Метод разведения микроорганизмов (метод Коха)

СОДЕРЖАНИЕ



ВВЕДЕНИЕ	3

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ	5

	1.1 Современное состояние биотехнологической промышленности	5

	1.2 Особенности молочнокислых бактерий	7

	1.3 Силосование	9

	1.4 Силосные закваски	12

	1.5 Способы культивирования микроорганизмов	15

	1.6 Принципы составления питательных сред в биотехнологическом производстве	17

2 СХЕМА, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ	21

	2.1 Цели и задачи исследования	21

	2.2 Объект исследования	21

	2.3 Схема исследования	25

	2.4 Методика проводимых исследований	26

	2.4.1 Метод разведения микроорганизмов (метод Коха)	26

	2.4.2 Жидкофазное глубинное культивирование	26

	2.4.3 Окраска по Граму	27

3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ	29

	4	ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ	31

	4.1 Схема технологического процесса	31

	4.2 Технологическая линия с описанием оборудования	33

	4.3 Технологические расчеты на единицу выпускаемой продукции	36

5 СТАНДАРТИЗАЦИЯ И МЕТРОЛОГИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ПРОИЗВОДСТВА	38

	5.1 Основные критерии безопасности вырабатываемой продукции	38

	5.2 Технологический контроль качества и безопасности выпускаемой продукции	39

6 БЕЗОПАСНОСТЬ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ	42

	6.1 Значение и задачи безопасности труда на современном этапе	42

	6.2 Мероприятия по обеспечению безопасности труда	43

	6.2.1 Организационные и правовые мероприятия	43

	6.2.2 Санитарно-гигиенические мероприятия	48

	6.2.3 Техника безопасности	51

	6.3 Пожарно-профилактические мероприятия	58

7 ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ	64

	7.1 Расчет потребности и стоимости сырья	64

	7.2 Калькуляция себестоимости пробиотической добавки	67

	7.3 Расчет эффективности производства продукции	69

ВЫВОДЫ	72

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ	73

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ	74

		




ВВЕДЕНИЕ

В промышленном животноводстве, в последнее время, ведущую роль в гибели молодняка стали занимать желудочно-кишечные заболевания бактериального происхождения. Попытки контролировать проблему путем чередования схем применения антибиотиков и химических препаратов, в том числе и нового поколения, не только не дали желаемого результата, а напротив, усугубили ее. Мировой опыт применения антибиотиков показал, что в данной ситуации они не обладают той эффективностью, а штаммы многих возбудителей кишечных инфекций, циркулирующие в хозяйствах, приобрели множественную лекарственную резистентность к антибиотикам. А это в свою очередь влечет к возможности длительного их персистирования в организме птицы и создает предпосылки для передачи возбудителя от птицы к человеку[25].

Следовательно проблема профилактики и лечения кишечных инфекций сельскохозяйственной животных, возбудителями которых являются условно-патогенные микроорганизмы, имеет не только экономическое, но и социальное значение [35].

Ужесточение требований к экологической безопасности продукции животноводства заставило во всем мире пересмотреть многие подходы к вопросам оптимизации контроля над эпизоотическим процессом болезней, возбудителями которых является условно патогенная микрофлора и признать необходимость разработки нового поколения экологически безопасных препаратов, способных занять свое место в системе мероприятий по обеспечению биологической защиты сельскохозяйственных животных.

Наиболее полно этим требованиям могут отвечать пробиотические кормовые добавки и препараты, в состав которых входят живые бактерии из числа основных представителей нормального кишечного микробиоценоза животных и птицы этими представителями являются: лактобациллы, бифидобактерии, энтерококки.

Актуальная потребность в пробиотических кормовых добавках и препаратах привела к тому, что для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний у сельскохозяйственных животных и птицы стали использовать медицинские препараты, содержащие в своей основе штаммы микроорганизмов-пробионтов, выделенных от человека, которые показавают недостаточную эффективность вследствие отсутствия у них видоспецифичности [25].

Ввиду этого представляется целесообразным разработка пробиотических кормовых добавок и препаратов, в том числе и на основе молочного сырья с использованием культур, выделенных от сельскохозяйственных животных и птицы для использования в ветеринарии.

Проблема рационального использования молочного сырья неразрывно связана с эффективной переработкой молочной сыворотки. Данный вопрос рассматривался в Международной молочной федерации (ММФ) и, неоднократно, на международных молочных конгрессах. Молочная сыворотка обладает пищевой и биологической ценностью, является богатой питательной средой для роста микроорганизмов. В то же время промышленной переработке подвергается только около 20% всего объема. Одной из причин такого нерационального использования служит недостаток эффективных технологий ее переработки.



1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Современное состояние биотехнологической промышленности

Биотехнология ? одно из ключевых направлений качественного технологического развития в целом ряде отраслей экономики. Потенциал возможностей и спектр применения биотехнологии превратил отрасль наряду с нанотехнологиями в ведущий фактор развития экономик отдельных государств и мирового сообщества в целом.

Состояние биотехнологии в мире.

Состояние биотехнологии в мире Запад и Восток давно поняли истинное значение биотехнологии и вкладывают в ее развитие огромные ресурсы. Хорошо осознавала это и наша страна в 70–80-е годы XX века, когда она была одной из ведущих биотехнологических держав. Однако в силу разных причин данный приоритет был утрачен, и в настоящее время России предстоит определиться, вступать ли ей в мировую конкурентную биотехнологическую гонку, или отстать навсегда. Статистика свидетельствует о крайне неблагоприятном для РФ соотношении. Как уже упоминалось выше, сейчас ее доля в мировом объеме биотехнологической продукции не превышает 0,2%, а для сравнения: США – 42%, Евросоюз – 22%, Китай – 10%, а Индия – 2%. В США на протяжении последней четверти века осуществляется деятельность по поддержке биотехнологии: приняты федеральные законы, способствующие бизнесу в этой сфере, вкладываются крупные инвестиции (в фундаментальные исследования, биофармацевтику, биоэнергетику, выращивание ГМО и т.д.). Евросоюз же разработал долговременную стратегию в области биотехнологии с выраженной экологической направленностью, осуществляет мощную финансовую поддержку (на 2008–2013 гг. запланировано выделить более 50 млрд. евро). В последнее время активно развиваются биотехнологические производства в Китае, Индии, Бразилии, Японии и других странах. Особенно поражает бурный прогресс Индии, которая, стартовав в данной отрасли в начале 2000-х годов, уже в 2006 г. вышла на уровень дохода 2 млрд. долларов в год, обеспечив ежегодные темпы роста 37%. О размахе биотехнологии в Китае свидетельствует такая цифра, как планируемый выход к 2020 году на уровень биотехнологического производства порядка 500 млрд. долларов. Следует указать на общую характеристику происходящего в мировом масштабе процесса, обусловленного внедрением биотехнологии во все сферы жизни. Другого слова, кроме как глобальный биотехнологический бум, не придумаешь. Фактически биотехнология из рядовой отрасли превращается в системообразующий, ведущий фактор, определяющий макроэкономику отдельных государств и мировую экономику в целом. По оценке Файнэшнл Таймс, сектор биотехнологии и фармацевтики по капитализации занимает третье место, уступая только нефтегазовому и банковскому.[5]

Состояние биотехнологии в РФ.

На фоне триумфального шествия биотехнологии по планете успехи отечественной биотехнологии выглядят явно не в самом удовлетворительном свете. По уровню развития биоиндустрии сейчас она занимает 70-е место в мире. Наблюдается отставание России в отношении количества и качества публикаций в области биотехнологии (это же касается и патентов). Биотехнологическая промышленность РФ производит дженерики (на их долю приходится 98% продукции), причем, главным образом, это – устаревшие препараты, а современные высокотехнологичные продукты составляют 10%. Биотехнологические предприятия оснащены в основном устаревшим оборудованием. Но все же Россия обладает всеми возможностями, чтобы войти в число государств, активно развивающих биотехнологию, и занять достойное место. Этому способствуют: высокий образовательный и научно-технологический потенциал; наличие ключевых факторов для развития микробиологической промышленности (дешевой энергии, пресной воды, ресурсов для интенсивного развития сельского хозяйства); обширная территория; несмотря на кризисные явления в мировой экономике. По совокупности указанных параметров РФ имеет наиболее благоприятные условия для развития биотехнологической промышленности по таким направлениям, как биотопливо, микробиологический синтез, химия на основе возобновляемого сырья. Для реализации вышеуказанной возможности необходимо срочно решить ряд проблем. Биотехнология должна быть признана приоритетом государственной политики с адекватными способами организационной и финансовой поддержки, которая должна включать: законодательное регулирование, привлечение федерального и регионального уровней, стимулирование бизнеса и государственно-частного партнерства, программно-целевой подход и др. В случае принятия решения о государственной поддержке развития биотехнологии в масштабах страны разрабатываются целевые ориентиры, на достижение которых должна быть направлена соответствующая национальная программа [5;22].

1.2 Особенности молочнокислых бактерий

Молочнокислые бактерии – это группа микроаэрофильных грамположительных микроорганизмов, сбраживающих углеводы с образованием молочной кислоты. Молочнокислое брожение стало известно людям еще на заре развития цивилизации. С тех пор им пользуются в домашних условиях и в пищевой промышленности для переработки и сохранения еды и напитков. Традиционно к молочнокислым бактериям относят неподвижных, неспорообразующих кокковидных или палочковидных представителей отряда Lactobacillales (например, Lactococcus lactis или Lactobacillus acidophilus). В эту группу входят бактерии, которые используются в ферментации молочных продуктов, овощей. Молочнокислые бактерии играют важную роль в приготовлении теста, какао, силоса. Несмотря на близкое родство, патогенные представители отряда Lactobacillales (например, пневмококки Streptococcus pneumoniae) обычно исключаются из группы молочнокислых бактерий [37].

С другой стороны, дальние родственники Lactobacillales из класса актинобактерий – бифидобактерии часто рассматриваются в одной группе с молочнокислыми бактериями. Некоторых представителей аэробных спорообразующих родов Bacillus (например, Bacillus coagulans) и Sporolactobacillus (например, Sporolactobacillus inulinus) иногда включают в группу молочнокислых бактерий из-за сходства в метаболизме углеводов и их роли в пищевой промышленности [37].

В природе молочнокислые бактерии встречаются на поверхности растений (так например, на листьях, фруктах, овощах, зёрнах), в молоке, наружных и внутренних эпителиальных покровах человека, животных, птиц и рыб. Следовательно, помимо своей роли в производстве пищи и кормов, молочнокислые бактерии играют важную роль в живой природе, сельском хозяйстве и нормальной жизнедеятельности человека. Влияние ускоренной индустриализации производства молочнокислых бактерий, основанной на небольшом числе адаптированных для заводов штаммов, на природное разнообразие этих бактерий и здоровье человека пока остаётся неизученным.

Одним из наиболее распространенных видов молочнокислых бактерий является Lactococcus lactis. Это неподвижные кокки, не образующие спор, хорошо окрашиваются анилиновыми красителями и по Граму, в молодом виде имеют форму стрептококка. На мясо-пептонном агаре дают точечные круглые колонии, в толще агара – чечевицеобразные. L. lactis разлагает сахар без образования газов на две молекулы молочной кислоты. Наиболее благоприятная для развития температура составляет +30-+35 °C.

Молочнокислый лактококк постоянно встречается в самопроизвольно скисшем молоке. Под воздействием этой бактерии молоко обычно свертывается в течение первых 24 часов. Когда содержание молочной кислоты достигнет 6-7 г на литр, сбраживание сахара прекращается, так как более высокая кислотность может губительно воздействовать на молочнокислый лактококк.

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus – болгарская палочка. Бактерия названа так, потому что в свое время была выделена из болгарского кислого молока «ягурта». Это неспроробразующая неподвижная бактерия, достигающая 20 мкм в длину и часто соединяющаяся в короткие цепочки.

Является термофильной, и лучше всего растет при температуре от 40 C. Молоко свертывает быстро, причем содержание молочной кислоты в нём доходит до 32 г/л, а это в пять раз больше, чем при заражении молочнокислым стрептококком [37].

1.3 Силосование

Силос ? это сочный корм, полученный в результате консервирования зеленых растений молочной кислотой. 

Силосование зеленых кормов сопровождается меньшими потерями питательных веществ, а в частности протеина (белка), чем при сушке на сено. Если же при обычных условиях уборки на сено из зеленой травы теряется до 30% и более питательных веществ, то при правильно проведенном силосовании в силосных сооружениях потери в общей питательности редко достигают 10%, а в белке близки к нулю. Белки в процессе силосования распадаются частично на пептиды и аминокислоты, но это не существенно снижает их питательность [35]. 

Силосование дает возможность заготавливать сравнительно дешевый сочный корм на зимний период, а в засушливых районах ? и на летние месяцы при недостатке пастбищного корма; позволяет возделывать такие кормовые культуры, которые дают наивысший урожай, и убирать их независимо от погоды в наиболее удобное для хозяйства время; дает возможность широко пользоваться пожнивными и промежуточными культурами, а также хорошо использовать осенью отаву, которую не удается высушить на сено; позволяет использовать на корм сорняки и грубое разнотравье, из которых при сушке получается плохое сено, а при силосовании ? вполне удовлетворительный сочный корм.

Сущность силосования заключается в том, что в свежей растительной массе, плотно уложенной в непроницаемые для воздуха силосные сооружения, в результате биохимических процессов постепенно накапливаются органические кислоты, преимущественно молочная, которые служат консервирующим средством, предохраняя растительную массу от дальнейшего разложения и порчи. Поэтому основная задача правильного силосования сводится к выработке в силосуемой массе необходимого количества молочной кислоты.

Биохимические процессы вызываются, с одной стороны, действием ферментов растительных клеток, а с другой ? разнообразными микроорганизмами, которые попадают в силос с зеленой травой [35; 36].

Первым показателем изменения, происходящего в зеленой массе,в силосных сооружениях, является повышение температуры, которое обусловливается дыханием растительных клеток, процессами брожения, идущими в силосуемой массе. В свежескошенной траве, уложенной в силосохранилище, растительные клетки некоторое время остаются живыми и продолжают дышать. Кислород, необходимый для нормального дыхания, они заимствуют из воздуха, остающегося в силосе. Чем больше воздуха остается в силосе, тем энергичнее идут окислительные процессы, тем сильнее разогревается силосуемая масса и тем выше в ней потери питательных веществ. На дыхание клеток расходуются, главным образом, углеводы, при этом конечным продуктом окислительных процессов являются углекислота и вода.

Наряду с изменениями, происходящими в результате дыхания клеток, в силосуемой массе быстро развиваются и бактериальные процессы. Силосуемая зеленая масса обычно очень богата разнообразными видами бактерий, вызывающими брожение. Из многочисленных видов брожения ? молочнокислого, уксуснокислого, маслянокислого ? для успешного силосования желательно молочнокислое, в результате которого накапливается молочная кислота. Накопление уксусной и масляной кислот, продуктов гниения белка тем более плесени ухудшает качество силосованного корма.

Для своего развития молочнокислые бактерии требуют влажной среды иостаточного количества питательных веществ в форме сахаров; в кислороде :ни не нуждаются, предпочитая анаэробные условия (без кислорода воздуха). При сбраживании сахаров в качестве основного продукта они образуют молочную кислоту [37].

Очень важной особенностью молочнокислых бактерий является их способность развиваться в кислой среде, в которой невозможна жизнедеятельность маслянокислых и гнилостных бактерий.

Плесени и бактерии уксуснокислого брожения являются строго аэробными организмами, развивающимися лишь при свободном доступе кислорода воздуха. Поэтому для успеха силосования необходимо создать условия, благоприятные для развития в силосуемой массе молочнокислого брожения.

Богатство силосуемой массы растворимыми углеводами (сахаром) при удержании воды около 70%, анаэробные (без кислорода воздуха) условия и слабое нагревание благоприятствуют росту молочнокислых бактерий. В такой среде они сразу же получают преобладание над другими бактериями и усиливают его по мере выработки молочной кислоты, пока, наконец, и сами не погибают от нее. Процесс силосования практически заканчивается, когда кислотность (рН) достигает 4,0-4,2.

Для того чтобы в короткий срок в силосуемой массе накопилась молочная кислота, а кислотность повысилась до 4,2, необходимо содержание определенного количества сахара, которое получило название сахарного минимума, под которым подразумевается содержание сахара, необходимое для накопления в силосуемой массе молочной кислоты в количестве, достаточном для смещения рН силоса до 4,2. От соотношения сахарного минимума к фактическому содержанию сахара в траве зависит силосуемость растительной массы.

В зависимости от сахарного минимума и фактического содержания сахара в растениях они делятся на легкосилосующиеся, трудносилосующиеся и не силосующиеся.

1.4 Силосные закваски

Как известно, одним из основных видов кормов для жвачных животных являются ферментируемые корма, например силос. Силосование (ферментация) – это биологический процесс; насколько хорошо он пройдет, зависит от некоторых факторов, оказывающих существенное влияние на показатели питательности и безопасности корма. Введение консервантов в корма обусловлено необходимостью обеспечить их максимальную сохранность. Так, при использовании консервантов потери кормовой массы составляют 5-10%, а без них – 15-30%. Потери связаны с процессами брожения (ферментации), протекающими при силосовании корма. При этом консерванты способны снизить развитие нежелательных микроорганизмов, вызывающих потери питательных веществ и энергии в ходе закладки и хранения и в процессе скармливания кормов. Так, например, только от аэробной порчи, вызываемой развитием дрожжей и плесеней при выемке корма, по исследованиям специалистов, ежегодно теряется около 10% сухого вещества заготовленных кормов. В общей сложности в странах Европы и Северной Америки это равно потере не менее 500 млн тонн кормов. Внесение консервантов в зеленую массу позволяет существенно снижать потери питательных и биологически активных веществ, на 15-20% повышать выход силоса. Консерванты делятся на химические и биологические.

Биологические консерванты 

В основу закваски (биологического консерванта) входит одна или несколько живых культур молочнокислых бактерий, которые продуцируют молочную кислоту, подавляющую нежелательную анаэробную микрофлору.

С целью предупреждения развития аэробной микрофлоры производители заквасок используют гетероферментативные молочнокислые бактерии, прежде всего Lactobacillus buchneri, а также пропионовокислые бактерии. Как первые, так и вторые способны синтезировать и накапливать в массе корма пропионовую кислоту и некоторые другие вещества, угнетающе действующие на дрожжи и плесени. Кроме того, ряд заквасок содержит ферменты, способные расщеплять клетчатку растительных клеток до простых сахаров. Это позволяет успешно заквашивать трудносилосуемые корма и работать в сложных погодных условиях. 

Причина популярности биологических консервантов – это меньшая их стоимости по сравнению с химическими продуктами. Кроме того, они обладают более высокой технологичностью: абсолютно не коррозионны, не токсичны, почти не вызывают раздражения кожи и слизистых, не имеют резкого запаха. 

Биологические консерванты производятся в двух формах – жидкой и сухой (лиофильно высушенные). Сухие консерванты имеют ряд преимуществ: срок хранения составляет год и более (у жидких – до 3 месяцев); расход лиофильно высушенных консервантов меньше, при этом жидкие более требовательны к условиям хранения. В числе поставщиков биологических силосных заквасок на российский рынок упомянем компании «БИОТРОФ», «Биомин», «Капитал-ПРОК», AGRAVIS Raiffeisen AG, «Лаллеманд», «НИИ Пробиотиков», «Сиббиофарм», «НТЦ «БИО», «Vilofoss», «Фидимпорт».

Химические консерванты 

Химические консерванты можно разделить на следующие виды: 

1) минеральные (неорганические) кислоты – серная, соляная, фосфорная и их смеси; 

2) органические (антибактериальные) кислоты – муравьиная, уксусная, пропионовая, бензойная и их смеси; 

3) антибактериальные соли – нитрит натрия, бензоат натрия, пиросульфат натрия, бисульфат натрия и т.д.; 

4) газообразные консерванты – диоксид серы, аммиак, диоксид углерода, азот и т.д. 

Неорганические кислоты резко повышают кислотность силоса, ведут к различным заболеваниям животных и снижению их продуктивности, в связи с чем мало используются. На сегодняшний день наибольшую популярность на российском рынке среди продуктов этой категории завоевали химические консерванты на основе органических кислот. Механизм их действия заключается в резком понижении pH среды и ингибировании жизнедеятельности патогенной микрофлоры. Такие консерванты обладают более высокой эффективностью, надежностью и более длительным сроком хранения по сравнению с биологическими заквасками, характеризуются сильным бактерицидным и фунгицидным действием и не имеют негативных побочных эффектов. Эти кислоты (летучие жирные кислоты – ЛЖК) естественны для жвачных животных, так как являются продуктами их метаболизма. Преимущество химического консервирования перед другими способами заготовки кормов состоит еще и в том, что оно обладает универсальностью, то есть позволяет сохранять любые виды кормовых культур, злаковых и бобовых. Наиболее лучшим считается применение консервантов, состоящих из нескольких компонентов (муравьиной, пропионовой кислот и их солей и т.д.). Подобные смеси активно воздействуют на разные группы возбудителей, такие как бактерии, дрожжи, грибы, что позволяет получать силос высокого качества.

Российский рынок химических консервантов представлен в основном продукцией трех крупнейших химических концернов – «Perstorp», «BASF» и «Kemira», которые осуществляют собственный синтез органических кислот и имеют возможность для производства консервантов различного типа в зависимости от их целевого назначения. Эти компании поставляют свою продукцию через сеть дистрибьюторов. Среди фирм, продающих консерванты в России, отметим «Кормовит», «КаМП», «Лаллеманд», «Fontanka», «Провет», «Фидлэнд Групп», «AGRAVIS Raiffeisen AG», ТД «Простор», «Оптима сервис», «Гермес». 

1.5 Способы культивирования микроорганизмов

Культивирование микроорганизмов можно поводить поверхностным или глубинным, периодическим или непрерывным методами, в аэробных или анаэробных условиях. Большое значение при выборе способа культивирования имеет отношение выбранного для культивирования микроорганизма к молекулярному кислороду и конечная цель культивирования: накопление биомассы или получение определенного метаболита (спирта, кислорода, фермента и т.д.) [22].

При культивировании поверхностным способом микроорганизмы выращивают на поверхности плотной, сыпучей среды или в тонком слое жидкой среды, при этом микроорганизмы получают кислород непосредственно из воздуха. В жидких средах аэробные микроорганизмы часто растут, образуя на поверхности пленку. Факультативные анаэробы развиваются не только на поверхности, но и в толще жидкой среды, вызывая более или менее равномерное ее помутнение. На сыпучих средах поверхностным методом получают ферментные препараты. Поверхностное культивирование микроорганизмов применяется как в лабораторных условиях, так и в промышленности

Все способы культивирования аэробных микроорганизмов сводятся к увеличению поверхности соприкосновения питательной среды с кислородом воздуха.

При глубинном культивировании в жидких средах микроорганизмы используют растворенный кислород. Вместе с тем растворимость кислорода в воде невелика, поэтому, чтобы обеспечить рост аэробных микроорганизмов в толще среды, ее необходимо постоянно аэрировать (подводить кислород в глубь жидкой среды). Сочетание питательной среды и растущих в ней микроорганизмов называют культуральной жидкостью.

Биореактор, ферментер или ферментатор ? это закрытая или открыта емкость, в которой при определенных условиях (давление, температура, концентрация сухих веществ, рН среды и т.д.) протекает на клеточном или молекулярном уровне контролируемая реакция, осуществляемая с помощью микроорганизмов.

Периодический процесс включает: 

а) стерилизацию сред, биореакторов и вспомогательного оборудования; 

б) загрузку аппарата питательной средой;

 в) внесение посевного материала (клеток, спор);

 г) рост культуры, который может совпадать во времени со следующим этапом или предшествовать ему; 

д) синтез целевого продукта; 

е) отделение и очистку готового продукта. 

Речь идет о временной последовательности этапов, по окончании последнего этапа проводится мойка биореактора и его подготовка к новому циклу.

Этап роста культуры включает несколько фаз: 

а) лаг-фазу ? сравнительно медленный рост внесенной культуры, осваивающей новую среду обитания в объеме биореактора; 

б) экспоненциальную фазу ? бурное деление клеток, сбалансированный рост культуры; 

в) фазу замедленного роста, связанного с исчерпанием питательных субстратов и накоплением токсических продуктов метаболизма;

 г) стационарную фазу ? прирост клеток равен их убыли; 

д) фазу отмирания ? постепенное снижение числа жизнеспособных клеток.



Рисунок – 1 Закономерность роста чистой культуры микроорганизма

а ? лаг-фаза; б ? логарифмическая фаза; в ? стационарная фаза; г? фаза отмирания.

1.6 Принципы составления питательных сред в биотехнологическом производстве

Основу питательных сред для культивирования микроорганизмов составляют источники углерода. Кроме углерода клетки микроорганизмов в процессе роста испытывают потребность в азоте, фосфоре, макро- и микроэлементах. Все вещества этого рода находятся в питательных средах в виде солей, исключение составляют среды, где азот и фосфор могут усваиваться растущими культурами из органических источников, например автолизатов или гидролизатов микробного или животного происхождения.

Отделения приготовления питательной среды представляет собой цех, оборудованный емкостями для хранения жидких и твердых веществ, средствами их транспортировки и аппаратами с перемешивающими устройствами для приготовления растворов, суспензий или эмульсий. При этом питательные соли хранятся обычно в твердом виде, а приготовление их смеси с заданным соотношением компонентов производится в аппарате с мешалкой, куда подаются твердые компоненты в необходимом количестве и далее происходит их растворение. Иногда соединяются и перемешиваются заранее приготовленные растворы. Жидкие и твердые источники углерода обычно вводят в уже готовую питательную среду непосредственно перед ферментацией, так как это устраняет опасность заражения посторонней микрофлорой, вероятность которого возрастает при хранении готовой питательной смеси.

При непрерывном культивировании в производстве микробного белка углеводороды и растворы солей вводят в ферментер раздельно по индивидуальным линиям, а смешение и эмульгирование нерастворимых в воде n-алканов происходит уже в самом биореакторе. При культивировании бактерий на метане последний постоянно барботируют в аппарат через специальные устройства [38].

При периодической ферментации в начале процесса инокулят (засевная доза микроорганизмов) вносится в уже готовую питательную среду, содержащую все компоненты. Поэтому источники углерода вводят непосредственно перед засевом или отдельные компоненты среды вводят по мере потребления их культурой, поддерживая в ферментере некоторую оптимальную их концентрацию, которая на разных этапах ферментации может меняться по определенному закону.

Важнейшим элементом приготовления питательных сред является соблюдение требований асептики. Это либо создание заданного значения рН, обеспечивающего подавление посторонних микроорганизмов, либо полная стерилизация всех подаваемых потоков и самого биореактора.

Для стерилизации газовых потоков (в первую очередь воздуха) используют процесс фильтрации через специальные волокнистые фильтры с последовательно расположенными фильтрующими элементами. Фильтрующий материал периодически стерилизуется подачей острого пара в отключенный фильтр через заданные промежутки времени. Жидкостные потоки стерилизуют различными методами, из которых практический интерес представляют термический, радиационный, фильтрационный и отчасти химический.

Термический ? самый распространенный, при температурах порядка 120-150оС.

Радиационный ? g-излучение, применяется редко из-за трудностей создания и эксплуатации мощных источников этого излучения.

В отдельных случаях применяют химические стерилизующие агенты (вещества с ярко выраженным асептическим действием). Основная проблема в этом случае ? необходимость устранения стерилизующего агента из питательной среды после гибели микрофлоры до внесения инокулята. Химические антисептики должны быть не только высокоэффективны, но и легко разлагаемы при изменении условий после завершения стерилизации. К числу лучших относится пропиолактон, обладающий сильным бактерицидным действием и легко гидролизуемый в молочную кислоту.

Мало распространен и метод фильтрации, что объясняется аппаратными трудностями. Метод основан на способности полупроницаемых мембран с крупными порами пропускать жидкую фазу и концентрировать клетки микроорганизмов. В принципе этот метод является идеальным для стерилизации термически неустойчивых жидких и газовых средств, поскольку может осуществляться при низкой температуре и требует лишь градиента давления по разные стороны мембраны. Основная трудность ? наличие термостойких мембран, способных выдерживать многократную стерилизацию их самих. В настоящее время эта проблема решается путем применения термостойких полимеров в производстве мембран.

В заключение заметим, что ряд субстратов не требует стерилизации, так как они сами обладают асептическим действием; сюда относят метанол, этанол, концентрированная уксусная кислота и др. В этом случае ограничиваются стерилизацией прочих элементов питательной среды.[38] 




2 СХЕМА, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Цели и задачи исследования

Целью данного исследования является подбор эффективных компонентов питательных сред для культивирования пробиотического биопрепарата на основе отходов молочного производства.

Задачи исследования:

проанализировать питательные потребности Lactobacillus sp и составить рецептуру питательных сред для Lactobacillus sp, рассчитать стоимость исследуемых питательных сред;

проанализировать  эффективность исследуемых питательных сред по микробиологическим показателям; 

проанализировать кислотоустойчивость отобранной закваски;

 проанализировать сроки хранения полученной закваски;

Провести экономическое обоснование пробиотической добавки.

2.2 Объект исследования

В наших исследованиях используется лиофилизированная смешанная культура молочнокислых и пропионовокислых бактерий (ЛкПпППшПа). Штаммы из Российской коллекции микроорганизмов ВНИИМС и ФГУП «Экспериментальная биофабрика» (включенной Постановлением Правительства РФ от 24.06.1996 г. №725-47 в перечень коллекций, депонирующих для государственных нужд микроорганизмы, культивируемые клетки растений и соматические клетки позвоночных), выделенные из естественных или производственных источников без применения генных модификаций, идентифицированные и паспортизированные в установленном порядке.

Входящие в состав микрофлоры бактериальных концентратов культуры традиционно применяются при производстве ферментированных молочных продуктов в России и за рубежом и включены в перечень микроорганизмов с документально подтвержденной историей безопасного использования в пищевых продуктах (Бюллетень Международной Молочной Федерации № 377/2002) и согласно классификации микроорганизмов, приведенной в Санитарных правилах СП 1.2.731-99, относятся к микроорганизмам непатогенным для человека и животного.

В таблице 1 приведена краткая характеристика видов бактерий, входящих в состав лиофилизированной закваски.

Таблица 1 – Краткая характеристика видов бактерий

Обозначение 

Название 

Штамм 

Количество клеток  

Свойства 

Лк

Lactococcus lactis

1701

100 млрд. 

Кислотообразователь

Пп

Lactococcus cremoris

16K

100 млрд

Кислотообразователь

П

Lactobacillus plantarum

1325

2078

50 млрд

Подавляет маслянокислое брожение 

Пш

Lactobacillus acidophilus

15 к

 4 п 

1 млрд

Бактерицидное действие, обладает хорошей приживаемостью 

Па

Propionibacterium shermanii

225 и

143

10 млрд

Продуцирует пропионовую кислоту 



ЛкПпППшПа – расшифровывается по входящим в состав закваски микроорганизмам: термофильные молочнокислые палочки (Лк); ацидофильную палочку (Па); пропионовокислые бактерии (ППш). Ниже представлена более подробная характеристика видов бактерий, которые входят в состав лиофилизированной закваски.

Lactobacillus acidophilus – один из видов бактерий рода Lactobacillus, которые являются частью нормальной микрофлоры млекопитающих. Ацидофильные лактобактерии могут применяться в качестве лекарственных средств – пробиотиков.

Систематическое положение Lactobacillus acidophilus:

Царство: Бактерии; Тип: Firmicutes; Класс: Bacilli; Порядок: Lactobacillales; Семейство: Lactobacillaceae; Род: Lactobacillus; Вид: Lactobacillus acidophilus.

Propionibacterium – род бактерий, которые являются грамположительными палочками. Их название связано с уникальным метаболизмом. Они способны синтезировать пропионовую кислоту с помощью необычного ферманта – транскарбоксилазы. Представители рода Propionibacterium широко используются в производстве витамина В12, тетрапиррольных соединений, пропионовой кислоты и пробиотических продуктов. 

Систематическое положение Propionibacterium shermanii:

Царство: Бактерии; Тип: Actinobacteria; Класс: Actinobacteria; Отряд: Actinomycetales; Подотряд: Propionibacterineae; Семейство: Propionibacteriaceae; Род: Propionibacterium; Вид: Propionibacterium Shermanii.

Lactococcus lactis – это неподвижные кокки, не образующие сп.......................