907-10, шкала которого оцифрована для определения абсорбционности и коэффициентов пропускания.
     Методика работы с прибором. Колориметр необходимо включить в сеть за 15 мин до начала измерений. Во время прогрева кюветное отделение должно быть открыто (при этом шторка перед фотоприемниками перекрывает световой пучок). Ручкой ввести необходимый по роду измерения цветной светофильтр. Затем установить минимальную чувствительность прибора, для чего ручку «Чувствительность» поставить в положение «1», а ручку «Установка 100 грубо» – в крайнее левое положение. Перед измерениями при переключении фотоприемников необходимо проверить установку стрелки микроамперметра на нуль по шкале коэффициентов пропускания при открытом кюветном отделении. В случае смещения стрелки от нулевого положения ее следует подвести к нулю с помощью потенциометра «Нуль». 
     Ввести в световой поток кювету с водой, закрыть крышу кюветного отделения. Ручками «Чувствительность», «Установка 100 грубо» и «Точно» установить нуль по шкале абсорбционности. Ручка «Чувствительность» может находиться в одном из трех положений: «1», «2» или «З». Затем поворотом ручки кювету с водой заменить на кювету с окрашенным раствором. Снять отсчет по шкале значений абсорбционности. Измерения проводятся 3 – 5 раз, после чего окончательное значение измеренной абсорбционности определяют как среднее арифметическое из всех полученных значений.[18]
Технические характеристики прибора:
* Спектральный диапазон работы (разбит на определенные интервалы с помощью светофильтров) – 315...980 нм
* Приемники излучения:
* Фотоэлемент Ф-26, для работы в диапазоне – 315...590 нм
* Фотодиод ФД-24К, для работы в диапазоне – 590...980 нм 
* Диапазон измерения абсорбционности –  0... 1,3
* Напряжение питание – 220 В,
* Частота – 50 Гц
     
     2.3.2.  Проточный датчик для определения оптической плотности культуры микроводорослей
     Устройство представляет собой стеклянную кювету длинной 40 мм и внутренним диаметром 20 мм (Рисунок 2.4). С торцов кювета расположены 2 герметично приклеенных стекла. Так же имеются 2 штуцера внутренним диаметром 3 мм, которые обеспечивают непрерывный приток и отток культуры из 
кюветы. Кювета изолирована от внешних побочных источников освещения.  С одной стороны находится широконаправленный светодиод с длинной волны 620 нм. Светодиод помещен в рефлектор, с помощью которого широконаправленный световой поток становится линейно направленным. Световой поток направлен таким образом, чтобы полностью освещать проточную кювету по всей площади. С обратной стороны кюветы находится фотоэлемент, к которому подключен мультиметр. Мультиметр работает в режиме вольтметра, тем самым регистрируя напряжение на фотоэлементе.


Рисунок 2.4 – Схема проточного датчика. 1 – светодиод, 2 – фотоприемник, 3 – входной штуцер для культуры, 4 – выходной штуцер для культуры.

     2.4. Питательные среды
     Состав питательной среды представлен в таблице 2.1, 2.2, для приготовления питательных сред использовалась дистиллированная вода, рH которой составляла 5,5 единиц.[17]
Таблица 2.1– среда для  Phaeodactylum tricornutum

Замечание 2.1– Для приготовления среды используется морская вода. Культивирование осуществляют с применением газо-воздушной смеси с 3-5% углекислого газа.





Таблица 2.2 – среда для  Arthrospira (spirulina) platensis.	

Замечание 2.2 – В таблице 2.2 макрокомпоненты 7-10 растворялись отдельно в небольшом количестве воды, затем растворы 1-6 и 7-10 смешивались.
     
     2.5. Измеряемые величины
* Пропускание на длине волны 750 нм, T750, %, с переходом к величине оптической плотности, D750, ед, опт, пл. D750 = —log (T/100), кювета 1 см. Кювету в кювето держателе устанавливали в максимальной близости к фотоприёмнику;
* Температура, t0C;
* Освещенность, клк;

Рисунок 2.5– Измерение оптической плотности но стандартной методике (слева) и при установке кювет в максимальной близости к фотоприёмнику (справа). 

Рисунок 2.6– Зависимость оптической плотности от расстояния к фотоприемнику
В эксперименте мы ставили кювету как показано максимально близко к фотоприемнику рисунок  2.5 (справа), для повышения точности результатов. Так как 

идет рассеивание света и раствор не идеален (калоидный). Это подтверждается 
графиком на рисунке 2.6. Оптическая плотность меняется с увеличением расстояния, поэтому по нашему мнению рассеивание будет наименьшим и следовательно погрешность прибора будет меньше

     2.6. Условия проведения эксперимента 
     Работа выполнена на базе лаборатории молекулярной и клеточной биофизики СГУ. В эксперименте водоросли выращивали методом накопительных культур. Рабочий объём суспензии в культиваторе составлял 1 литр. Этот объём на протяжении всего эксперимента поддерживали, доливая дистиллированную воду до отметки 1 л. Освещаемая поверхность (рабочая поверхность культиватора) составляла 0,1 м2. Водоросли выращивали в условиях круглосуточного одностороннего освещения, в качество источника света использовали лампы дневного света (philips-18 Вт) средняя освещённость рабочей поверхности культиватора составляла 6 клк. Суспензию микроводорослей барботировали воздухом с помощью аквариумного компрессора «Resun», общий вид культиваторов представлен на рисунке 1. Скорость подачи воздуха в культиватор составляла 1,2 л воздуха в минуту на 1 литра культуры. Температуру культуры в эксперименте поддерживали на постоянном уровне 27-29°с.  
     

     


     
     
     
     3. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
     
     Опишем процедуру измерения ослабления светового потока суспензией нативной культуры низших фототрофов (например, микроводорослей) на длине световой волны 750 нм в единицах оптической плотности. Процедура основана на методах, используемых при изучении оптических характеристик растений [1], в частности, суспензий микроводорослей [4].
     Терминология. Суспензия нативной культуры низших фототрофов это совокупность клеток низших фототрофов, находящихся во взвешенном состоянии в жидкой питательной (культуральной) среде. Оптическая плотность суспензии низших фототрофов на длине волны 750 нм (D750) это десятичный логарифм коэффициента пропускания T суспензии на длине волны 750 нм, взятый со знаком ? минус.
     Термин оптическая плотность используется в био-технологической практике в несколько ином смысле, нежели его определяет закон Бугера Ламберта Бера [2]. Несмотря на указанное обстоятельство, описанная процедура широко используется в практике лабораторного культивирования микроводорослей как экспресс-метод определения концентрации клеток [5], измерения ростовых характеристик микроводорослей [3] и пр.
     Сущность метода. Суспензию нативной культуры низших фототрофов помещают в кварцевую измерительную кювету концентрационного фотоэлектроколориметра и измеряют величниу пропускания относительно кюветы с непоглощающим раствором питательной (культуральной) средой или дистиллированной водой
     Оптический метод определения биомассы микроводорослей является наиболее простым и широко распространенным. В его основе лежит основополагающий закон оптики Бугера-Ламберта-Бера, согласно которому оптическая 

плотность поглощающего раствора прямопропорциональна концентрации растворенного вещества:
   ,
где I, I0 – интенсивность плоской монохроматической выходящей и падающей на слой вещества l световой волны, ? – коэффициент экстинкции, зависящий от свойств растворенного вещества, С – концентрация растворенного вещества. 
     В клетках низших фототрофов основная доля поглощённого света приходится на фотосинтетические пигменты. Помимо этого, свет поглощают и структурные элементы клеток внутриклеточные компоненты, клеточные мембраны и пр. Поглощение света структурными элементами клеток, не связанное с пигментами, называется неспецифическим. Коэффициент экстинкции ? (коэффициент ослабления света) определяется как поглощенной, так и рассеянной световой энергией. Рассеяние света в суспензии происходит вследствие дифракции первичного светового пучка из-за чрезвычайной гетерогенности клеток. При необходимости получить именно величину поглощения суспензии клеток используют прибор со специальной приставкой – фотоинтегрирующей сферой, направляющей рассеянные лучи на регистрирующий элемент.
     По определению, оптическая плотность раствора на данной длине волны прямопропорциональна концентрации растворенного вещества:
   .
     Применительно к культуре микроводорослей, оптическая плотность на длине волны неспецифического поглощения, например 750 нм, прямопропорциональна концентрации клеток в растворе, или биомассе B:
   
     При постоянстве коэффициента экстинкции ? и фиксированном оптическом пути l, получим следующее выражение:
   .
     Однако, вследствие высокой гетерогенности культуры микроводорослей, а также для культур высокой плотности, наблюдаются значительные отклонения от линейной зависимости между оптической плотностью и биомассой микроводорослей. На рисунке 3.1 представлена кривая зависимости оптической плотности культуры спирулины Arthrospira platensis от её биомассы. Как следует из рисунка, кривая не описывается линейной зависимостью во всем диапазоне данных. В области небольших концентраций клеток, примерно до 0,5 г/л и 0,7 ед. опт. пл., кривая достаточно хорошо описывается линейным уравнением. При нулевом значении величины биомассы величина оптической плотности также должна равняться нулю, однако полученные результаты свидетельствуют о том, что при нулевой биомассе оптическая плотность должна составлять около 0,03 единиц. Следовательно, даже при малых концентрациях клеток культур микроводорослей применимость закона Бугера-Ламберта-Бера вызывает множество вопросов. 


Рисунок  3.1 – Зависимость оптической плотности культуры A. platensis от её биомассы. Линия – аппроксимация экспериментальных данных уравнением линейной регрессии
     Следует отметить, что величина оптической плотности, указанная на рисунке 1 рассчитана как отрицательный десятичный логарифм пропускания T:
   .
      Так как любой оптический прибор определяет именно величину пропускания света, которое есть отношение проходящей световой энергии к падающей:
   ,
при работе с культурами микроводорослей при определения величины оптической плотности необходимо использовать иную зависимость между D и T, нежели в виде десятичного логарифма.
     
     3.1. Математическая модель.
Рисунок 3.2 – Схематический вид эксперимента
      
      
      Пусть дана плоскопараллельная кювета, в которой находится культура микроводорослей. Допустим, что клетки представляют собой кубики с площадью боковой грани dS. По литературным данным известно, что одна клетка поглощает около 40% падающей световой энергии, обозначим эту величину через ?. Пусть I0 – интенсивность пучка монохроматического света, падающего на поверхность культуры, Вт/м2; S – площадь поперечного сечения кюветы, Iпр – интенсивность света, прошедшего сквозь культуру, Вт/м2.
     Если в кювете находится только одна клетка, то интенсивность поглощенного света (Iп) будет определяться по формуле:
                                                                                                      (1)
                                                                                                             (2)
Подставим (1) в (2) и определим Iпр:
                                                (3)
Вынесем I0 за скобки и получим:
                                               (4)
Далее правую и левую часть разделим на I0:
                                                                                    (5)
Так как, где Т – коэффициент пропускания, выражение (5) запишем в виде:
               			                        (6)
Аналогично, если в кювете находится не одна, а n клеток, получим:
                                                 (7)
     Выражение (7) записано для единичного слоя клеток микроводорослей. В реальных условиях единичный слой невозможен, однако для разбавленных культур микроводорослей, в которых клетки не затеняют друг друга, величина коэффициента пропускания будет определяться согласно (7). В (7) отношение числа клеток к площади поверхности кюветы называется поверхностной концентрацией. Помножив числитель и знаменатель на длину кюветы, получим зависимос.......................