Изучение влияния антибиотиков на активность бактериальных промоторов soxS и katG

Министерство образования и науки Российской Федерации
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ
ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ
«ОРЕНБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»


Химико-биологический факультет

Кафедра биохимии и микробиологии








ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА

Направление подготовки 06.03.01 Биология

Изучение влияния антибиотиков на активность бактериальных промоторов soxS и katG

ОГУ 06.03.01. 1318. 030 ОО






Заведующий кафедрой
д-р мед.наук, профессор
Е.С. Барышева
Руководитель
канд.биол. наук
И.Ф. Каримов
Студент
Н.А. Куликова




Оренбург 2018

Утверждаю
заведующий кафедрой______________
            биохимии и микробиологии       .
наименование кафедры
____________           Е. С. Барышева     а
 подпись                     инициалы, фамилия
«» 2018г.

ЗАДАНИЕ

на выполнение выпускной квалификационной работы

студентуКуликовой Надежде Александровне.
фамилия имя отчество
по направлению подготовки (специальности)              06.03.01 Биология.
код наименование
1 Тема ВКР Изучение влияния антибиотиков на активность бактериальных промоторов soxS и katG.
2 Срок сдачи студентом ВКР  «____» 2018 г.
3 Цель и задачи ВКР Цель: Исследовать экспрессию промоторов окислительного стресса бактерий soxS и katG рекомбинантных люминесцирующих бактерий при воздействии антибиотиков.
Задачи:
1) Изучить способность антибиотиков ?-лактамного, тетрациклинового, аминогликозидного рядов индуцировать промоторы окислительного стресса бактерий.
2) Оценить выживаемость микроорганизмов под воздействием антибиотиков.
3) Изучить механизм действия антибиотиков с использованием неклеточных систем.
4 Исходные данные к ВКРОкислительный стресс происходит в клетках микроорганизмов под воздействием бактерицидных антибиотиков, при взаимодействии с которыми клетки производят молекулы химически реактивного кислорода, вызывающие повреждение ДНК, ферментов бактерий, а также мембраны, охватывающий клетку.
5 Перечень вопросов, подлежащих разработке Исследование способности антибиотиков ?-лактамного, тетрациклинового, аминогликозидного рядов индуцировать промоторы окислительного стресса бактерий; Изучить выживаемость люминесцирующих штаммов, на основе EscherichiacoliK12 MG1655 и SalmonellatyphimuriumLT2, под воздействием антибиотиков; Проанализировать механизм действия антибиотиков на неклеточных системах________________________________________________________________________
6 Перечень графического (иллюстративного) материала В виде рисунков и таблиц.







Дата выдачи и получения задания 


Руководитель ВКР  «»2018 г. ____________   И.Ф. Каримов.
.                                                                                        подпись           инициалы, фамилия
Студент             «»2018г. ____________         Н.А. Куликова     а.            подпись           инициалы, фамилия

Аннотация


     В данной выпускной квалификационной работе изучены теоретические и практические вопросы экспрессии промоторов окислительного стресса бактерий soxS и katG рекомбинантных люминесцирующих бактерий при воздействии антибиотиков ?-лактамного, тетрациклинового, аминогликозидного рядов.
     Структурно работа состоит из введения, основной части, заключения и списка использованных источников. Во введении обосновывается актуальность работы, определяется цель и формулируются задачи. В первой главе рассматриваются аспекты формирования окислительного стресса у микроорганизмов в результате воздействия свободных радикалов и способы защиты от него. Во второй главе описываются используемые в данной работе материалы и применяемые методы. И в третьей, приведены результаты исследований и их анализ.
     Выпускная квалификационная работа содержит 57 страниц, 21 рисунок, 6 таблиц. Такжебылиспользованпереченьисточников, вкоторыйвключено 65 наименований.
     
Annotation


     In this final qualifying work theoretical and practical issues of expression of oxidative stress promoters of soxS and katG bacteria of recombinant luminescent bacteria under the action of antibiotics of ?-lactam, tetracycline, aminoglycoside series were studied.
     Structurally, the work consists of an introduction, a main part, a conclusion and a list of sources used. In the introduction, the relevance of the work is justified, the goal is defined and the tasks formulated. The first chapter deals with the formation of oxidative stress in microorganisms as a result of the action of free radicals and ways to protect against it. The second chapter describes the materials used in this work and the methods used. And in the third, the results of the research and their analysis are presented.
     Graduation qualification work contains 57 pages, 21 figures, 6 tables. A list of sources was also used, which included 65 items.

Содержание


Введение	6
1 Окислительный стресс у бактерий	8
1.1 Природа окислительного стресса	8
1.2 Механизмы защиты от окислительногостресса	10
1.3 Регуляторы окислительного стресса	12
1.4 Основные источники свободных радикалов	16
1.5 Антибиотики как индукторы окислительного стресса	22
2 Материалы и методы исследования воздействия антибиотиков на процесс формирования окислительного стресса бактерий	26
2.1 Исследуемые штаммы микроорганизмов	26
2.2 Антибиотические препараты	26
2.3 Индукторы окислительного стресса	29
2.4 Антиоксиданты	31
2.5 Неклеточные системы детекции АФК	32
2.6 Методика оценки индукции генов репортерных люминесцирующих штаммов	34
2.7 Биолюминесцентный метод оценки индукции исследуемых штаммов бактерий под воздействием антибиотиков	35
2.8 Методика определения минимальной ингибирующей концентрации антибиотиков	35
2.9 Хемилюминисцентный метод оценки свободных радикалов	36
2.10 Обработка данных	37
3 Результаты собственных исследований	39
3.1 Влияние антибиотиков на индукцию промоторов стресса бактерий	39
3.2 Оценка выживаемости микроорганизмов под воздействием антибиотиков	42
3.3 Механизм действия антибиотиков на клетку	46
Заключение	50
Список использованных источников	52
Приложение А (справочное) Список опубликованных работ	57

     

Введение
     
     
     Исследования последнего десятилетия подтверждают, что одной из основных причин патологических изменений в человеческом организме является избыточное накопление в тканях кислородных свободных радикалов и активных форм кислорода. Это приводит к возникновению окислительного стресса, лежащего в основе целого ряда патологических процессов и заболеваний: воспаления, реперфузионное поражение тканей, старение, канцерогенез.
     Биохимические процессы в тканях сопровождаются образованием целого ряда реакционно-способных соединений и радикалов (пероксид водорода, гидроксильный радикал, синглетный кислород, супероксид анион и др.) - активных форм кислорода (АФК), представляющих собой продукты метаболизма в клетках при физиологических условия существования организма. Действие АФК на функциональную активность клеток двойственно. В норме АФК участвуют в метаболизме структурных компонентов клеточных мембран (белков, липидов, углеводов), изменяя текучесть и деполяризацию мембран. Но при патологических состояниях, протекающих на фоне интенсивной генерации АФК, последние начинают проявлять свое цитотоксическое действие, приводящее к окислительной деструкции белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот, а также разрушению клеточных структур.
     Наряду с выполнением необходимых сигнальных или иных функций, АФК, как высокореактивные вещества, способны наносить вред биологическим структурам клетки и физиолого-биохимическим процессам, протекающим в ней. Негативные действия могут быть многообразными. Чрезвычайно высокая химическая активность АФК позволяет им реагировать с разными структурными и функциональными компонентами клеток, а также - метаболитами. Они вызывают повреждения белков, что проявляется в окислении -SH-групп, FeS-центров ферментов, фрагментации пептидных цепей, повышении чувствительности белков к действию протеаз. Реактивные производные кислорода способны прямо взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами, вызывая повреждение азотистых оснований, дезоксирибозы и рибозы и появление новых ковалентных связей (сшивок). Модификация оснований становится причиной разрывов водородных связей между цепями ДНК и повреждения хромосом.
     Одной из основных мишеней действия АФК являются липиды - основные компоненты клеточных мембран. АФК способны инициировать их перекисное окисление (ПОЛ), в результате чего происходит повреждение этих структур, связанное с нарушением функций мембранных белков. Оно обнаруживается в явлении, которое называют «протечкой мембран», проявляющейся в увеличении проницаемости для ионов и органических веществ. Кроме этого, продукты ПОЛ (4-гидроксиалкенали, малоновый диальдегид и др.) обладают мутагенной активностью и блокируют клеточное деление.
     В связи с появлением феномена антибиотикорезистентности все большее внимание уделяется исследованию механизмов гибели бактериальных клеток и условий, модифицирующих действие антибиотиков. В последние годы в ведущих мировых журналах разгорелась дискуссия о вкладе активных форм кислорода в механизм индуцированной антибиотиками клеточной смерти.
     M.A. Kohanski и ряд других исследователей представили доказательства в пользу того, что наряду с действием на специфические молекулярные мишени, бактерицидные антибиотики стимулируют образование активных форм кислорода (АФК) [1, 2]. В свою очередь высокая концентрация АФК способствует формированию окислительного стресса, в следствии чего в организме происходит процесс повреждения и гибели клеток.
     Актуальность:
     Исследование и понимания механизмов действия антибиотиков через индукцию окислительного стресса в клетках открывает их новые, ранее не известные свойства, которые могут оказывать различное воздействие на клетки организма хозяина. 
     Цель: Исследовать экспрессию промоторов окислительного стресса бактерий soxS и katG рекомбинантных люминесцирующих бактерий при  воздействии антибиотиков.
     Задачи:
     1. Изучить способность антибиотиков ?-лактамного, тетрациклинового, аминогликозидного рядов индуцировать промоторы окислительного стресса бактерий.
     2. Оценить выживаемость микроорганизмов под воздействием антибиотиков.
     3. Изучить механизм действия антибиотиков с использованием неклеточных систем.
     
1 Окислительный стресс у бактерий
     
     1.1 Природа окислительного стресса
     
     
     Для того чтобы анализировать существующие возможности регистрации окислительного стресса, прежде всего необходимо определиться, что же он собой представляет. Среди множества определений наиболее обстоятельным и имеющим свою историю является сформулированное Гельмутом Сисом, который в 1985 году впервые обозначил окислительный стресс как концепцию редокс-биологии. Во вступительном слове к книге (сборнику статей) «Oxidative stress», Сис дал следующее определение: «окислительный стресс есть нарушение баланса прооксидантов и антиоксидантов в сторону преобладания первых». В последующем автор пересматривал данную дефиницию в книге 1991 году «Oxidative Stress: Oxidants and Antioxidants», обозначив окислительный стресс как «нарушение баланса между прооксидантами и антиоксидантами в сторону преобладания прооксидантов, которое может приводить к повреждению», а в 2007 г., учитывая лавину новых сведений о редокс-регуляции, добавив в конец формулировки «… которое приводит к нарушению редокс-сигналинга и редокс-контроля и/или повреждению молекул».В настоящее время понятие «окислительный стресс» по-прежнему активно используется: так, в базе данных PubMed в 2015 г. зарегистрировано 14494 сообщений, в которых употребляется данный термин[3]. 
     Тем не менее, концепция окислительного стресса по-прежнему остается привлекательной для исследователей, поскольку в ней заложен определённый биологический смысл, позволяющий объединить химическую природу активированных кислородных метаболитов (АКМ) и антиоксидантов, физические и биохимические механизмы их действия, в том числе обусловливающие элегантную простоту их универсальности как редокс-регуляторов, с изначальным значением слова «стресс» как общего адаптационного синдрома по Селье. Предпринимаются попытки классифицировать окислительный стресс на основе его интенсивности и динамики [2, 3].
      Продукция активных форм кислорода (АФК) является неизбежным следствием аэробного существования живых систем. Около 90% таких АФК как супероксидный радикал, пероксид водорода, гидроксильный радикал продуцируются в качестве побочных продуктов электронно-транспортной цепи (ЭТЦ) в процессе окислительного фосфолирирования; кроме того, возникновение АФК в клетках является следствием воздействия конкурирующих микроорганизмов и внешних окислительно- восстановительных реакций. На верхней части схемы отображено четырех-электронное восстановление молекулы кислорода в ЭТЦ (Рисунок 1). На нижней части схемы показано последовательное присоединение по одному электрону к молекуле кислорода с образованием промежуточных продуктов – АФК - супероксидный радикал, пероксид водорода, гидроксильный радикал. В конце концов, частично восстановленные формы кислорода могут принимать четвертый электрон и совместно с двумя протонами образовывать молекулу воды [4, 5].
      

      
      Рисунок 1 - Различные пути восстановления кислорода в биологических системах.
      
      АФК воздействуют на все биологические макромолекулы: ДНК, РНК, белки и липиды. В результате разрывов цепи ДНК и модификации азотистых оснований и углеводных остатков нарушается и полностью блокируется репликация.
      Известно более 20 продуктов распада окисленной ДНК, таких как 7,8- дигидро-8-оксогуанин (8-oxo-G), 1,2-дигидро-2-оксоаденин (2-oxo-A), гидроксиметилмочевина, мочевина, тиминовые гликоли, тимин и другие. В основе повреждающего действия пероксида водорода лежит реакция прямого окисления несвязанных внутриклеточных ионов восстановленного железа, частично ассоциированных с молекулой ДНК, приводящая к образованию высокореактивного OH·(реакция Фентона) [6].
      
      H2O2 + Fe2+ + H+ ? ?OH + H2O + Fe3+
      
      Образующийся в ходе реакции гидроксильный радикал является короткоживущим и чрезвычайно активным, вследствие чего реагирует возле сайта своего образовании. Для продолжения реакции необходимо восстановление окисленного железа. Предполагается, что донорами электронов служат тиолы, НАД(Ф)Н, свободные восстановленные флавины. Суперокидный радикал способен напрямую восстанавливать трехвалентное железо.
      
      O2?? + Fe3+ ? Fe2+ +O2
      
      Однако внутриклеточная концентрация O2?? слишком мала, чтобы играть существенную роль в этом процессе. В данном случае более эффективным восстановителем железа считают цистеин. Повреждающее действие супероксидного радикала связывают со способностью высвобождать железо из железо-серных центров дегидратаз, что способствует накоплению свободного железа в цитоплазме и потенцирует реакцию Фентона. При высвобождении железа из мононуклеарных кластеров происходит захват ионов цинка, что приводит к нарушению системы метаболизма клетки [7].
      Свободные радикалы напрямую атакуют полиненасыщенные жирные кислоты мембран, вызывая перекисное окисление липидов. С этим явлением связано повышение текучести мембран и возрастание образования по типу  цепной реакции повреждающих липиды продуктов их полураспада, таких как альдегиды. Приведенные выше изменения ведут к потере целостности мембран, и в конечном итоге к гибели клеток. Содержание в составе мембран бактерий насыщенных и мононенасыщенных жирных кислот делает их более устойчивыми к перекисному окислению, чем в клетках млекопитающих, где мембраны богаты ненасыщенными жирными кислотами.
      АФК вызывают окислительное повреждение белков, что приводит к модификации аминокислот, а именно, к окислению сульфгидрильных групп цистеина и метионина, имидазольных групп гистидина, циклических колец тирозина, фенилаланина, гистидина, триптофана и др. Внутриклеточные белки под действием окислительного стресса могут образовывать нежелательные дисульфидные связи. Это явление получило название «дисульфидный стресс». Появление смешанных дисульфидов с низкомолекулярными тиолами, такими как GSH, приводит, с одной стороны, к утрате их ферментативной активности, с другой стороны, к индукции регуляторного ответа, одним из проявлений которого является активация шаперона Hsp33. Этот шаперон играет важную роль в защите от окислительного стресса, сохраняя окисленные белки в растворенной форме, делая их доступными для регенерации или деградации клеточными протеазами. Некоторые аминокислотные остатки, включая лизин, аргинин, пролин и треонин, окисляются до карбонильных производных, образование которых считается маркером окислительного стресса. В связи с этим разработаны методы определения окислительного повреждения белков, основанные на анализе содержания карбонильных групп [8, 9]
      В ходе окисления супероксид радикалом происходит инактивация железосерных кластеров некоторых ферментов и высвобождение иона Fe2+.
      
      [4Fe-4S] 2+ + O2?? + 2H+ ? [3Fe-4S]+ + H2O2 + Fe 2+
      
      Накопление иона Fe2+ приводит к нарушению ферментативной активности и повышает концентрацию несвязанного железа, в следствии чего происходит гибели клетки в условиях окислительного стресса.
      
      
     1.2Механизмы защиты от окислительногостресса
      
      
      Для борьбы с АФК в клетке существуют специальные механизмы, направленные на их деградацию. Благодаря этому в цитоплазме поддерживается очень низкая (менее 10-8 М) стационарная концентрация АФК. Однако в определенных условиях возрастает скорость продукции АФК или снижаются защитные способности клеток, вследствие чего возникает окислительный стресс (ОС) [10].
      В ходе эволюции живые организмы выработали механизмы поддержания свободных радикалов на допустимом уровне, а также способы репарации окислительных повреждений. Важными компонентами защиты от действия АФК являются низкомолекулярные антиоксиданты, такие как глутатион, витамин Е, аскорбиновая и мочевая кислоты. Глутатион реагирует со всеми видами АФК, включая пероксид водорода, супероксидный радикал, гидроксильный радикал и синглетный кислород. Реакции низкомолекулярных антиоксидантов с АФК протекают как неферментативно, так и с участием ферментов. Например, конъюгацию восстановленного глутатиона с клеточными компонентами, поврежденными АФК катализирует глутатион-S-трансфераза [11, 12].
      В условиях окислительного стресса протекторное действие оказывают также алкилоксибензолы (АОБ) микробного происхождения. С однойстороны,АОБ, обладая антиоксидантными свойствами, снижают уровень АФК. С другой стороны, эти биологически активные вещества обладают способностью модифицировать структуру биополимеров, что в отношении ферментных белков приводит к повышению их активности, функциональной и операционной стабильности в широком диапазоне неоптимальных для катализа условий.
      Основными антиоксидантными ферментами в клетке являются супероксиддисмутазы и пероксидазы. У бактерий дисмутацию O2?? до молекулярного кислорода и пероксида водорода катализируют две цитоплазматических супероксиддисмутазы: Fe-СОД, экспрессия которой модулируется внутриклеточным уровнем железа и Mn- СОД, которая быстро синтезируется при подаче кислорода, и имеет 6 глобальных эффекторов транскрипции кодирующего ее гена soda.Еще одна супероксиддисмутаза (CuZn-SOD) локализована в периплазматическом пространстве и активируется при переходе в стационарную фазу роста[13, 14].
      Пероксид водорода у бактерий E. coliразлагается двумя каталазами: HPI(hydroperoxidaseI), которая особо важна при аэробном росте бактерий и кодируется геном katGпод контролем регуляторного белка OxyRи HPII(hydroperoxidaseII), которая индуцируется в стационарной фазе роста и кодируется геном katEпод контролем ?s(RpoS) субъединицы РНК-полимеразы.
      Система репарации окислительных повреждений ДНК включает в себя эндонуклеазу IV, индуцируемую окислительным стрессом, и экзонуклеазу III, индуцируемую в стационарной фазе роста и в голодающих клетках. Оба фермента действуют на двойную цепь ДНК, гидролизуя связи на 3'-концах[15].
      Окисленные метионин и цистеин могут быть репарированы под действием метионинсульфоредуктаз и дисульфидредуктаз (тиоредоксин и глутаредоксин).
      
      
      
     1.3 Регуляторы окислительного стресса
    
    
      Для защиты от окислительного стресса клетка использует целый ряд антиоксидантных ферментов и систем репарации, большинство которых экспрессируется на низком базальном уровне в нормальных условиях. При воздействии супероксида и перекиси водорода экспрессия многих антиоксидантных белков индуцируется, что зависит в основном от работы двух регулонов - soxRS и oxyR(рисунок 2).
      
      
      
      Рисунок 2 –Принципы работы систем SoxRS и OxyR в клетках микроорганизмов

      Регулон soxRS – это система из двух транскрипционных факторов SoxR и SoxS. Активация данного регулона происходит исключительно в условиях окислительного стресса и может быть вызвана агентами, генерирующими супероксид-анионы, например паракватом [15]. Гены soxS и soxR кодируют два транскрипционных активатора, которые, в конечном счете, запускают экспрессию более 16 других разнообразных генов.
      Белки, экспрессия которых индуцируется системой soxRS, действуют совместно и устраняют возможный ущерб от оксидативного стресса, используя механизмы удаления оксидантов (супероксид дисмутаза), репарацию ДНК (эндонуклеаза IV), восстановление окисленных металлов в простетических группах (флаводоксин и ферредоксин редуктаза) и системы НАДФН (глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа), снижение проницаемости (micF) и экскрецию токсинов (порины). Активация генов регулона soxRS увеличивает устойчивость клетки не только ксупероксид генерирующим агентам, но и к органическим растворителям, а также оксиду азота (II), который может генерироваться антибиотиками [16, 17]. Помимо этого, soxRS отвечает за увеличение концентрации глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (Zwf), что усиливает восстановительную силу клетки, и увеличение количества репрессора метаболизма железа, что приводит к снижению поглощения железа и, следовательно, уменьшает выработку гидроксила. Также под контролем SoxRS системынаходится индукция экспрессии генов, отвечающих на супероксидный стресс. К их числу относятся гены sodA(Mn-SOD), marAB(оперон множественной антибиотикоустойчивости), tolC(белок внешней мембраны), acnA(кодирует аконитазу), fumC(фумараза С), acrAB(эффлюкс-помпа), fur(железосвязывающий регуляторный белок) и другие [18, 19].
        Механизм активации SoxRSрегулона является двухступенчатым. Чувствительным звеном данной системы является белок SoxR, синтезирующийся постоянно на невысоком уровне около ста молекул на клеткуБелок SoxRсвязывается с молекулой ДНК в специфическом сайте и активирует экспрессию гена soxS, в результате чего повышается уровень белка SoxS. SoxS, являясь вторичным транскрипционным фактором, повышает экспрессию всех вышеперечисленных геновSoxRSрегулона, связываясь с их промоторными областями. Активация белка SoxRпроисходит при его окислении супероксидом, а также NO?радикалом с образованием динитрозил-железо/дитиоловых производных. Одноэлектронное окисление и восстановление [2Fe-2S] кластера, схематично представленного на рисунке 3,регулирует транскрипционную активность SoxR. Только окисленный белок SoxRстимулирует экспрессию гена soxSв 30 раз. Предполагают, что вклеткесодержатся специфически редуктазы, поддерживающие [2Fe-2S] кластеры в восстановленномсостоянии [20, 21].
        

        
        Рисунок 3 – Строение железо-серного кластера 
        
      Стоит отметить, что гены soxR и soxS находятся около друг друга и транскрипция реализуется в противоположные стороны, при этом их промоторные области перекрываются. В условиях окислительного стресса SoxR, связывается со своим сайтом, находящимся в области между нуклеотидами минус 10 и минус 35 в промоторной области локуса soxRS (рисунок 4), блокирует собственную транскрипцию и изменяет структуру промотора таким образом, что РНК-полимераза становится способной к активации транскрипции гена soxS. SoxS имеет сайты связывания в промоторах других генов, которые он и активирует в условиях стресса. 
      
      

      Рисунок 4 - Схема локуса soxRS 
      
      Другой транскрипционный фактор, OxyR, активирует синтез около 30 белков, но четко показан контроль через OxyR только для девяти из них. К числу OxyR-регулируемых генов, отвечающих на повышение концентрации Н2О2, относятся katG(кодирует каталазу-гидропероксидазу I), ahpFC(кодирует НАДН-зависимую алкилгидропероксидредуктазу), grxA(кодирует глутаредоксин А), gor(кодирует глутатионредуктазу), dps(кодирует ДНК-защищающий белок), oxyS(кодирует регуляторную РНК).Регулируемые OxyR неспецифический ДНК-связывающий белок Dps (DNA-binding protein from starved cells) и регуляторная РНК OxyS защищают от мутагенеза. Активируется также синтез ряда генов теплового шока и регулятора синтеза капсульных полисахаридов. Оба регулона могут взаимодействовать друг с другом, например, SoxRSрегулон может быть активирован пероксидом водорода[18, 22].
      Белок OxyR является хорошо изученным членом семейства LysR белков-активаторов транскрипции. Аналогично SoxR, для OxyR характерна окисленная и восстановленная форма, при этом восстановленная форма связывается с промотором oxyR и обеспечивает механизм ауторегуляции, а окисленная форма имеет способность связываться со всеми промоторами генов, подконтрольных OxyR [23]. Окисленная форма OxyR инициирует транскрипцию при связывании N-терминального домена с карбокси-терминальным доменом ?-субъединицы РНК-полимеразы (рисунок 5).
      

      
      Рисунок 5 - Активация транскрипции белком OxyR
      
      Активация OxyR (рисунок 6)под действием пероксида водорода происходит в результате окисления остатка Cys199 до сульфеновой кислоты (C199- SOH). Несмотря на активную научную дискуссию, большинство данных указывают на конденсацию остатка Cys208 с сульфеновой кислотой и образование дисульфидной связи, что приводит к выраженным конформационным изменениям в регуляторном домене OxyR[24, 25]. 
      
      
      
      Рисунок 6 – Активация системы OxyRпод действием пероксида водорода
      
      Окисление белка OxyR происходит уже при концентрации пероксида водорода 100нМ с периодом полураспада дисульфидной связи 10 секунд [26]. Такая сверхчувствительность белка необходима для предотвращения повреждений ДНК и ферментов при субмикромолярных концентрациях внутриклеточной перекиси. Инактивация окисленного белка происходит в результате его восстановления с участием глутаредоксина 1 в присутствии глутатиона. SoxRSи OxyR регулоны также вовлечены в ответ на нитрозольныйстресс [27].
      В антиоксидантную защиту клеток вовлечен еще один регулятор – альтернативный транскрипционный фактор sigmaS(RpoS, ?s), регулирующий адаптационный ответ в стационарной фазе. Он кодируется геном rpoSи регулирует активность большого числа генов, в том числе антиоксидантных генов katG, dpsи gor[28].
      
      
     1.4Основные источники свободных радикалов
     
     
     Свободные радикалы представляют собой чрезвычайно реактогенные окислители, играющие важную роль в процессах метаболизма клеток в условиях нормы, а при образовании в избыточных концентрациях - являющиеся факторами дезорганизации всех структур клеток и в конечном итоге их гибели.
     До настоящего времени нет единой классификации этих соединений, не достаточно четко определена их роль в процессах жизнеобеспечения клеток в условиях нормы. Большее количество экспериментальных работ направлено на исследование патогенеза заболеваний инфекционной и неинфекционной природы, в которых свободнорадикальное окисление является типовым процессом дезинтеграции биологических систем, одним из терминальных звеньев развития патологии, независимо от характера инициирующего его этиологического фактора. В ряде работ предпринята попытка разделить образующиеся в клетках радикалы на чужеродные и природные (рисунок 7). Источником чужеродных радикалов могут быть ксенобиотики, а также вода, кислород и другие соединения эндогенного происхождения, подвергшиеся воздействию ионизирующего излучения, ультрафиолетового облучения, интенсивного светового воздействия лазера [29].
     

     
     Рисунок 7 – Основные радикалы организма человека
     
     Природные радикалы делят на первичные и вторичные. К числу первичных радикалов относят супероксид (•ОО-), нитроксид (•NO), убихинон (•Q) – переносчик электронов в дыхательной цепи. Из первичного радикала - супероксида - в процессе его метаболических превращений могут образовываться активные молекулярные соединения: перекись водорода, гипохлорит, гидроперекиси липидов [30]. Взаимодействие первичных радикалов, а также различных веществ с металлами переменной валентности (прежде всего Fe2+) приводит к образованию вторичных радикалов – гидроксила (•ОН) и липидных радикалов (L•,LOO•), обладающих выраженным деструктивным действием на клеточные структуры [31].
     В соответствии с данными литературы свободные радикалы в условиях нормы играют важную роль в процессах жизнеобеспечения клеток в различных биологических системах, участвуя в реакциях окислительного фосфорилирования, биосинтеза простагландинов и нуклеиновых кислот, в регуляции липидного обмена, в процессах митоза, а также метаболизма катехоламинов [32]. Однако их роль в биологических системах чрезвычайно динамична, поскольку свободные радикалы относятся к категории высокореактогенных молекул, избыточное образование которых может достаточно быстро привести к дезорганизации клеточных структур, нарушению функциональной активности клеток.
     Как указывалось выше, основные радикалы, образующиеся в клетках – это радикалы кислорода (рисунок 8) (супероксидный и гидроксильный радикалы), монооксид азота, а также радикалы ненасыщенных жирных кислот и др. Свободные радикалы образуются и в процессе метаболизма ряда ксенобиотиков в макроорганизме.
     
      
     
     Рисунок 8 – Активные формы кислорода
     
     Высокая реактогенность свободных радикалов обусловлена тем, что на внешней электронной орбитали у них находится неспаренный электрон, в отличие от обычных органических молекул. В связи с этим свободные радикалы выступают в роли активных окислителей, захватывающих недостающий электрон от различных соединений и тем самым повреждающих их структуру.
     Как указывалось выше, основным источником свободных радикалов является кислород, к активным формам которого относят диоксид или супероксидный анион-радикал, перекись водорода, гидроксильный радикал, реже в эту группу включают синглетный кислород.
     Стабильным радикалом является оксид азота (NO) – вторичный мессенжер, образующийся из L-аргинина, и активирующий гуанилатциклазную систему.
     Инициация свободнорадикального окисления может быть обусловлена различными причинами, но первостепенную роль в этом процессе играют промежуточные продукты восстановления кислорода. В свою очередь активные формы кислорода могут образовываться интрацеллюлярно в сфере действия оксидазных энзимов, а также экстрацеллюлярно, в частности при участии лейкоцитов [33].
     Как известно, в условиях нормы около 95% молекулярного кислорода подвергается тетравалентному восстановлению с образованием воды в митохондриях в биологическом процессе, связанном с генерацией АТФ. В то же время кислород участвует в процессе метаболизма таких субстратов, как ксантин, гипоксантин, L- и D-аминокислоты. Атомы водорода от этих соединений с помощью флавиновых коферментов переносятся непосредственно на молекулярный кислород, минуя систему цитохромов и цитохромоксидазы. Конечным продуктом окисления субстратов в этих реакциях является перекись водорода. В балансе тканевого дыхания на долю этих реакций с образованием в качестве конечного продукта перекиси водорода приходится около 5-7%. Образующаяся в этих реакциях перекись водорода или разлагается каталазой, или используется в реакциях, катализируемых пероксидазой, содержащейся в значительных количествах в пероксисомах клеток печени и почек [34, 35].
     В инициации образования перекиси водорода играют роль флавожелезопротеиды, медьсодержащие оксидазы, молибденсодержащие ферменты (ксантиндегидрогеназа, ксантиноксидаза, альдегидроксидаза). Перекись водорода не является в прямом смысле свободным радикалом, однако, обладает способностью инициировать свободнорадикальное окисление, поэтому является цитотоксическим соединением.
     Как указывалось выше, основная часть молекулярного кислорода подвергается тетравалентному окислению в митохондриях с образованием воды в системе, сопряженной с синтезом АТФ.
     Касаясь структуры митохондрий, следует отметить, что в митохондриальном матриксе находятся все специфичные дегидрогеназы, обеспечивающие реакции цикла трикарбоновых кислот, ?-окисление жирных кислот. На внутренней митохондриальной мембране локализована система переносчиков протонов и электронов (дыхательная цепь) и АТФ – синтетазная система. В составе наружной митохондриальной мембраны обнаружены ферменты типа МАО (моноаминоксидаза), ферменты обмена фосфолипидов, а также ферменты, обеспечивающие удлинение цепей жирных кислот до С18[36, 37]. Пространство между обеими мембранами заполнено коллоидной суспензией, обладающей активностью аденилатциклазы и ферментов, катализирующих фосфорилирование АДФ, не связанное с окислением субстратов. Наружная митохондриальная мембрана свободно пропускает достаточно крупные молекулы с молекулярной массой до 10 кДа, тогда как внутренняя – не способна обеспечивать пассивный транспорт даже низкомолекулярных соединений. Типичными составляющими внутренней митохондриальной мембраны являются кардиолипин, убихинон, цитохромы, ряд транспортных белков – ферментов, участвующих в транспорте электронов водорода (Н+) [38].
     Касаясь общей организации процесса переноса электронов, следует отметить, что в каждом обороте цикла лимонной кислоты специфичные дегидрогеназы отщепляют от изоцитрата, ? - кетоглутарата, сукцината и малата четыре пары атомов водорода, которые в определенной точке отдают свои электроны в цепь переноса электронов и, таким образом, превращаются в Н+. Электроны в конце дыхательной цепи достигают цитохрома аа3, или цитохромоксидазы, при участии которой они передаются на кислород. В результате, при взаимодействии двух ионов водорода с двумя электронами кислорода, образуется молекула воды. Следует отметить, что на каждую пару электронов, переданных по дыхательной цепи от НАДН к кислороду, синтезируется 3 молекулы АТФ [39].
     Главной задачей митохондрий является обеспечение макроэргами энергозависимых внутриклеточных реакций. Согласно с хемиосматической теории английского биохимика Питера Митчелла, атомы водорода, отобранные от субстратов в дыхательной цепи или системе транспорта электронов, превращаются в протоны, которые через .......................