Изучение морфогенетического потенциала OriganumvulgareL в культуре invitro

ВВЕДЕНИЕ
     
     Душица обыкновенная широко используется как седативное, кровоостанавливающее, противовоспалительное, болеутоляющее и антисептическое средство. Она стимулирует секрецию пищеварительных желез, перистальтику желудочно-кишечного тракта и желчевыделение, обладает отхаркивающим и санирующим дыхательные пути свойством,усиливает лактацию, тонизирует гладкую мускулатуру матки, повышает мочеотделение /26/, /33/.
     Также ее применяют в качестве пряности в пищевой промышленности, а эфирное масло нашло применение в парфюмерной/29/, /51/.
     В душице содержится множество полезных биологически активных веществ, на содержание которых ведётся селекция/27/. Для повышения её эффективности можно использовать культуруinvitro, так как она имеет ряд преимуществ: высокий коэффициент размножения, сокращение сроков селекции и получение генетически однородного оздоровленного посадочного материала/84/.
     Целью данной работы является изучение морфогенетического потенциала OriganumvulgareL. в культуре invitro. 
     Всвязи с этим были поставлены следующие задачи:
     1. введение семян O. vulgareразличных сортовв культуру invitro;
     2. оценка динамики роста асептических растений O. vulgare;
     3. подбор оптимальных условий дляклональногомикроразмноженияO.vulgare;
     4. подбор оптимальных условий длякаллусогенезаO. vulgare.
     
     
     

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
     
     1.1 Систематическая характеристикаO. vulgare
     Душица обыкновенная (O. vulgare) имеет следующее систематическое положение/60/, /78/:
Отдел: 
Magnoliophyta, Angiospermae (Покрытосеменные, или Цветковые, растения)
Класс: 
Magnoliopsida, Dicotyledones (Магнолиопсиды, или Двудольные)
Порядок: 
Lamiales (Ясноткоцветные)
Семейство: 
LamiaceaeMart. (Яснотковые) = LabiataeJuss. (Губоцветные)
Род: 
Origanum (Душица)
Вид: 
Origanumvulgare (Душица обыкновенная) 

     1.2 Ботаническое описаниеO. vulgare
     Душица обыкновенная является представителем семейства Яснотковые(Lamiaceae). Это многолетнее травянистое растение высотой от 30 до 90 см, с многочисленными четырехгранными, ветвистыми, зелеными или пурпурно окрашенными стеблями, часто при основании разветвленными, иногда мягкоопушенными/53/, /67/, 87/.
     Все растение слегка опушено короткими волосками. Листьясупротивные, цельнокрайние или мелкозубчатые, продолговато-яйцевидной формы, длиной до 5 см; сверху темно-зеленые, снизусветлее, также на листьях имеются просвечивающие черные точками, на коротких черешках.Длина черешка в средней части побега – 0,4 см, в нижней –1 см /5/, /15/, /49/. 
     Чашечка колокольчиковидная, около 3 мм длины, с 13 жилками и пятью треугольно-ланцетными зубцами, в 2...2,5 раза короче трубки,зелёного или пурпурного цвета, голая или с редкими волосками, и с волосистым кольцом в зеве/1/, /4/, /67/, /94/. 
     Прицветники длиннее чашечки, яйцевидно-эллиптические или продолговатые, острые, обычно темно-пурпурные, реже зеленые /8/, /16/, /35/. 
     Венчик – неясно-двугубый, окрашен в пурпуровый, светло-пурпуровый или лилово-розовый, иногда белый цвет, из чашечки выглядывает трубка/1/, /46/, /74/, /94/.
     Мелкие цветки, собраны в раскидистые щитковидные метелки до 10 см шириной и до 15 см длиной /32/, /51/, /53/, /61/.
     У душицы встречаются как обоеполые, так и чисто женские растения (гинодиэция), а также растения, несущие обоеполые и женские цветки (гиномонэция). У гиномонэцичных растений число функционально женских цветков не превышает 5% от их общего количества на одном растении. Соотношение женских и обоеполых растений примерно 1:1 /22/, /71/.
     Размеры цветков у обоеполых растений крупнее (8,9 ± 0,7 мм), а функционально женских – мельче (5,3 ± 0,3 мм). Обоеполые цветки несут 4 тычинки: 2 верхние почти в 2 раза длиннее нижних и располагаются под верхней губой, выступая из трубки венчика. У функционально женских цветков тычинки редуцированы /3/, /9/, /10/, /21/, /48/.
     Цветет душица в июне-августе.
     Плоды душицы – коричневато-бурые блестящие орешки, сидящие в чашечке по четыре в каждой. Плодоношение наступает в августе-сентябре /42/.
     Масса 1000 семян по данным различных источников варьирует в пределах 0,05...0,20 г /13/, /17/, /66/, /79/.
     Подземная часть душицы обыкновенной представлена ветвистым шнуровидным косым ползучим корневищем с тонкими длинными придаточными корнями, преимущественно расположенными в поверхностном слое почвы /1/, /47/, /49/.
     
     1.3 Ареал и экологияO. vulgare
     Родиной O. vulgareявляется Средиземноморье /7/, /19/, /39/, /40/, /55/, /58/, /62/, /93/. Душица – евро-азиатский вид. Чаще всего она встречается на Кавказе, в европейской части России (кроме Арктики) и в южной Сибири /1/, /11/, /17/, /26/, /32/, /50/, /72/.
     Душица предпочитает легкие супесчаные и суглинистые почвы с достаточным увлажнением. Ее можно встретить на пойменных, суходольных, лесных, реже степных лугах, в разреженных березовых и хвойных лесах, по их опушкам и в кустарниках. В горах душица приурочена к нижнему лесному поясу и лесистым долинам рек /14/, /34/, /43/, /49/. Душица является лесостепным растением, она принадлежит к луговолесному или лесолуговому-лугово-степному эколого-ценотическому элементу. Как правило,O. vulgareсплошных зарослей, не образует, арастёт одиночными растениями и группами /51/, /56/, /69/.
     
     1.4 Химический составO. vulgare
     В надземных ее органах содержатся красящие и дубильные вещества (4,4...14,3%), сравнительно высокий процент эфирного масла (до 1,2%), содержащего фенолы (тимол и карвакрол), кариофиллен, линалоол, сабинен;тритерпеноиды (0,3 %): урсоловая и олеиновая кислоты; витамины B2, C, B12; алкалоиды; антоцианы (1,3 %); флавоноиды (7,5 %); свободные спирты (до 15%); геранилацетат. Листья содержат 565 мг% аскорбиновой кислоты, цветки – 166 мг% и стебли – около 58 мг%. Семена содержат до 28 мг% жирного масла /64,/ /71/. 
     Эфирное масло душицы может быть бесцветным или от бледно-лимонного до желтого /6/, /32/, /73/. Запах эфирного масла пряный, древесный, приятный и сильный/46/, /54/, /73/.
     Для O. vulgare характерен значительный полиморфизм по массовой доле эфирного масла и его локализации в органах растений.
     Качественный состав эфирного масла O. vulgareопределяется методами газожидкостной (ГЖХ) и тонкослойной хроматографии (ТСХ). В нем было идентифицировано более 40 компонентов. Наиболее часто встречаются следующие компоненты: ?-пинен, ?-пинен, мирцен, селинен, камфен, сабинен, оцимен, лимонен, спатуленол, ?-терпинен, ?-кариофиллен, борнеол, гермакрен D, 1,8-цинеол, ?-терпинеол, ундеканон-2, кариофилленоксид, тимол, тимолацетат, карвакрол, метиловые эфирыкарвакрола и тимола/2/, /6/, /25/, /29/, /52/, /65/, /66/, /70/, /95/.

     1.5O. vulgareкак лекарственное и пряно-ароматическое растение
     O. vulgareвходит в фармакопеи многих стран. Трава душицы– верхняя часть побегов с цветками и листьями, служит лекарственным сырьём/15/, /41/. 
     В трактатах Аристотеля, Диоскорида и Аристофанавстречаютсяупоминания о душице как о лекарственном растении. Авиценна также описывал O. vulgareкак растение, применяемое при лечении заболеваний суставов и органов пищеварения. Такжеон отметил тот факт, что траву этого растения следует жевать для снятия зубной боли и очищения зубов от налета и камней /20/, /23/, /40/, /68/.
     Препараты душицы широко используют при бессоннице, гипо- и анацидных гастритах, атонии кишечника, а также в качестве отхаркивающего средства при бронхитах и бронхоэктазах и как средство, возбуждающее аппетит /94/.
     Экспериментально было доказано, что препараты душицы обладают успокаивающим действием на центральную нервную систему, а также усиливают секрецию пищеварительных и бронхиальных желёз, перистальтику кишечника /18/, /26/, /92/. Установлено, что душица вызываетгибель клеток рака толстой кишки человека /89/. O. vulgare также используют при анемии, анорексии, гипертиреозе, холециститах, хроническом энтероколите, как жаропонижающее средство, а также при воспалении дыхательных путей, бронхиальной астме, стоматитах, гингивите, фарингите, пародонтозе /4/, /13/, /58/, /74/. Душица снимает спазмы желудка, предупреждает рвотуи тошноту, обладает противосудорожным действием /23/, /36/. Препараты душицы применяют при менструальных нарушениях, у кормящих матерей они усиливают лактацию, также они облегчают болезненное состояние при климаксе /19/, /23/, /24/, /32/, /40/, /44/,/45/, /59/. 
     Эфирное масло душицы оказывает бактерицидное действие на широкий спектр бактерий: Staphylococcusaureus, St. epidermmidis, St. saprophyticus, St. «conon», Streptococcuspneumoniae, Str. pyogenes, Str. faecium, Candidaalbicans, C. utilis, C. tropicalis, C. rugosa, Pseudomonasaerginosa, Klebsiellapneumoniae, Citobacterfreundii, Enterobactercloacae, Enterobacteraerogenus, Escherichiacoli, Salmonellaenteitidi, S. typhimuriu, Shigellaflexneri, Sarcinalutea/27/, /28/, /37/. 
     Эфирное масло душицы проявляет широкий спектр антибиотической активности в отношении представителей микрофлоры, вызывающей внутрибольничные (госпитальные) инфекции. Экспериментально доказано, что эфирное масло душицы может служить альтернативным источником санаций больничных помещений. Оно не обладает аллергенными свойствами /27/, /28/, /29/.
     Настой душицы применяют при гипертонической болезни, простудных заболеваниях, как противоспазматическое, кровоостанавливающее и успокаивающее средство, заболеваниях почек и воспалении печени, при ревматизме, параличах, от удушья, при общей слабости, душевном дискомфорте, как легкое снотворное /57/.
     Экстракт травы O. vulgareявляется составной частью комплексного препарата  под названием «Уролесан», который используют при заболеваниях моче- и желчевыводящей систем (пиелонефрит, гепатит, холецистит, желчно- и почечнокаменная болезнь) /18/, /25/,/45/,  /63/. Душица обыкновенная входит в состав некоторых мазей, применяемых наружно, а также различных (грудных,сердечных, желудочных, мочегонных, потогонных и ветрогонных) травяных сборов и лекарственных чаёв /19/, /26/, /51/, /56/. Наружно водные настои O. vulgareприменяются при различных кожных заболеваниях, например, таких как: экзема, псориаз, зудящие дерматозы, псориатическийполиартрит, кожный зуд,нейродермит,почесухаи других/13/, /51/, /56/. Препараты душицыэффективны при выпадении волос, пузырчатых и себорейных дерматитах, красном плоском лишае, фурункулах, нарывах, отёках, длительно незаживающих ранах (особенно при повреждениях слизистых оболочек), угревой сыпи, герпесе /31/, /40/, /44/, /46/. 
     Душицу используют не только в качестве лечащего средства, но и какпряно-ароматическое растение. Свежая и сушеная трава O. vulgareиспользуется в качестве пряности, известной во всём мире под названием «орегано» или «пицца-пряность» /40/. Большинство сортов итальянских пицц не обходятся без приправ из душицы /13/, /41/.Листья душицы как пряность добавляются к разным блюдам, они служат хорошей добавкой к различным салатам, спагетти, супам и соусам /20/, /39/, /65/, /76/. Употребляется пряность при приготовлении мяса, колбас, консервов, при засолке огурцов, грибов и томатов. В Германии она известна как колбасная трава/12/, /20/, /67/, /76/, /77/.
     При приготовлении (ароматизации) чайных напитков душица незаменима, так как онапридает имприятный, тонкийаромат и вкус/20/, /51/, /56/, /77/.При изготовлении горьких настоек, вин, вермутов, пива и кваса, O. vulgareпросто незаменима, так как этим напиткам она придает приятный запах и способность долго сохраняться /11/, /77/. Широко используется в домашней выпечке: в булочках, лепешках, пряниках.
     При изготовлениисиропов,мармеладов, желе, в ликероводочном производстве, в мариновании и в солениях: огурцов, капусты, грибов душица незаменима. Соления приобретают приятный вкус, запах и дольше сохраняются /5/, /7/, /11/, /43/, /63/, /77/.
     Для наилучшего сохранения своих ценных свойств в течение долгого времени (два-три года)пряно-ароматическое сырьеO. vulgareстоит хранить в закрытых стеклянных банках /13/, /19/, /63/.
     Также ее используют в парфюмерном для ароматизации паст, помад икосметики /2/, /46/, /53/, /63/, /76/, /88/ и в косметическом производстве, для отдушки мыла, лосьонов,духов и туалетной воды /65/, /76/, /88/. 
     Душица обладает красящими свойствами, изнадземной части растения, в точности из цветков, получают оранжево-красную краску для окрашивания шерсти, трава совместно сжелезным купоросомдает чёрную краску для покраски хлопка /1/, /11/, /12/.
     O. vulgare является хорошим медоносным растением, дает много нектара; пчёлы охотно посещают их цветки /1/, /41/, /53/, /65/,  /75/. 
     Не смотря на такое количество положительных свойств, душица имеет и отрицательные свойства.Было установлено, что она токсична для некоторых насекомых и их личинок /38/, /83/, /84/, /85/, /91/.
     Также душица является хорошим декоративным растением /12/. 
     
     1.6 КультивированиеinvitroO. vulgare
     По тематике O. vulgareinvitroбыло сделано немало работ. Одна из работ Якимовой О.В. посвящена изучению влияния состава питательной среды и генотипа на клональноемикроразмножение душицы invitro/81/. Материалом для данного эксперимента служили сегменты стебля с одним узлом растений селекционных образцов, которые выращивали в теплицах. Для стерилизации эксплантов были использованы два агента с последовательным применением: 70 %-ный этанол и 50 %-ныйБрадофен. Для введения асептических эксплантов в культуру было испытано 11 вариантов состава питательной среды, среди них хорошие результаты показала только одна среда МС с добавлением 1,0 мг/л БАП. Именно на этой среде был отмечен высокий коэффициент размножения.
     Для второго этапа клональногомикроразмножения очень важен коэффициент размножения и высокая жизнеспособность культивируемых растений, в связи с этим было протестировано 20 модификаций питательных сред, среди которых лишь одна отвечала требованиям – МС + 0,5 мг/л БАП.
     Немаловажным в клональноммикроразмножении является укоренение полученного материала. Было испытано 7 типов питательных сред, среди которых наилучшие результаты показала среда МС с добавлением 1,0 мг/л ИМК.
     На последнем этапе микроразмножения главной задачей является адаптация полученных растений к почвенным условиям. В результате эксперимента было установлено, что оптимальным субстратом для адаптации растений к invivo была смесь торфа и перлита в соотношении 1:1. На этом субстрате была отмечена 100 %-ная приживаемость растений /81/.
     Якимова О.В. совместно с Егоровой Н.А. работала над индукцией каллусогенеза в культуре изолированных органов O.vulgare. В качестве исходного материала были использованы семена, сегменты стебля, листа и черешка растений селекционного образца O. vulgare/80/. Из 16 модификаций питательных сред только МС с добавлением 1,0 мг/л 2,4-Д + 0,5 мг/л БАП отличалась высокой частотой образования каллуса с дальнейшим его приростом. Каллус формировался рыхлый, оводненный, бежевого цвета.
     В работе было показано, что в качестве экспланта для индукции каллусогенеза стоит использовать черешки листа и что на индукцию каллусогенезаinvitroоказывает влияние сезон эксплантации (в весенний и зимний периоды частота каллусогенеза была в 2...4 раза выше по сравнению с летней) /80/.
      В работе ученых из Иордании (2006) стерилизацию семян душицы проводили путем выдерживания их в 5 %-ном растворе гипохлорита натрия с добавлением двух капель препарата Tween-20® в течение 15 мин., затем в 70 %-ном этаноле в течение 30 с. Затем семена помещали на питательную среду МС + 2,0 мг/лгибберелловой кислоты.
     Индукцию каллусогенеза проводили путем культивирования листовых эксплантов на питательной среде с добавлением 2,4-Д в различных концентрациях. Наилучший результат был достигнут на питательных средах с низким содержанием фитогормона 2,4-Д (0,1 или 0,5 мг/л). Выращивание каллуса проводили на питательных средах, дополненных БАП и ТДЗ. Наиболее крупный каллус (12,5 см) был получен на питательной среде МС с добавлением ТДЗ в концентрации 1,0 мг/л для O. vulgareи 1,5 мг/л для O. syriacum/82/.
     РастенияO. syriacum, выращенные в условиях теплицы, дали более высокий выход масла и тимола (1,76% и 13,1%, соответственно), чем растения, выращиваемые invitro (1,17 % и 5,9 %, соответственно). Выход масла у растений O. vulgareinvitro был незначительным, и в нем тимол не был идентифицирован /82/.
     В ходе эксперимента 2017 года группой ученых было установлено, что наиболее эффективно стеблевой органогенез протекает из узлов растений на питательной среде МС с добавлением 0,5 мг/л БАП и 0,1 мг/л ГК /90/. После чего, полученные микрорастения пересаживали на питательные среды с добавлением ИМК для лучшего образования корневой системы. Было установлено, что наибольший процент корней образовывался в концентрациях 1,5 мг/л и 2,5 мг/л ИМК, а акклиматизация к почвенным условиям лучше проходила у растений, выращенных на питательной среде 1,5 мг/л ИМК. В качестве почвы была использована смесь торфа и перлита в соотношении 1:1 /90/.
     O. vulgare ценится из-за своего эфирного масла, синтезированного в железистых структурах, обильно расположенных на листовой поверхности растения. Состав эфирных масел подвергается изменениям действующих принципов, частично из-за использования гетерогенных популяций в сельскохозяйственных целях. Исследования показали, что можно улучшить качество культивируемых растений в полевых условиях с использованием методов микропропагации. Так, Fortunatoetal. (2006)был разработан протокол для размножения invitro генотипа O.vulgare, в котором был проведен гистологический анализ железистых трихом и дана химическая характеристика эфирных масел. Было установлено, что протокол микроразмноженияэффективен, что позволяет получить клон из уникального генотипа /86/.
     
     
     
     
     
     
     
     
     

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
     
     2.1 Растительный материал
     Объектом исследований являлась душица обыкновенная (O. vulgare) четырех сортов: Фея, Медовый аромат, Северное сияние, Хуторянка. Исходным материалом для введения в культуру invitro служили семена. 
     Фея (производитель –селекционно-семеноводческая фирма Гавриш, оригинатор – ФГБНУ «Федеральный научный центр овощеводства»). Лекарственное многолетнее растение с сильным приятным ароматом. Цветет с июля по сентябрь. Растение высотой 40...60 см, с матово-зелеными яйцевидными листьями, покрыто мягкими щетинистыми волосками. Мелкие малиново-розовые цветки собраны в щитковидные соцветия. Посев на рассаду производят в марте. Рассаду высаживают в открытый грунт в мае-июне, оставляя между растениями 20...30 см, между рядами – 50...60 см. Посев семян в открытый грунт производят в мае-июне. Надземную часть собирают во время цветения, затем ее используютлекарственных целях. Применяют настой душицы при заболеваниях органов дыханиякак отхаркивающее средство, дляулучшения пищеварения и возбуждения аппетита, при заболеваниях печени, туберкулезе легких, судорогах, эпилепсии, неврозах, гипертензии, для лечения гинекологических заболеваний.
     Медовый аромат (производитель – Русский Огород,оригинатор - ООО «Агрофирма Аэлита»). Травянистый многолетник, все части которого обладают характерным сильным ароматом. Молодые побеги и листья душицы используют в свежем и сушеном виде, а также при консервировании, ав качестве приправы к мясным, овощным, картофельным блюдам. Придаст неповторимый аромат чаю, напиткам, домашней выпечке, мармеладу, желе, сиропам. Урожайность зелени 3,2-3,5 кг/м2.
     Северное сияние(производитель – Русский огород,оригинаторы - ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Всероссийский институт генетических ресурсов растений имени Н.И.Вавилова», ЗАО Научно-производственная фирма «Российские Семена», ООО «Евро-Семена»). Многолетнее растение высотой до 50 см, все части которого обладают характерным ароматом. Период от массового отрастания до первой срезки 62 дня. Куст прямостоячий, с многочисленными, хорошо облиственными побегами. Лист темно-зеленый, овальный, с ровными краями. Цветок мелкий, пурпурно розовый. Урожайность зеленой массы 1 кг/м2. В свежем и сушеном виде листья и молодые побеги используют в качестве приправы к овощным блюдам и при консервировании.
     Хуторянка (производитель – Авторские сорта и гибриды, оригинатор - ООО «Агрофирма Поиск»). Хороший медонос. Многолетнее растение, на одном месте растет до 10 лет. Период от массового отрастания до начала цветения (первой срезки) 65 дней. Растения высотой до 60 см, прямостоячее, среднее число ветвей 1-го порядка до 10 штук. Облиственность высокая. Лист среднего размера, темно-зеленый, без антоциана. Край листа цельнокрайний или мелкозубчатый. Листья опушенные. Цветок мелкий, темно-розовый. Рекомендуется для использования листьев и молодых побегов в свежем и сушеном виде как приправы к овощным блюдам, так и при консервировании. Предпочитает солнечные места и легкие плодородные почвы. При температуре +15...18°С всходы появляются на 14...15-ый день. В народной медицине в качестве успокаивающего средства, при простудных заболеваниях, как антибактериальное средство и прочих заболеваниях применяют отвары и настои. С лечебной целью используют цветущие облиственные стебли душицы.
     
     2.2 Введение в культуру invitro семян O. vulgare
     Для получения асептического растительного материала проводилась стерилизация семян путем выдерживания их в 5 %-ном растворе гипохлорита натрия (NaOCl, коммерческий продукт «Белизна») в течение 5, 10 и 15 минут с последующей двукратной промывкой в стерильной дистиллированной воде. Стерилизацию семян и введение их в культуру invitro проводили в ламинар-боксе. Простерилизованные семена помещали на питательную среду Мурасиге и Скуга (МС) в чашки Петри по 10 штук стерильными инструментами. На каждый вариант брали по 5 чашек. Затем чашки Петри с семенами находились в световой комнате (21 °С, 16-часовой фотопериод, освещение 3000 люкс). В ходе эксперимента отмечались сроки появления всходов с момента закладки опыта и доля проросших семян. В качестве контроля семена проращивали в нестерильных условиях на фильтровальной бумаге в чашках Петри. Повторность всех опытов 5-кратная. 
     
     2.3 Оценка динамики роста асептических растений O. vulgare
     Асептические проростки O. vulgareпри достижении размера 1,5...2 см пересаживали в контейнеры на питательную среду Мурасиге и Скуга (МС) без добавления фитогормонов и регуляторов роста. Через определенные промежутки времени учитывали длину побегов и их количество, количество листьев. Пересадка проростков осуществлялась в стерильных условиях в ламинар-боксе. 
     
     2.4 Подбор оптимальных условий для клональногомикроразмноженияO. vulgare
     Растительный материал для микроклонального размножения был взят из опыта, описанного в разделе 2.3. В качестве микрочеренков брали побеги длиной 0,5...1 см с одним узлом. Их помещали на следующие питательные среды:
     - МС без добавления фитогормонов и регуляторов роста, 
     - МС + 1,0 мг/лИУК, 
     - МС + 1,0мг/лИМК, 
     - МС + 0,5 мг/л БАП,
     - МС + 1,0 мг/л БАП.
     В процессе культивирования был проведен учет высоты растений, количества листьев, эффективности образования каллуса и корней. Также была учтена жизнеспособность микрорастений. Клональноемикроразмножение проводили в ламинар-боксе. Условия культивирования такие же, как в опыте, описанном в разделе 2.2.
     
     2.5 Подбор оптимальных условий для каллусогенезаO. vulgare
     Для проведения экспериментов по индукции каллусогенеза были использованы растения из опыта, описанного в разделе 2.3. Экспланты(листья, черешки, междоузлия, узлы) размером 0,5 см помещали на питательные среды: 
     - МС + 1,0мг/л 2,4-Д + 0,5мг/лБАП;
     - МС + 1,0 мг/л2,4-Д + 0,5мг/лкинетин;
     - МС + 1,0 мг/л НУК + 0,5мг/лкинетин, 
     - МС + 1,0мг/л НУК + 0,5мг/л БАП. 
     Учет частоты каллусогенеза и органогенеза проводили на 7-е и 14-е сутки. Условия культивирования такие же, как в опыте, описанном в разделе 2.2.
     
     2.6 Статистическая обработка данных
     Статистическую обработку данных проводили по стандартным методикам с использованием статистических функций приложения MicrosoftOfficeExcel.
     
     

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ РАБОТЫ
     
     3.1 Введение в культуру invitro семян O. vulgare
     Стерилизация материала проводилась по методике, описанной в главе 2. Учет проросших семян проводили каждые 2...3 суток. Энергию прорастания рассчитывали на 7-е сутки, всхожесть – на 21-е. Результаты представлены в табл. 3.1.
     
Таблица 3.1 – Энергия прорастания и всхожесть семян O. vulgare
Сорт душицы
Экспозиция, мин.
Энергия прорастания,%
Всхожесть,%




Фея
5
16,0
24,0

10
24,0
28,0

15
30,0
34,0

К
42,0
46,0
Медовый 
аромат
5
60,0
62,0

10
50,0
62,0

15
38,0
66,0

К
68,0
84,0
Северное 
сияние
5
6,0
26,0

10
4,0
28,0

15
2,0
28,0

К
10,0
30,0
Хуторянка
5
60,0
76,0

10
50,0
62,0

15
66,0
78,0

К
56,0
62,0
НСР05(фактор А)
12,1
12,0
     
     Дляоценки достоверности различий между опытными вариантами был проведен 2-факторный дисперсионный анализ (фактор А – сорт, фактор Б – режим стерилизации). Только по фактору А (сорт) фактическое значение критерия Фишера превысило табличное (Fфакт. >Fтабл.). По фактору Б (режим стерилизации) и по взаимодействию факторов дисперсионный анализ не выявил существенных различий.
     

Рис. 3.1.Всхожесть семянO.vulgareразличных сортов при разных режимах стерилизации 
     
     Как можно видеть из табл. 3.1 и рис. 3.1, большое влияние на всхожесть и энергию прорастания оказал сорт душицы обыкновенной. Среди взятых нами сортов можно выделить два абсолютных лидера – это Медовый аромат и Хуторянка. Во всех четырех опытах их всхожесть была выше 60 %. Также нужно отметить, что для Хуторянки стерилизация семян привела к увеличению всхожести на 12...14 %, что нельзя сказать про другие сорта – после стерилизации их всхожесть уменьшилась. Для получения асептического материала можно использовать любое время стерилизации, так как между экспозициями не наблюдалось существенной разницы.
     


3.2 Оценка динамики роста асептических растений O.vulgare
     После достижения проростками высоты 1,5…2 см их пересаживали в контейнеры на безгормональную питательную среду МС. При культивировании наблюдали такие параметры как высота растений и их облиственность. Измерения проводили каждые 10 суток. Данные динамики роста растений душицы представлены в табл. 3.2 и рис. 3.2.
     
Таблица 3.2 – Динамика роста асептических растений O. vulgare
Режим стерилизации (экспозиция, мин.)
Измерение на … сутки от начала пассажа
Сорт душицы


Фея
Медовый аромат
Северное сияние
Хуторянка
5
10
0,8
0,6
0,7
0,9

20
1,5
1,7
1,1
1,6

30
2,1
3,9
1,8
3,5

40
3,4
5,4
2,5
4,3

50
5,8
7,7
4,2
5,7
10
10
0,7
0,3
0,9
0,9

20
1,5
0,5
1,5
2,5

30
2,1
0,7
2,8
5,6

40
2,9
0,8
4,1
7,0

50
3,8
1,2
5,6
8,3
15
10
0,6
0,9
0,9
0,6

20
1,4
2,0
1,8
1,2

30
2,8
3,4
2,5
2,2

40
4,9
5,1
3,9
3,4

50
6,8
6,6
5,1
5,8
НСР05 (взаимодействие факторов)
3,6

     Дляоценки достоверности различий между опытными вариантами был проведен 2-факторный дисперсионный анализ (фактор А – сорт, фактор Б – режим стерилизации). Значительные различия наблюдались при взаимодействии факторов – фактическое значение критерия Фишера превысило табличное (Fфакт.>Fтабл.). В остальных случаях (по фактору А (сорт) и Б (режим стерилизации) существенных различий не наблюдалось.
     

Рис. 3.2. Высота асептических растений O. vulgare различных сортов при разных режимах стерилизации
     
     На рост растений душицы обыкновенной большое влияние оказало взаимодействие двух факторов: сорта и продолжительности стерилизации, в связи с этим выделить наилучший режим для всех сортов не представляется возможным. Так, у сорта Фея наиболее высокие растения наблюдались в опыте с экспозицией стерилизации 15 минут, у Медового аромат – 5 минут, у Северного сияния и Хуторянки – 10 минут.
     Листья выполняют такие жизненно важные функции как фотосинтез, транспирация и газообмен; к тому же листья являются хранилищем множества биологически активных веществ. Учет количества листьев проводили каждые 10 суток. Результаты учета представлены в табл. 3.3 и рис. 3.3.
     




Таблица 3.3 – Динамика образования листьев уасептических 
растений O. vulgare
Режим стерилизации (экспозиция, мин.)
Измерение на … сутки от начала пассажа
Сорт душицы


Фея
Медовый аромат
Северное сияние
Хуторянка
5
10
3,0
5,2
5,4
8,2

20
5,0
10,6
9,0
10,8

30
7,0
18,6
13,6
15,2

40
7,0
29,9
17,4
21,6

50
11,3
37,0
21,3
29,1
10
10
5,7
5,2
10,0
8,6

20
7,2
9,2
13,2
12,8

30
9,0
10,8
17,6
20,2

40
12,0
14,0
22,6
25,8

50
19,7
18,0
28,0
25,5
15
10
7,6
10,6
9,7
8,0

20
21,8
18,6
15,0
11,8

30
36,4
29,6
20,2
20,8

40
42,0
38,0
25,2
25,6

50
59,0
43,6
26,5
27,7
НСР05 (Фактор Б)
      10,1
НСР05 (Взаимодействие факторов)
12,2
     
     Дляоценки достоверности различий между опытными вариантами был проведен 2-факторный дисперсионный анализ (фактор А – сорт, фактор Б – режим стерилизации). Фактическое значение критерия Фишера превысило табличное (Fфакт.>Fтабл.) по факторуБ (режим стерилизации) и по взаимодействию факторов. По фактору А (сорт) существенных различий обнаружено не было.
     

Рис. 3.3. Количество листьев у асептических растений O. vulgare различных сортов при разных режимах стерилизации
     
     Из-за того, что на данный опыт оказало влияние взаимодействие факторов, четко выделить экспозицию, при которой у всех сортов наблюдалась высокаяоблиственность, не представляется возможным. Для получения наиболее облиственных растений можно порекомендовать следующее соотношение сорт-экспозиция: сорт Фея – 15 минут, сорт Медовый аромат – 5 или 15 минут, Северное сияние и Хуторянка – 5...15 минут.
     
     3.3 Подбор оптимальных условий для клональногомикроразмноженияO. vulgare
     3.3.1 Оценка динамики роста микрорастенийO. vulgare
     Первые достижения в области клональногомикроразмножения были получены еще в конце 50-х годов XX века. Французский ученый ЖоржМорель получил первые растения-регенеранты орхидей.В России в 60-х годах в лаборатории культуры тканей и морфогенеза Института физиологии растений имени К.А. Тимирязева РАНбыли начатыработы по клональномумикроразмножению. Под руководством чл.-корр. РАН, академика РАСХН Бутенко Р.Г. были изучены условия микроразмножения ряда растений, таких как картофель, сахарная свекла, гербера, гвоздика, фрезия и некоторые другие растения, также были предложены промышленные технологии. С годами клональноемикроразмножение набирало обороты. В настоящее время посредством культуры тканейпроизводитсяболее одного миллиарда продаваемых декоративных растений.
     Клональноемикроразмножение проводили по методике, описанной в главе 2. Измерения проводили каждые 10 суток. Результаты измерений представлены в табл. 3.4 и рис. 3.4. Опыт с питательной средой МС + 0,5 мг/мл БАП не дал положительных результатов, так что в ниже представленных таблицах и диаграммах он не указан.  
     
Таблица 3.4 – Динамика роста микрочеренковO. vulgare
Сорт
Измерение на … сутки от даты черенкования
Состав питательной среды


без фито-гормонов
1,0 мг/л ИУК
1,0 мг/л БАП
1,0 мг/л ИМК
Фея
10
0,8
0,8
1,0
0,6

20
1,1
1,3
1,1
0,9

30
1,6
2,6
1,6
2,3

40
1,6
6,2
1,6
8,2
Медовый аромат
10
1,5
0,6
0,6
0,4

20
2,1
1,3
0,8
0,4

30
4,2
2,9
1,2
0,4

40
5,3
5,5
1,2
0,4
Северное сияние
10
2,2
0,3
0,7
0,6

20
3,8
1,2
1,0
0,8

30
6,1
2,1
2,0
1,3

40
6,3
2,3
2,5
3,1
Хуторянка
10
1,9
0,8
0,7
0,8

20
2,7
1,4
0,7
1,4

30
4,5
2,1
1,0
2,2

40
5,7
3,5
1,0
6,5
НСР05 (Фактор Б)
0,3
НСР05 (Взаимодействие факторов)
1,7
     
     Дляоценки достоверности различий между опытными вариантами был проведен 2-факторный дисперсионный анализ (фактор А – сорт, фактор Б – состав питательной среды). По фактору Б – состав питательной среды и по взаимодействию факторов фактическое значение критерия Фишера превысило табличное (Fфакт. >Fтабл.). По фактору А (сорт) дисперсионный анализ не выявил существенных различий.
     

Рис. 3.4. Высота микрочеренковO. vulgareразличных сортов на питательных средах разного гормонального состава
     
     Как можно видеть из табл. 3.4 и рис. 3.4 для роста микрочеренковразных сортов соответствуют разные питательные среды. Так, для сорта Фея наилучшей оказалась питательная среда МС с добавлением 1,0 мг/л ИМК, для сорта Хуторянка – без фитогормонов или с добавлением 1,0 мг/л ИМК, для сорта Медовый аромат –без фитогормонов или с добавлением ИУК в концентрации 1,0 мг/л, для Северного сияния – без добавления фитогормонов.
     
     3.3.2 Оценка динамики образования листьев у микрорастенийO. vulgare
     Учет количества листьев проводили каждые 10 суток. Результаты учета представлены в табл. 3.5 и рис. 3.5.
     
Таблица 3.5 – Динамика образования листьев у микрочеренковO. vulgare
Сорт
Измерение на … сутки от даты посадки
Состав питательной среды


без фито-гормонов
1,0 мг/л ИУК
1,0 мг/л БАП
1,0 мг/л ИМК
Фея
10
6
5
4
3

20
9
7
6
5

30
10
8
9
8

40
10
14
9
13
Медовый аромат
10
7
5
8
3

20
11
7
15
4

30
19
9
23
4

40
24
12
23
4
Северное сияние
10
9
7
5
6

20
13
9
7
7

30
14
11
12
9

40
18
12
16
17
Хуторянка
10
9
7
8
5

20
12
9
8
5

30
15
10
10
6

40
18
13
10
13
НСР05 (Фактор Б)
      4,7
НСР05 (Взаимодействие факторов)
5
     
     Дляоценки достоверности различий между опытными вариантами был проведен 2-факторный дисперсионный анализ (фактор А – сорт, фактор Б – состав питательной среды). Фактическое значение критерия Фишера превысило табличное (Fфакт.>Fтабл.)по факторуБ (состав питательной среды)и по взаимодействию факторов. По факторуА (сорт) дисперсионный анализ не выявил существенных различий.
     

Рис. 3.5.Количество листьев у микрочеренковO. vulgareразличных сортов на питательных средах разного гормонального состава 
     
     На образование листьев у микрочеренков фактор Б (состав питательной среды) в большей степени оказал влияние. Микрочеренки сорта Медовый аромат были наиболее облиственны на питательной среде без фитогормонов или с добавлением 1,0 мг/л БАП, Северное сияние – на всех вариантах, кроме 1,0 мг/л ИУК, Хуторянка и Фея – на всех вариантах, кроме 1,0 мг/л БАП.
     МикрочеренкиO. vulgareпредставлены на рис. 3.6-3.9.
     







А


Б


В
Г
Рис. 3.6. Микрочеренки O. vulgare на питательной среде без добавления фитогормонов: А – сорт Фея, Б – сорт Медовый аромат, В – сорт Северное сияние, Г – сорт Хуторянка








А
Б




В
Г
Рис. 3.7. Микрочеренки O. vulgare на питательной среде МС с добавлением 1,0 мг/л ИУК: А – сорт Фея, Б – сорт Медовый аромат, 
В – сорт Северное сияние, Г – сорт Хуторянка
     
     
     




А
Б



В
Рис. 3.8. Микрочеренки O. vulgare на питательной среде МС с добавлением 1,0 мг/л ИМК: А – сорт Фея, Б – сорт Северное сияние, В – сорт Хуторянка




А


Б
Рис. 3.9. МикрочеренкиO. vulgare на питательной среде МС с добавлением 1,0мг/л ИМК: А – сорт Северное сияние, Б – сорт Хуторянка
     
     3.3.3 Оценка динамики образования кор.......................