Исследование археологических объектов сочетанием методов изотопной масс-спектрометрии и радиоуглеродного анализа

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ
ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ
«АЛТАЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Химический факультет
Кафедра техносферной безопасности и аналитической химии



Исследование археологических объектов сочетанием методов изотопной масс-спектрометрии и радиоуглеродного анализа
(выпускная квалификационная работа)
Выполнила студентка 
2 курса, 661М группы
_____________________
     (подпись)
Свердлова Екатерина Сергеевна
Научный руководитель
кандидат хим. наук, доцент 
______________Л. В. Щербакова
      (подпись)
Председатель ГЭК
доктор хим. наук, профессор 
______________В. В. Коньшин
      (подпись)

Работа защищена_______
                                 (дата)
Оценка________________













Допустить к защите
Зав. кафедрой 
доктор хим. наук, доцент
______________С. В. Темерев
   (подпись)
______________ 
     (дата)


Барнаул 2018
      Содержание

Введение	4
1 Применение инструментальных методов анализа для определения активности радиоуглерода, а также стабильных изотопов углерода и азота	7
1.1 Радиоуглеродный метод	7
1.1.1 Основы радиоуглеродного метода	7
1.1.2 Рекомендации по взятию проб для радиоуглеродного анализа	8
1.1.3 Погрешности метода	9
1.1.4 Области применения	11
1.1.5 Калибровка полученных результатов	13
1.2 Масс-спектрометрия	14
1.2.1 Изотопная масс-спектрометрия	14
1.2.2 Классификация масс-спектрометров	16
1.2.3 Ускорительная масс-спектрометрия (УМС)	21
1.2.4 Классическая жидкостносцинтилляционная масс-спектрометрия	23
1.2.5 Хромато-масс-спектрометрия	24
1.2.6 Области применения масс-спектрометрии	28
2 Методики пробоподготовки образцов для физических методов анализа	33
2.1 Методика пробоподготовки образца из костного материала при использовании соляной кислоты	33
2.2 Методика пробоподготовки образца из костного материала при использовании плавиковой кислоты	34
2.3 Методика пробоподготовки образцов древесины и угля	35
2.5 Методика получения карбида лития	36
2.6 Методика получения ацетилена	38
2.7 Методика получения бензола	40
3 Применение физических методов анализа для исследования археологических объектов	46
3.1 Применение радиоуглеродного метода анализа для исследования образцов древесины и угля, а так же органики	47
3.3 Применение изотопной масс-спектрометрии для исследования археологических образцов	75
3.4 База Данных "Радиоуглеродные датировки материалов из древних и средневековых памятников Алтая"	82
Заключение	86
Библиографический список	88










Введение
   
   
   
   
    
    С развитием аналитической химии как науки, границы между физическими и химическими методами размываются, при этом расширяются области их применения, что позволяет не только получать достоверные сведения для различных областей химии, но и проводить междисциплинарные исследования, например, в области биологии, истории, археологии и др.
     Более детальную информацию при исследовании древних образцов можно получить, используя сочетание различных научных методов исследования. Из инструментальных методов для этих целей наиболее известны радиоуглеродный метод датирования и изотопная масс-спектрометрия.
      Основы радиоуглеродного метода заложил У. Либби, получивший в 1960 году Нобелевскую премию за разработку метода [45]. Со времени открытия метода спектр применения изотопа 14С в различных областях наук для получения какой-либо информации заметно расширился [8]. 
     С помощью метода масс-спектрометрии проводят измерения отношения массы заряженных частиц материи (ионов) к их заряду. Благодаря эффекту фракционирования можно определить основные компоненты в системе питания, как человека, так и животного. 
     Относительное отклонение изотопов служит своеобразным палеоклиматическим индикатором, т.к. изотопные составы стабильных изотопов углерода и азота (?13С и ?15N) позволяют реконструировать климат и особенности фауны различных эпох по изменению пищевых цепей [59].
     Вышеперечисленная информация свидетельствуют об актуальности темы квалификационной работы.
     Целью работы является исследование археологических объектов сочетанием методов изотопной масс-спектрометрии и радиоуглеродного анализа.
      Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи: 
     1. Изучить физико-химические особенности определения активности изотопа С-14, а также стабильных изотопов азота и углерода.
     2. Выполнить в лабораторных условиях определение активности 14С и определение изотопного состава объектов.
     3. Сопоставить полученные результаты методов для более детальной информации и создать БД «Радиоуглеродные датировки материалов из древних и средневековых памятников Алтая» с включением в нее полученные результаты.
     Предметом изучения являются радиоуглеродный метод и изотопная масс-спектрометрия, а объектами исследования - изотоп 14С, изотоп 13С и изотоп 15N.
      Практическая значимость данного дипломного проекта заключается
     - в получении новых результатов датирования археологических памятников и их дополнение к ранее полученным диапазонам радиоуглеродных дат для получения более точных и достоверных результатов. Кроме того, эти данные будут применены для наполнения созданной автором дипломной работы базы данных по археологическим памятникам Республики Алтай и Алтайского края [24]. 
     - в получении новых данных о соотношении стабильных изотопов изучаемого организма, которые не только дополняют результаты радиоуглеродного датирования археологического объекта, но также позволяют определить особенности климата и фауны в определенный период времени, выявить диету индивида и его вероятное место рождения.
     Научная новизна заключается в совместном применении этих двух методов для детальной обработки результатов, а также в последующем создании базы данных. 
     
     
     
     
     
     
     
     
     
     
     
1 Применение инструментальных методов анализа для определения активности радиоуглерода, а также стабильных изотопов углерода и азота

     1.1 Радиоуглеродный метод
     
    1.1.1 Основы радиоуглеродного метода
      
     Атомы углерода в атмосфере представлены двумя стабильными (12C и 13C) и одним радиоактивным (14С) изотопами. Углерод-14 образуется в результате бомбардировки нейтронами азота, находящегося в атмосфере в больших количествах. Изотоп 14С радиоактивен, нестабилен и постепенно переходит в атомы 14N, из которых образуется. В процессе превращения выделяется отрицательная частица-электрон, что и позволяет зафиксировать сам этот процесс. Период радиоактивного полураспада 14С составляет 5735 лет.
n+ (_7^14)N? (_6^14)C+p
(_6^14)C? (_7^14)N+e ?+v_e
          Полученный углерод-14 быстро окисляется до углекислого газа и в дальнейшем усваивается растениями. Через растения 14С попадает в пищевую цепь других организмов. Таким образом, каждый живой организм постоянно получает определенное количество 14С в течение всей жизни. После гибели организма такой обмен прекращается, и количество 14С начинает уменьшаться. Зная изначальное количество 14С в организме по отношению к стабильным изотопам 12С и 13С в состоянии равновесия (когда организм жив) и содержание 14С в ископаемых остатках, можно установить, сколько времени прошло с момента смерти живого организма, т.е. установить возраст исследуемого объекта [7, 23].

    1.1.2 Рекомендации по взятию проб для радиоуглеродного анализа
     Стадия отбора пробы начинают с того, что обнаруженные при раскопках образцы фиксируют путем фотографирования и подробно описывают в журнале регистрации проб. Указывают место отбора и условия залегания взятой пробы, а также степень сохранности образца. По возможности необходимо проследить за тем, чтобы исследуемый материал не соприкасался с источниками загрязнения современным радиоуглеродом. Вторичное загрязнение изменяет изотопный состав изучаемого объекта и тем самым искажает результаты датирования. Поэтому важно соблюдать правила отбора и хранения пробы [2, 23]. 
     Наиболее надежными материалами для датирования считаются древесный уголь или обугленное вещество, затем древесина и, наконец, кости.  Количество отбираемой пробы должно быть рассчитано с учетом возможных потерь при получении счетной формы в виде бензола и предварительной очистки образца [2, 23].
     
     
     
     
     



1.1.3 Погрешности метода
    Погрешности радиоуглеродного метода обусловлены, во-первых, изменением скорости образования радиоуглерода. На скорость, в свою очередь, действуют следующие факторы:
     1. Изменение потока космических лучей, в результате которых вырабатывается углерод-14.
     2. Влияние солнечной активности на направление потока и интенсивность космических лучей. Например, при высокой активности Солнца поток космических лучей уменьшается (минимум Маудера), при этом скорость образования радиоуглероды может вырасти до 50% [9].
     3. Антропогенное воздействие, приводящее к эффекту Зюсса. В результате использования ископаемых топлив, обедненных изотопом 13С и полностью исключающие радиоуглерод, происходит смещение концентрации углекислого газа в атмосфере в сторону легких изотопов.
     4. Антропогенные воздействия, связанные с ядерными испытаниями. В атмосферу поступило огромное количество радиоуглерода, образующегося при атомном взрыве в азотной среде. Отношение изотопов С14/С12 в период 50-е начало 60-х удвоилось за 5 лет.
     Во-вторых, погрешность вносится калибровочной кривой [30-32]. Эта погрешность весьма вариабельна [52].
          В-третьих, существуют погрешности, обусловленные загрязнением образцов. Типичное следствие такого загрязнения, состоит в том, что «старый» углерод, попадая в образец, будет увеличивать его возраст, а «молодой» - уменьшать. «Удревнение» образца наиболее эффективно может быть обусловлено загрязнением карбонатами или другим ископаемым углеродом — каменным углем, нефтью. Такие загрязнения легко заметны и устранимы. «Омоложение» образца может происходить из-за множества современных загрязнений. Причина этого в том, что в настоящее время, «благодаря» активным испытаниям ядерного оружия практически весь окружающий нас углерод значительно активнее «нормального» уровня. Поэтому заметный возрастной сдвиг можно получить и при значительно меньшем количестве загрязнителя. Очевидно, что чем древнее образец, тем более он чувствителен к молодым загрязнениям [1, 12].













    1.1.4 Области применения
     Археология и четвертичная геология являются главными областями применения радиоуглеродного метода [42-44]. В археологии применение независимого способа определения возраста в значительной степени изменило существовавшие археологические концепции [13, 46]. На сегодняшний день наряду с анализом «рутинных» объектов, к которым можно отнести древесину, древесный уголь и кости, всё чаще проводится определение возраста (в основном методом ускорительной масс-спекрометрии (УМС) [33]) таких "непригодных" в недалёком прошлом материалов, как отдельные семена и плоды растений, текстиль, жирные кислоты (липиды) в древней керамике и сама керамика, остатки крови на каменных орудиях, наскальная живопись и т.д.  [26, 27, 28].
     Широкие возможности открыл радиоуглеродный метод археологам и дендрохронологам, которые теперь могут «привязать» свои данные к абсолютной шкале времени с помощью так называемого «сопоставления флуктуаций» [17]. В данном случае флуктуации есть резкие изменения содержания изотопа 14С в течение последних 10–12 тыс. лет, которые могут быть идентифицированы и сопоставлены с зафиксированными на международно-признанной калибровочной кривой пиками [10, 11].
     В четвертичной геологии и палеогеографии радиоуглеродный метод применяется так же широко, как и в археологии [49]. С его помощью установлены хронологические параметры основных тёплых и холодных эпох за последние 40–50 тыс. лет [18]. 
     Широко используется радиоуглеродный метод в геофизике [20], океанологии, биологии [37], медицине и многих других науках. Измерения содержания 14С в морской воде прочно вошли в практику океанологических исследований (это позволяет выявить закономерности циркуляции вод Мирового) и в изучение грунтовых вод суши и минеральных источников. Динамично развивающимся направлением можно назвать исследование содержания 14С в таких объектах, как метеориты и ледники [55]. Радиоуглеродный метод помогает в изучении астрофизических явлений – колебаний солнечной активности, взрывов сверхновых звёзд и др. [19]
     Большую роль играет измерение активности изотопа 14С в исследованиях, связанных с «техногенным» радиоуглеродом. С помощью измерения активности 14С проводятся исследования загрязнения природной среды радионуклидами, выделяемыми при производстве топлива для атомной промышленности [5]. И уж совсем «экзотическим» можно назвать использование радиоуглеродного метода в криминалистике – для выявления торговли слоновой костью и контрабанды наркотиков (также на основе «послебомбового» эффекта) [39].
     
     
     
     
     
     
     
     
     
     
1.1.5 Калибровка полученных результатов

     После получения радиоуглеродного возраста переходят к процедуре, называемой «калибровка», которая осуществляется с помощью специального программного обеспечения. По полученной диаграмме определяют участок кривой Стювера, отмеченной синим цветом (рисунок 3), который соответствует полученному диапазону радиоуглеродных распределений образца (отмеченный красный цветом) [38, 40, 47].

Рисунок 1 - Вид калибровочной кривой [38]
     По результатам поиска и изучения физико-химических характеристик радиоуглеродного анализа, а так же самого изотопа 14С можно сказать, что благодаря своим преимуществам таким как, а именно: специализированные усовершенствованные приборы, отличающиеся высокой чувствительностью, избирательностью и точностью определения редких изотопов; процессу калибровки, охватывающий временную шкалу с минимальной погрешностью 10-20 лет, радиоуглеродный метод датирования на сегодняшний день имеет широкий диапазон применения. Однако данный метод имеет свои недостатки, например, скорость образования радиоуглерода непостоянна, что может привести к существенным погрешностям.
1.2 Масс-спектрометрия
    1.2.1 Изотопная масс-спектрометрия
     Различные типы масс-спектрометров объединяет принцип действия прибора, по которому проводится анализ вещества. Метод масс-спектрометрии основан на пространственной или временной сепарации различающихся по массе и предварительно ионизированных молекул (рисунок 1).
     Разделение происходит в условиях высокого вакуума в электрических и магнитных полях, имеет своей целью определение масс молекул (атомов) и относительного содержания в анализируемом веществе компонентов, различных по массе.
Масс-спектральный анализ сводится, в основном, к следующим операциям:
 Превращение атомов вещества в положительные ионы.
 Создание ионного пучка или групп ионов в статическом или импульсном электростатическом полях.
 Пространственное или временное разделение потока частиц в магнитном и электрическом полях.
 Раздельное измерение и регистрация интенсивности каждого компонента потока [15, 16].
     
     
     Рисунок 2 - Основной принцип масс-спектрометрии [16]
     Основные составляющие приборов масс-спектрометрии.
     Принцип, по которому проводится анализ, определяет наличие следующих основных узлов у каждого масс-спектрометра:
 Источник ионов, в котором осуществляется новообразование и формирование пучка или групп частиц.
 Масс-анализатор, где производится разделение сформированного потока на компоненты, отличающиеся величиной отношения их массы к заряду.
 Устройства для улавливания и регистрации частиц. Принцип действия устройств — измерение интенсивности ионного тока каждого компонента.
     Кроме перечисленных основных узлов, в них также содержатся вакуумные системы с насосами и вентилями для получения высокого вакуума, манометры, системы подготовки и ввода анализируемого вещества в источник ионов, электронные схемы питания, индикаторы массовых чисел, стабилизаторы тока и напряжений и т.д.
    1.2.2 Классификация масс-спектрометров
     Классификация масс-спектрометров основывается на способе ионизации и фазах, в которых находятся вещества перед ионизацией [77].  
 Газовая фаза
     - электронная ионизация (EI)
     - химическая ионизация (CI)
     - электронный захват (EC)
     - ионизация в электрическом поле (FI)
     2. Жидкая фаза
     - термоспрей
     - ионизация при атмосферном давлении (AP)
     - электроспрей (APESI)
     - химическая ионизация при атмосферном давлении (APCI)
     - фотоионизация при атмосферном давлении (APPI)
     3. Твёрдая фаза
     - прямая лазерная десорбция - масс-спектрометрия (LDMS)
     - матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (MALDI)
     - масс-спектрометрия вторичных ионов (SIMS)
     - бомбардировка быстрыми атомами (FAB)
     - десорбция в электрическом поле (FD)
     - плазменная десорбция (PD)
     В неорганической химии для анализа элементного состава применяются жёсткие методы ионизации, так как энергии связи атомов в твёрдом теле гораздо больше и значительно более жёсткие методы необходимо использовать для того, чтобы разорвать эти связи и получить ионы [77].
     - ионизация в индуктивно-связанной плазме (ICP)
     - термоионизация или поверхностная ионизация
     - ионизация в тлеющем разряде и искровая ионизация (см. искровой разряд)
     - ионизация в процессе лазерной абляции
     Полученные при ионизации ионы с помощью электрического поля переносятся в масс-анализатор. Там начинается второй этап масс- спектрометрического анализа — сортировка ионов по массам (точнее по отношению массы к заряду, или m/z). Существуют следующие типы масс-анализаторов:
Непрерывные масс-анализаторы:
 Магнитный масс-анализатор
 Квадрупольный масс-анализатор
Пульсовые масс-анализаторы:
 Ионная ловушка
 Времяпролетный масс-анализатор
 Масс-анализатор ионно-циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием
     Разница между непрерывными и пульсовыми масс-анализаторами заключается в том, что в первые ионы поступают непрерывным потоков, а во вторые — порциями, через определенные интервалы времени.
Магнитный масс-анализатор
     В этих масс-спектрометрах ионы, покидающие источник, ускоряются и проходят через сектор, в котором магнитное или электрическое поле прикладывается перпендикулярно к направлению движения ионов. Поле изгибает траекторию полета ионов с различным отношением m/z таким образом, что они разлетаются веером. В масс-спектрометре с одноканальным детектором ионы регистрируются путем последовательного сканирования. При этом каждый раз регистрируется только одна масса. В масс-спектрометре с многоканальным детектором ионы с различной массой регистрируются одновременно (в определенном диапазоне масс).
Квадрупольный масс-анализатор
     Квадрупольный масс-анализатор состоит из четырех металлических стержней, к которым попарно в противоположной полярности подается определенная комбинация постоянного и радиочастотного переменного электрического напряжения. Ионы, пролетающие параллельно оси стержней, попадают в электромагнитное поле, и разделяются там по принципу резонанса в соответствии с величиной m/z. В каждый конкретный момент на детектор поступают только резонансные ионы.
Ионная ловушка
     В спектрометрах этого типа одна пара металлических стержней преобразована в кольцевые электроды, а вторая пара – в концевые заглушки, имеющие вид шарообразных чашек. Ионы собираются внутри полости ловушки и удерживаются там на орбитах полем, создаваемым комбинацией постоянных и высокочастотных напряжений, которые подают к кольцевому электроду и концевым заглушкам. Доступ ионам из ловушки на детектор осуществляется с помощью резонансной радиочастоты, соответствующей величине m/z.
Времяпролетный масс-анализатор
     В этих масс-анализаторах ионы после прохождения через электростатические линзы приобретают одинаковую кинетическую энергию и вылетают в бесполевое пространство. С учетом соотношения, выражающего величину кинетической энергии через массу и скорость (E=mv2/2), очевидно, что в зависимости от массы ионы будут двигаться с разными скоростями и, соответственно, в разное время достигнут детектора. Время пролета ионов пропорционально квадратному корню отношения m/z. Ионы с большим значением отношения m/z движутся к детектору медленнее, чем ионы с малым значением m/z. Так время пролета ионов массой около 10 кДа расстояния 0,1 м составляет около 70 мкс, а массой около 1 кДа – несколько нс. Поскольку ионы с большим значением m/z движутся к детектору медленнее, они позже его достигают по сравнению с ионами, обладающими малым значением m/z. Измерив время пролета ионов, можно установить их значения m/z и массу.
Масс-анализатор ионно-циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием
     Этот масс-анализатор работает на основе ионно-циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием. Ионы на первой стадии анализа попадают в сильное магнитное поле и начинают вращаться (как в циклотроне – ускорителе элементарных частиц) по низким орбитам. Радиус этих орбит зависит от m/z ионов. Под действием прилагаемого высокочастотного поля ионы в соответствии с величиной m/z ионы резонансно поглощают энергию, ускоряются и начинают вращаться на более высоких орбитах. Непоглотившие энергию ионы остаются вращаться на низких орбитах. Таким способом осуществляется разделение ионов по величине отношения m/z. Высокочастотный сигнал, генерируемым вращающимися на высоких орбитах ионами, измеряется и подвергается Фурье-преобразованию. Математическое преобразование Фурье применяют к зашумленным сигналам. В процессе Фурье-преобразования зашумленных сигналов вначале производят их разложение, а затем обратное преобразование с занулением частей с низкими амплитудами. В результате обратного Фурье-преобразования сохраняется практически вся полезная информация на фоне существенного снижения искажающих анализ шумов.
Ионно-циклотронные масс-спектрометры обладают важными преимуществами: имеют очень высокое разрешение, широкий диапазон измеряемых масс, могут анализировать ионы, получаемые различными методами. Однако для своей работы они требует сильного магнитного поля, а значит, использования сильного магнита со сверхпроводящим соленоидом, поддерживаемым при температуре.
     
     
     
     
     
    1.2.3 Ускорительная масс-спектрометрия (УМС)
     Ускорительная масс-спектрометрия — это ядерно-физический метод регистрации долгоживущих радиоизотопов путем прямого счета атомов, а не их продуктов распада после их сепарации в магнитных полях [41]. Метод позволяет получать точную информацию об изотопном составе образцов миллиграммового и микро-граммового веса. Технология УМС включает  (рисунок 2): цезиевый (как правило) источник ионов для получения отрицательно заряженных атомных и молекулярных ионов; инжектор ионов; тандемный ускоритель (1 — секция для отрицательных ионов, 2 — для положительных ионов, включая стриппер электронов между ними); систему анализа положительных ионов для «очистки» ионного пучка; ионизирующий детектор для счета ионов [4, 14].

Рисунок 3 - Схема построения УМС [4]
     Типичное время одного измерения составляет от минуты до нескольких минут. При работе с 14С исследуемый образец конвертируется в графит. Процесс определения 14С начинается с того, что атомы углерода исследуемого образца бомбардируются положительными ионами цезия, в результате чего образуются отрицательные ионы углерода. Далее  под действием двух магнитов (один — для создания магнитного поля, действующего на ионы до их ускорения, другой — после ускорения) все заряженные частицы отделяются, кроме тех частиц, которые имею атомную массу 14. Это разделение происходит за счет того, что ионы с атомной массой 14 могут быть отделены с помощью щели, рассчитанной на соответствующий радиус кривизны и установленной на некотором расстоянии от магнита. Ускоренные частицы проходят через фильтр скоростей, в котором используются постоянные электрические и магнитные поля, перпендикулярные друг другу и пучку ионов. Это позволяет уменьшить число посторонних ионов в 1000 раз. В конечном итоге ионы радиоуглерода поступают на измерение их количества в детектор. Основным преимуществом данного метода является возможность датировать образцы с массой всего несколько миллиграммов. Точность измерения содержания 14С в образцах в УМС составляет 0,5—1 % (бывает и лучше).
     Основная сфера применения УМС — это измерение долгоживущих радиоизотопов на природных уровнях. Поскольку радиоизотопы присутствуют в любом земном и внеземном веществе, а технология УМС позволяет контролировать их содержание на ультраследовых уровнях, то область применений УМС охватывает множество направлений [4, 14, 41]. 
     
     
     
     
     
     
     
    1.2.4 Классическая жидкостносцинтилляционная масс-спектрометрия
     Метод основан на способности некоторых веществ (сцинтилляторов) преобразовывать часть поглощаемой ими энергии в световые вспышки.
     Мощная пассивная защита состоит из низкоактивного свинца вокруг блока детектирования. Активная защита от космических лучей и фонового гамма-излучения состоит из жидкосцинтилляционного охранного детектора, который работает на антисовпадениях с основным детектором. Внешний контейнер активной защиты изготовлен из бескислородной меди, что является дополнительной пассивной защитой от внешних излучений. 
     Однако существует целый ряд эффектов, препятствующих прямому измерению активности. Эти эффекты объединяются общим термином – гашение. Образец для измерения, как правило, состоит из радиоактивного вещества, смешанного с растворителем и сцинтиллятором, так называемый измерительный коктейль. Типичным сцинтиллятором для радиоуглеродного метода является 2,5-дифенилоксазоль. Наиболее эффективными растворителями являются алкилбензолы и циклопарафины. Примечательно, что бензол, который может быть легко синтезирован из датируемого образца, также является сцинтилляционным растворителем [6].
     
     
     
     
     
1.2.5 Хромато-масс-спектрометрия

     Хромато-масс-спектрометрия - метод анализа смесей главным образом органических веществ и определения следовых количеств веществ в объеме жидкости [56]. Метод основан на комбинации двух самостоятельных методов - хроматографии и масс-спектрометрии. С помощью первого осуществляют разделение смеси на компоненты, с помощью второго - идентификацию и определение строения вещества, количественный анализ [57]. Известны 2 варианта хромато-масс-спектрометрии, представляющие собой комбинацию масс-спектрометрии либо с газо-жидкостной хроматографией (ГЖХ), либо с высокоэффективной жидкостной хроматографией (рисунок 4) [56, 57].

  Рисунок 4 - Схема газового хромато-масс-спектрометра
     Принципиальная совместимость этих двух приборов обусловлена тем, что в обоих случаях анализируемое вещество находится в газовой фазе, рабочие температурные интервалы одинаковы, пределы обнаружения (чувствительность) близки [69]. Различие состоит в том, что в ионном источнике масс-спектрометра поддерживается высокий вакуум (10-5 - 10-6 Па), тогда как давление в хроматографической колонке 105 Па. Для понижения давления используют сепаратор [68].
     Наиболее удобный для хромато-масс-спектрометрии газ-носитель - гелий. Эффективность работы сепаратора, т.е. отношение количества органического вещества в газовом потоке, выходящем из колонки, к его количеству, поступающему в масс-спектрометр, в значительной степени зависит от расхода газа-носителя, попадающего в сепаратор. В масс-спектрометрах, соединенных с газовыми хроматографами, применяется ионизация электронным ударом, химическая или полевая. Хроматографические колонки должны содержать труднолетучие и термостабильные стационарные жидкие фазы, чтобы масс-спектр их паров не налагался на спектр анализируемого вещества [61].
     С помощью установленного в масс-спектрометре датчика, реагирующего на изменение полного ионного тока, записывают хроматограммы. Таким образом, масс-спектрометр можно рассматривать как универсальный детектор к хроматографу. Одновременно с записью хроматограммы в любой ее точке, обычно на вершине хроматографического пика, может быть зарегистрирован масс-спектр, позволяющий установить строение вещества. [62]
     Важное условие работы прибора - быстрая запись масс-спектра, который должен регистрироваться за время, гораздо меньшее, чем время выхода хроматографического пика. Медленная запись масс-спектра может исказить соотношение интенсивностей пиков в нем. Скорость регистрации масс-спектра (скорость сканирования) определяется масс-анализатором. Наименьшее время сканирования полного масс-спектра (несколько миллисекунд) обеспечивает квадрупольный анализатор. В современных масс-спектрометрах, снабженных ЭВМ, построение хроматограмм и обработка масс-спектров производится автоматически. Через равные промежутки времени по мере элюирования компонентов смеси регистрируются масс-спектры, количественные характеристики которых накапливаются в памяти ЭВМ. Для каждого сканирования производится сложение интенсивностей всех регистрируемых ионов. Так как эта суммарная величина (полный ионный ток) пропорциональна концентрации вещества в ионном источнике, то ее используют для построения хроматограммы (эта величина откладывается по оси ординат, по оси абсцисс - время удерживания и номер сканирования). Задавая номер сканирования, можно вызвать из памяти масс-спектр в любой точке хроматограммы [58].
     Как описано выше, могут быть проанализированы смеси веществ, достаточно хорошо разделяемые на подходящих колонках хромато-масс-спектрометрии. Иногда удается исследовать и неразрешенные хроматографические пики. Исследуемые вещества должны быть термически стабильны, хроматографически подвижны в интервале рабочей температуры колонки, легко переводиться в паровую фазу при температуре испарителя. Если вещества не удовлетворяют этим требованиям, их можно химически модифицировать, например силилированием, алкилированием или ацилированием гидрокси-, карбокси-, меркапто-, аминогрупп [60, 62].
     Чувствительность хромато-масс-спектрометрии (обычно 10-6-10-9 г) определяется чувствительностью детектора масс-спектрометра. Более чувствительна (10-12-10-15 г) разновидность хромато-масс-спектрометрии - масс-фрагментография, называемая также селективным ионным или многоионным детектированием. Суть ее состоит в том, что запись хроматограмм осуществляется не по полному ионному току, а по наиболее характерным для данного вещества ионам. Этот вид хромато-масс-спектрометрии используют для поиска, идентификации и количественного анализа вещества с известным масс-спектром в составе сложной смеси, например при количественном определении следов веществ в больших объемах биологических жидкостей (медицина, фармакология, токсикология, допинг-контроль, биохимия). Осуществляют масс-фрагментографию на хромато-масс-спектрометрах с использованием специального устройства - многоионного детектора либо с помощью ЭВМ, которая может строить хроматограммы по одному или нескольким ионам. Такая хроматограмма, в отличие от обычной, содержит пики лишь тех компонентов, в масс-спектрах которых есть такие ионы. Анализ проводят с применением внутреннего стандарта, в качестве которого часто используют аналог искомого вещества, меченный стабильными изотопами (2Н, 13С, 15N, 18O) [59, 64].
     Другой вариант хромато-масс-спектрометрии заключается в сочетании высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии. Метод предназначен для анализа смесей труднолетучих, полярных веществ, не поддающихся анализу методом ГЖ хромато-масс-спектрометрии. Для сохранения вакуума в ионном источнике масс-спектрометра необходимо удалять растворитель, поступающий из хроматографа со скоростью 0,5-5 мл/мин. Для этого часть жидкого потока пропускают через отверстие в несколько мкм, в результате чего образуются капли, которые далее попадают в обогреваемую зону, где большая часть растворителя испаряется, а оставшаяся вместе с веществом попадает в ионный источник и ионизируется химически [66, 68].
     Метод хромато-масс-спектрометрии используют при структурно-аналитических исследованиях в органической химии, нефтехимии, биохимии, медицине, фармакологии, для охраны окружающей среды и др. [65]





1.2.6 Области применения масс-спектрометрии

     Методы М.-с. применяются в различных областях: в атомной промышленности, медицине, биологии, металлургии, геологии, космических исследованиях, при проведении элементного анализа высокочистых веществ и определении абсолютного количества веществ методом изотопного разбавления, при контроле качества пищи и воды и др. Эти методы используются для анализа сложных смесей и определения структуры молекул. Созданы специальные. источники ионов (в которых осуществляется внутримолекулярная реакция переноса протона), позволяющие определить наличие в газе или жидкости ничтожно малых примесей [70-72].
     М.-с. позволяет определять изотопный состав образцов (рисунок 4а). Изотопные отношения являются маркерами различных. процессов. Например, по отношению количества изотопов 12С/14С12С/14С определяют возраст материалов (радиоуглеродный метод), по соотношению 16O/18O16O/18O – место происхождения соединений, содержащих данные изотопы [70, 71].
     
     
     Рисунок 4а – Схема областей применения изотопной масс-спектрометрии
     Различия в содержании изотопов могут быть очень малы, причём редкие изотопы, как правило, находятся в образце в крайне низких концентрациях. Поэтому для проведения анализа требуется очень чувствительный инструмент; в некоторых случаях (при определении возраста предметов и горных пород) применяется спец. класс приборов – т. н. ускорительные масс-спектрометры. В них для разделения изотопов в мультиплетах используются особые методы: разрушение молекулярных ионов и удаление электронных оболочек атомных ионов, что осуществляется при прохождении ионов, ускоренных до энергий порядка нескольких мегавольт, через газовые мишени и металлич. фольгу [73-76].
     При определении структуры белков и анализе белковых смесей методом М.-с. используются особые способы ионизации: электроспрей и лазерная десорбция из матрицы. Для определения аминокислотной последовательности белков последние фрагментируют диссоциацией. При анализе белковых смесей ионы белковых молекул либо вводят в масс-спектрометр целиком и фрагментируют внутри прибора, либо смесь белков предварительно подвергается расщеплению на пептиды по определённым аминокислотам, а затем проводят анализ полученных фрагментов. В обоих случаях используются методы тандемной М.-с. Белки идентифицируются по масс-спектрам биоинформационными методами. Для количественного анализа белковых смесей методом изотопного разбавления используют также мечение входящих в белки аминокислот и пептидов стабильными изотопами [73-76].
     М.-с. применяется при генотипировании патогенных микроорганизмов путём определения одиночных нуклеотидн.......................