Фукоиданы бурых водорослей и их характеристика

Аннотация 
     Дипломная работа выполнена на предприятии ООО «Биоактуаль», содержит…
     Целями дипломной работы являлись: изучить сульфатированный полисахарид фукоидан, источники его получения и способы выделения полисахарида из биомассы бурой водоросли Fucus evanescens, провести моделирование процесса оптимизации выделения фукоидана из бурой водоросли Fucus evanescens и проведение эксперимента по выделению полисахарида на базе лаборатории предприятия ООО «Биоактуаль».     
     В результате исследования был выявлен оптимальный и выгодный источник получения полисахарида, изучен метод выделения фукоидана из бурой водоросли Fucus evanescens, проведено моделирование процесса оптимизации выделения фукоидана из бурой водоросли Fucus evanescens, получен чистый полисахарид фукоидан. Все это дает возможность использовать продукт в качестве субстрата для дальнейших научных исследований или использовать в качестве функциональной добавки к пище с целью улучшения здоровья населения. А так же была проведена оптимизация существующих методов выделения фукоидана из биомассы бурых водорослей и увеличен выход полисахарида с 13% до 15%.
     








                                              
Введение
     Жизнь на нашей планете зародилась очень давно, с каждым веком уровень развития человечества достигает новых вершин, каждое новое поколение вносит колоссальные изменения в развитие общества, политики, здравоохранения, промышленности и уровня жизни в целом.
     ХХI век считается веком передовых технологий, и не зря. В огромных масштабах производится строительство предприятий и техники, которые в свою очередь упрощают жизнь человека, делают ее удобной и наполненной всеми необходимыми ресурсами для комфортного существования. Такой объем производства и разнообразия продукции влечет за собой ухудшение качественных характеристик потребляемого товара человеком.
     Перед учеными, медиками, технологами и экологами стоит важнейшая задача создания качественных продуктов и изделий для улучшения жизни и здоровья человека.
     Все это определяет всё возрастающий спрос на продукты морского происхождения, в число которых входят морские водоросли, а также лечебно-профилактические препараты на основе водорослей. Бурые водоросли являются богатым и возобновляемым сырьем для получения ценных биологически активных полисахаридов ? фукоиданов, ламинаранов и альгиновых кислот. Содержание йода, макро- и микроэлементов, маннита и свободных аминокислот в бурых водорослях выше, чем в наземных растениях. Практически неисчерпаемым источником бурых водорослей являются прибрежные воды морей Дальнего Востока России. 
     В последние годы объектом интенсивного исследования стали сульфатированные полисахариды бурых водорослей –фукоиданы. Постоянно растущий интерес к этим полисахаридам объясняется их многоообразной биологической активностью, которая может быть использована при создании медицинских препаратов нового поколения и продуктов функционального назначения. Такими препаратами являются биологически активные добавки [1], содержащие бурые морские водоросли, которые богаты самыми разнообразными биологически активными веществами. Полисахариды водорослей - одни из наиболее популярных биологически активных веществ, обладающих многофункциональностью воздействия на организм человека. Механизм их действия недостаточно изучен, но все они в большей или меньшей степени влияют на обмен липидов, глюкозы, минеральных элементов, обладают антиоксидантной активностью, иммуномодулирующем эффектом.
     Разработаны нормативные документы: ТУ 9284-305-00472012-06 «Фукоидан. Биологически активная добавка к пище»; ТИ № 36-305-06 по изготовлению биологически активной добавки к пище «Фукоидан» [2].
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
1. Литературный обзор
1.1 Фукоиданы бурых водорослей и их характеристика
  
     Фукусовые водоросли являются природными источниками биологически активных веществ. Они содержат маннит, соли (натриевые, кальциевые, калиевые) альгиновой кислоты, фукоидан, ламинаран, липиды, пигменты, стерины и другие [3].
     Фукусовые водоросли содержат три типа полисахаридов: альгиновую кислоту, фукоидан и ламинаран [4].
     1. Альгиновые кислоты– основной структурный компонент клеточных стенок бурых морских водорослей (Laminaria, Macrocystis pyrifera, Fucus, Phaeophyta). Содержание альгиновых кислот в бурых водорослях может составлять 20-40% от массы сырья. Альгиновая кислота является гетерогенным веществом, состоящим из фракций, различных по растворимости и составу уроновых кислот, в основном из блоков маннуроновой (Рисунок 1) и гулуроновой (Рисунок 2), и из различных комбинаций цепей этих двух мономеров. Блоки полиманнуроновой кислоты придают вязкость альгинатным растворам, участки гулуроновой кислоты связывают двухвалентные ионы металлов. В разных фракциях альгиновой кислоты содержание маннуроновой и гулуроновой кислот имеет различное значение. Главное свойство альгиновой кислоты и ее солей зависят от молекулярной массы. Значительные колебания молекулярной массы (35-1500 кДа) имеют зависимость от вида водоросли и способа получения. Коммерческий альгинат натрия преимущественно получают из ламинариевых водорослей [5].





  
                                                            
  
  
  
  
  
  
  Рисунок  1. Структурная формула
  D-маннуроновой кислоты


     2. Фукоиданами называют группу высокомолекулярных сульфатированных полисахаридов (молекулярная масса 100-800кДа), построенных из остатков  -L- фукопиранозы. Эти биополимеры содержат до 30% эфирносвязанной серной кислоты. Остатки фукозы соединены  -1,2-;  -1,3- и  -1,4-связью [6].
     3. Ламинаран - низкомолекулярный полисахарид, состоящий из остатков D-глюкопиранозы, связанных в линейные цепи  -1-3-связями (возможно содержание слаборазветвленных участков  -1-6). До 75% молекул присоединены  -1-3-связью к остатку D-маннита. Молекулярная масса 3500-5000 Да. Ламинараны (Рисунок 3) являются криопротекторами и противораковыми средствами. Содержание ламинаранов у фукусовых водорослей небольшое (1-4%), они входят в состав их водорастворимых экстрактов [6].




                                                                                                        
                                                                                        
                      
                  
             


     Рисунок 3. Структурная формула ламинарина. 
     
     Для анализа полисахаридного состава биомассы бурых водорослей применяют несколько различных подходов [4].
     1. Методика фракционной экстракции с последующим    гравиметрическим определением отдельных фракций.
     Этот метод имеет несколько важных недостатков, которые делают этот метод невыгодным к использованию – длительность и трудоемкость процесса .
     2. Кислотный гидролиз биомассы с последующим хроматографическим определением отдельных моносахаридов.
     Такой подход позволяет оценить содержание ламинарана по выходу глюкозы, фукоидана по выходу фукозы, одновременно определить манит; но, к сожалению, не дает надежных сведений о содержании альгиновых кислот вследствие их устойчивости к гидролизу.
     3. Спектрофотометрия, основанная на специфической цветной реакции.
     Спектрофотометрия, основанная на специфической цветной реакции фукозы с L-цистеином и серной кислотой, рекомендована в известном практическом руководстве по биохимии водорослей [5].
     Эту реакцию дают и другие 6-дезоксигексозы, но в биомассе бурых водорослей они отсутствуют, а влияние других сахаров можно исключить. Чтобы исключить влияние собственной окраски фукоидана, в цитируемой методике предлагается проводить фракционное осаждение фукоидана этанолом в присутствии солей магния, что сильно усложняет анализ и часто неэффективно. Альгинаты удобнее всего было бы определять спектрофотометрически, по одной из цветных реакций, характерных для уроновых кислот, но щелочные экстракты биомассы, содержащие альгинаты, обычно окрашены имеющимися в водоросли пигментами еще более интенсивно, чем кислые экстракты, содержащие фукоидан. Помехи для спектрофотомтрического анализа, связанные с собственной окраской, можно устранить, применив обесцвечивание кислых экстрактов действием небольших добавок хлорита натрия, a щелочных экстрактов действием брома [7].

1.2 Химический состав, структура и содержание фукоидана в бурых 
водорослях
     Химический состав водорослей сложен и разнообразен. Водоросли синтезируют множество разных соединений, основная масса которых приходится на полисахариды. Бурые водоросли значительно отличаются по структуре веществ полисахаридной природы от водорослей других отделов и от наземных растений. Резервным материалом в них служит маннит и ламинараны. Главными компонентами биомассы бурых водорослей это альгинаты и сложные сульфатированные полисахариды - фукоиданы.
     Фукоидан относится к типу полисахаридов с большим процентным содержанием L-фукозы и групп сульфатов, получаемых из бурых морских водорослей. В дополнение к L-фукозе, цепь сахаридов также включает в себя галактозу, маннозу, ксилозу, и уроновую кислоту. Это означает, что фукоидан обладает уникальной молекулярной структурой, что делает его единственным в своем роде природным диетическим компонентом.
     Содержание фукоидана в бурых водорослях варьирует от 0,6 до 7,9 % на сухое вещество. Наибольшее количество фукоидана содержат водоросли порядков Laminariales и Fucales (Таблица 1) [8].
     Таблица 1. Химический состав бурых водорослей Laminariales и Fucales, % на сухую массу.
Водоросли
Минеральные вещества 
Белок 
Йод 
Манит 
Альгиновая кислота
Фукоидан 
Липиды 
Порядок – Laminariales  ламинариевые
Laminaria japonica
20,7
9,7
0,22
12,8
26,3
2,54
2,10
L.bongardiana
10,5
8,3
0,12
15,3
34,1
3,60
0,88
L.cichorioides
19,4
3,6
0,21
9,4
15,7
2,88
0,64
L.gurjanovae
14,4
2,9
0,25
9,7
21,3
3,80
1,29
Kjellmanella crassifolia
26,6
10,4
0,11
12,3
27,7
3,32
0,98
Agarum cribrosum
23,1
16,8
0,04
4,3
23,5
2,10
0,56
Alaria fistulosa
24,9
10,4
0,07
8,5
24,4
0,70
1,40
A.angustata
24,4
11,7
0,14
6,4
30,5
2,10
1,40
Порядок - Fucales фукусовые
Fucus evanescens
18,6
10,0
0,007
5,5
36,4
6,04
1,12
Cystoseira crassipes
12,9
10,9
0,002
5,6
34,6
5.4
0,6
Fucus vesiculosis
17,9
9,4
0,006
5,4
34,9
7,2
1,15
Sargassum pallidum
10,7
5,6
0,011
10,3
26,7
4,0
0,842
  
     Водоросль U. pinnatifida имеет морфологически разграниченные части таллома: вегетативную, представленную пластиной и репродуктивную, представленную спорофиллами. Листовая пластина является основной частью слоевища в период с апреля по июнь. В период спороношения, который, как правило, наступает в июне спорофиллы составляют до 76% от веса всего таллома водоросли. Количество фукоидана у U. pinnatifida в этот период возрастает в 5 раз и достигает максимума. Значительно меняется моносахаридный состав фукоидана: содержание галактозы увеличивается, маннозы ? уменьшается, а содержание фукозы остается на прежнем уровне. В апреле U. pinnatifida синтезирует гетерофукан, маннозу и  галактозу примерно одинаково, а в июне-июле фукоидан, представляющий собой галактофукан. [9]

  1.3 Влияние стадии жизненного цикла C. costata и U. pinnatifida на содержание и моносахаридный состав фукоидана
  
     Спoрангии у C. costata oбразуются на поверхности пластины, а U. pinnatifida имеет спoрoфиллы ? специальный орган, где фoрмируются и сoзревают спoры. Июньские сборы водоросли C. costata содержат фертильные и стерильные особи. Фракция водорастворимых полисахаридов из фертильных растений содержит в своем составе больше всего фукоидана. У U. pinnatifida взрослые растения с развитыми спорофиллами отобранные в мае, имеют различный репродуктивный статус: фертильные, которые имеют спорофиллы с развитыми сорусами, и вегетативные, спорофиллы которых не содержали парафиз или спорангиев. В спорофиллах фертильных особей содержание фукоидана в 5 раз больше, чем вегетативных. Таким образом  наблюдается прямая связь между увеличением содержания фукоидана в C. costata и U. Pinnatifida и началом спороношения.                                               .
При переходе C. costata к спороношению в фукоидане увеличилось содержание фукозы и галактозы, а маннозы и  рамнозы значительно уменьшилось содержание. Для U. pinnatifida тоже наблюдаются модификации в составе нейтральных моносахаридов при переходе водоросли к спороношению: в фукоидане из спорофилл содержание галактозы увеличивается, содержание фукозы остается прежним, а содержание маннозы уменьшается. Следовательно, при переходе водорослей к спороношению моносахаридный состав фукоидана как в C. costata, так и в U. pinnatifida определенно изменяется. 
     В вегетативных растениях имеются преимущественно гетерополисахариды, состоящие из маннозы, фукозы, рамнозы и галактозы, а в генеративных – полисахариды, состоящие, в основном, из галактозы и фукозы. Изменение моносахаридного состава фукоидана отображает, что не только содержание, но и  структура этого полисахарида соотнесена с развитием органов размножения и выходом спор[9].
  
  1.4Фукоиданы бурых водорослей и их характеристика
     Фукоидан – это сульфатный полисахарид с очень сложной структурной формулой. Основными его составляющими сахаридами являются: фукоза, ксилоза, манноза, галактоза, глюкоза, N-ацетилнейраминовая кислота, N-ацетилгалактозаллин и N-ацетилглюказамил [1].
     Впервые сульфатный полисахарид фукоидан, выделенный из морских бурых водорослей, был обнаружен еще в 1913 году,  и длительное время он использовался в основном в качестве источника L-фукозы [10]. В настоящее время интерес к этому классу полисахаридов значительно возрос в связи с полученными в последние десятилетия сведениями о их биологической активности: антикоагулянтной, антитромбической, противовоспалительной, антивирусной, иммуностимулирующей и противоопухолевой, что связывают со способностью этих полисахаридов взаимодействовать с рядом белков и влиять на свойства клеточной поверхности [3].
     Фукоиданы обнаружены во многих видах бурых водорослей, относящихся к порядку ламинариевых Laminariales, фукусовых Fucales, десмарестиевых Desmarestiales, а также в Chordaria flagelliformis (Chordariales), Padina pavonia (Dictyotales), Ascoseira mirabilis (Ascoseirales), Colpomenia sinuosa (Scytosiphonales), в микроводоросли Adenocystis utricularis [9]. Самые высокие концентрации фукоидана обнаружены в представителях порядка Fucales [11]. Водоросли порядка Laminariales, добываемые в крупных масштабах, также могут служить источником фукоиданов [12]
      В странах Азиатско-Тихоокеанского региона в качестве сырья для получения этого полисахарида используют наиболее распространенные ламинариевые водоросли Ecklonia kurome и E. stolonifera, фукусовые Sargassum kjellanianum, S. Fulvellum, S. Thunbergii, Hizikia fusiforme, а также Nemacystus decipiens и Cladosiphon okamuranus [13].
      Моря Дальнего Востока отличаются богатейшими запасами бурых водорослей, которые оцениваются в 14–16 млн. т. [2]. 
     Были проанализированы водоросли,  добываемые в морях Дальнего Востока:  15 видов порядка Laminariales, 8 видов порядка Fucales, Desmarestia intermedia — представитель порядка Desmarestiales, C. flagelliformis — представитель порядка Chordariales (Таблица 1). Из них 11 образцов собрано в прибрежных водах восточной Камчатки и северных Курильских островов, 7 — около юго-западного побережья о. Сахалин и в зал. Анива, 13 — в прибрежных водах южного Приморья и зал. Петра Великого, 2 — у побережья Южной Кореи (Пусан) (Таблица 2) [14].
     
     Таблица 2. Виды Бурых водорослей и районы их произрастания.
  Наименование водоросли
  Район произрастания
  Порядок Laminariales — Ламинариевые
  Семейство Laminanariaceae
  
  Род Laminaria
  Saccharina gurjanovae A. Zin
  Зал. Авачинский, бухта Бечевинская
  Laminaria dentigera Kjellm
  Зал. Авачинский, мыс Маячный
  Laminaria yezoensis Miyabe
  Зал. Авачинский, о. Топорок
  Saccharina bongardiana P. et R
  Зал. Авачинский, мыс Маячный; Второй Курильский пролив
  Saccharina cichorioides Miyabe
  Прол. Старка
  Saccharina japonica Aresch
  Южное Приморье; о. Сахалин, зал. Анива; Южная Корея, р-н г. Пусан
  Род Costaria
  Costaria costata (Turn.) Saund
  Северное Приморье; мыс Поворотный, скала Крейсер
  Род Agarum
  Agarum turnere P. et R
  Зал. Авачинский, мыс Налычева
  Agarum cribrosum Bory
  О. Сахалин, зал. Анива
  Род Thalassiophyllum
  Thalassiophyllum clathrus (Gmel.) P. et R.
  Зал. Авачинский, мыс Маячный
  Род Kjellmaniella
  Kjellmaniella crassifolia Miyabe
  Северное Приморье
  Семейство Alariaceae
  Род Alaria
  Alaria fistulosa P. et R.
  О. Сахалин, зал. Анива
  Alaria angusta Kjellm
  Зал. Авачинский, бухта Бечевинская
  Род Undaria
  Undaria pinnatifida (Harv.) Sur
  Зал. Уссурийский, бухта Соболь
  Семейство Arthrothamnaceae
  Род Arthrothamnus
  Arthrothamnus bifidus (Gmel.) J. Ag
  Зал. Авачинский, мыс Маячный
  Порядок Fucales — Фукусовые
  Семейство Cystoseiraceae
  Род Cystoseira
  Cystoseira crassipes (Turn.) Ag.
  Зал. Петра Великого, бухта Теляковского; Приморье, бухта Краковка; о. Сахалин, р-н пос. Неводское
  Cystoseira hacodatenzis (Yendo) Fenshold
  О. Сахалин, зал. Анива
  Семейство Sargassaceae
  Род Cоccophora
  Coccophora langsdorfii (Turn.) Grev
  Зал. Петра Великого, бухта Троицы, бухта Горшкова
  Род Sargassum
  Sargassum pallidum (Turn.) Ag
  Зал. Уссурийский, бухта Тихая; о. Сахалин, р-н пос. Не- водское
  Sargassum confusum C. Ag.
  Зал. Петра Великого, бухта Горшкова
  Sargassum miabe Yendo
  О. Сахалин, р-н пос. Неводское
  Sargassum fulvellum (Turn.) C. Ag
  Южная Корея, р-н г. Пусан
  Род Fucus
  Fucus evanescens Ag.
  Зал. Авачинский, бухта Бечевинская
  Порядок Desmarestiales — Десмарестиевые
  Семейство Desmarestiaceae
  Род Desmarestia
  Desmarestia intermedium P. et R
  Зал. Авачинский, бухта Бечевинская
  Порядок Chordariales — Хордариевые
  Семейство Chordariaceae
  Род Chordaria
  Chordaria flagelliformis (Mull.) Ag.
  Зал. Авачинский, бухта Бечевинская
  
     По литературным данным согласно исследованиям Тихоокеанского научно-исследовательского рыбохозяйственного центра на 2013 год наибольшее количество фукоидана (15,40 %) обнаружено в бурой водоросли C. flagelliformis, минимальное — 0,44 % — в бурой водоросли D. intermedia. В целом, содержание фукоидана в фукусовых водорослях варьирует от 1,5 до 7,9 %, в ламинариевых — от 0,6 до 6,5 % [15]. В порядке Fucales было проанализировано три семейства, при этом, данные по содержанию фукоидана в разных видах одного семейства усреднялись [16]. Среди трех проанализированных семейств максимальное количество фукоидана характерно для водорослей семейства фукусовых (Fucaceae) и семейства Cystoseiraceae и составляет в среднем соответственно 6,04 и 4,66 %. В то же время отдельные представители отличаются высоким содержанием фукоидана — Sargassum fulvellum (7,9 %), Fucus evanescens (6,9 %), Cystoseira crassipes (5,0 %). В порядке Laminariales были проанализированы представители 3 семейств и 7 родов. В целом можно отметить, что среди данного порядка особых различий по семействам не обнаружено, в то же время роды Undaria, Thalassiophyllum, Laminaria и Kjellmaniella накапливают более высокое количество фукоидана по сравнению с остальными бурыми водорослями порядка Laminariales. Среди представителей данного порядка стоит отметить Undaria pinnatifida, которая по накоплению фукоидана не уступает фукусовым водорослям (6,6 %) [3].
     А так же, в ходе литературного анализа выяснилось, что наибольшее воздействие на содержание сульфатированного полисахарида - фукоидана оказывает температура воды. Этот фактор был изучен на примере  водорослей Laminaria gurjanovae, Saccharia bongardia, Saccharia japonica, Cystseira crassipes и Sargassum pallidum,  добытых в различных местах их произрастания (южная часть залива Петра Великого, прибрежная зона Приморского края и западное побережья острова Сахалин). Было выяснено, что в месте, где проходит более теплое течение, содержание фукоидана в водорослях в 2 раза выше, чем в месте, где проходит холодное (Таблица 3). Остальные факторы практически не оказывают влияния на накопление изучаемого полисахарида [6].  
     
     Таблица 3. Содержание фукоидана в водорослях в зависимости от температуры воды (% от сухого вещества).
  Содержание фукоидана в водорослях (% от сухого вещества)
  Вородосль
Приморье
О. Сахалин, Курильские острова                        
Камчатка
  Laminaria gurjanovae
–
0,8 – 2,0
  1,2 – 3,8
  Saccharia bongardia
–
5,7
  2,7
  Saccharia japonica
1,2 – 5,1
0,9 – 2,6
  –
  Cystoseira crassipes
2,3 – 7,7
5,1
  –
  Sargassum pallidum
4,0
3,7
  –
  
     Сульфатированный полисахарид – фукоидан распределен в талломе бурых водорослей не равномерно (Таблица 4), об этом говорится в трудах А.И. Усова [17], который является главным исследователем, достигшим больших результатов в этой сфере. Он определил полисахаридный состав многих водорослей с помощью специально разработанной методики спектрофотометрического анализа экстрактов биомассы. По мнению ученого неисчерпаемым источником бурых водорослей, которые могли бы использоваться для различных промышленных целей, являются прибережные воды Камчатки. В таблице 3 приведены данные по результатам исследования А.И. Усова.
     Таблица 4. Содержание фукоидана в различных видах бурых водорослей. 
  Номер образца
  Вид водоросли
  Часть растения
  Фукоидан, % от сухого веса
  1.
  Pylayella littralis (L.) Kjellm.
  Весь таллом
  1,2
  2.
  Chrdaria flagelliformis (Mull.) Ag.
  
  14,3
  3.
  Chrdaria gracilis Setch. Et Gardn.
  
  9,0
  4.
  Saundersella simplex (Sand.) Kylin
  
  20,4
  5.
  Dictyosiphon foeniculaceus (Huds.) Grev.
  
  6,0
  6.
  Petalonia fascia (Mull.) Kuntze
  
  0,6
  7.
  Scytosiphon lomentaria (Lyngb.) J.Ag.
  
  2,8
  8.
  Desmarestia intermedia P. et R.
  
  0,4
  9.
  Laminaria bongardiana P. et R.
  Пластины
  1,0
  10.
  Laminaria bongardiana P. et R.
  Черешки
  1,2
  11.
  Laminaria longipes Bory
  Пластины
  2,4
  12.
  Laminaria longipes Bory
  Черешки
  1,1
  13.
  Laminaria dentigera Kjellm.
  Пластины
  0,4
  14.
  Laminaria dentigera Kjellm.
  Черешки
  0,7
  15.
  Agarum cribrosum Bory 
  Весь таллом
  1,2
  16.
  Thalassiophyllum clathrus (Gmel.) P. et R.
  
  1,2
  17.
  Arthrothmnus bifidus P. et R. 
  Пластины
  0,4
  18.
  Arthrothmnus bifidus P. et R.
  Черешки
  1,0
  19.
  Alaria marginata P. et R.
  Пластины
  1,4
  20.
  Alaria marginata P. et R.
  Спорофиллы
  6,7
  21.
  Alaria marginata P. et R.
  Жилка
  0,6
  22.
  Alaria marginata P. et R.
  Черешки
  0,6
  23.
  Alaria fistulosa P. et R.
  Пластины
  1,1
  24.
  Alaria fistulosa P. et R.
  Жилка
  0,5
  25.
  Fucus evanescens Ag.
  Весь таллом
  7,7
  
      Анализ литературных данных показал, что наиболее перспективных для выделения фукоидана с точки зрения доступности и содержания являются 4 вида водорослей: S. cichorioides, S. Japonica, F. Evanescens, U. Pinnatifida .
     1. Фукоидан из U. pinnatifida называется галактофукан и имеет блочное строение: блоки построены из остатков фукозы и галактозы, а так же присутствие  1?3- и 1?4-связанных остатков ?-L- фукопиранозы и ?-D-галактопиранозы и  ацетильных групп в полисахариде (Рисунок 1). 
     2. Фукоидан из S. cichorioides содержит главную цепь из 1?3-связанных остатков ?-L-фукопиранозы, сульфатированной по С2 и С4 остатков фукозы (Рисунок 1).
     3.  Фукоидан из бурой водоросли F. evanescens состоит из 1?3- и 1?4-связанных остатков ?-L-фукопиранозы, частично ацетилированных и сульфатированых преимущественно по положению С2, и менее по С4 (Рисунок 1). 
     4. Фукоидан из бурой водоросли S. japonica является галактофуканом, построенным из 1?3-связанных остатков ?-L-фукопиранозы с ответвлениями от основной цепи в виде 1?6-связанных остатков ?-D-галактозы, сульфатированных по положениям С2 и менее С4, а также частично ацетилированных по свободным положениям (Рисунок 4) [1].
     
     Рисунок 4. Фрагменты структуры фукоиданов бурых водорослей S. cichorioides, S. Japonica, F. Evanescens, U. Pinnatifida[1].
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  1.4 Биологические свойства фукоидана растительного происхождения
1.4.1 Антикоагулянтное действие фукоиданов
  
     Фукоиданы проявляют широкий спектр биологических активностей [17]. Известно их успешное применение в фармацевтической промышленности и медицине.
      Описание антикоагулянтных свойств занимает преобладающее место в спектре биологической активности фукоиданов. Их изучение проводится в связи со структурными особенностями этих соединений. Пo мнению многих исследователей, степень антикоагулянтного действия фукоиданов тесно коррелирует с их структурой и функциями.
     Степень антикоагулянтной активности у фукоиданов из разных видов бурых водорослей значительно варьирует от слабо выраженной, либо ее отсутствия, до высокой. Установлена связь между молекулярной массой и антикоагулянтной активностью сульфатированного полисахарида. Одни исследователи считают, что антикоагулянтная активность фукоиданов связана с высокой молекулярной массой [18], другие нижним пределом для проявления этой активности считают 20 кДа [19]. Но в целом авторы заключают, что разные фракции фукоиданов имеют свой оптимум молекулярных масс для проявления антикоагулянтной активности. 
     Установлено также, что антикоагулянтная активность фукоиданов коррелирует с содержанием сульфатов. Рядом авторов подтверждена эта связь на изученных фукоиданах с различным содержанием сульфатов и показано, что десульфатированные фракции фукоиданов были малоактивны [20]. Результаты, полученные этими авторами, свидетельствуют также, что фракции, обогащенные сульфатами, но бедные по содержанию уроновых кислот, проявляют относительно высокую активность, тогда как фракции с обратным соотношением этих структурных составляющих обладают более слабой антикоагулянтной активностью.
      Помимо этого, антикоагулянтная активность фукоиданов находится в зависимости от моносахаридного состава. Как известно, их структурными моносахаридами являются фукоза, галактоза, манноза, ксилоза в различном соотношении. Однако, эта зависимость очень неоднозначна. Так, показано, что высокое содержание фукозы и низкое содержание других нейтральных сахаров могут способствовать проявлению высокой антикоагулянтной активности фукоиданов [21]. Определенное значение для проявления антикоагулянтных свойств имеет соотношение сульфаты - общие сахара. Расчеты показали, что фукоидан, с соотношением менее 3, не является антикоагулянтом. Авторы делают заключение о возможности усиления антикоагулянтной активности фукоидана путем увеличения степени сульфатирования. В то же время Н.А. Ушакова при проведении сравнительного исследования антикоагулянтного действия фукоиданов с разной структурой не выявила прямой зависимости от содержания в них сульфатов, фукозы и других сахаров, а также от структуры основной цепи[22]. Однако большинство исследований свидетельствует о том, что для проявления антикоагулянтных свойств важными являются величина молекулярной массы, количество и расположение сульфатных групп, а также моносахаридный состав. Изучение механизмов антикоагулянтной активности сульфатированных полисахаридов и связи со структурой этих соединений проводится, как правило, в сравнительном аспекте по отношению к гепарину.
     Немаловажная роль в реализации механизмов антикоагулянтной активности фукоиданов принадлежит тромбину. Так, показано, что фукоидан из F. vesiculosus активирует HC II in vitro и in vivo, при этом антитромбиновая активность фукоидана in vivo опосредуется HC II, а не АТ III. В данном случае подавление активности тромбина происходит опосредованно [23]. Установлено, что фукоидан из Ecklonia kurome в значительной степени подавлял тромбинообразование как по внутреннему, так и по внешнему путям свертывания, при этом влияние по внутреннему пути было более выражено. Таким образом, механизм действия фукоидана из E. kurome заключается в ингибирующем эффекте на тромбинообразование путем блокирования протромбиназы и предотвращения образования Ха фактора по внутреннему пути свертывания в дополнение к его антитромбиновой активности. Именно этому механизму принадлежит ведущая роль в угнетении фукоиданом тромбинообразования по сравнению с его эффектом на антитромбиновую активность через HC II плазмы. По данным F. Trento [24] фукоиданы из F. vesiculosus и A. nodosum проявляли высокую антикоагулянтную активность in vivo, которая выражалась в дозозависимом подавлении у кроликов тромбообразования при внутривенном введении фукоиданов. Авторы связывают антикоагулянтный механизм действия фукоиданов с угнетающим воздействием на тромбин и связанные с ним факторы свертывания как на начальном, так и на последующем этапах свертывания. Высокую антитромбиновую активность показали фукоиданы из Saccharina angustata, Pelvetia canaliculata [25]. При этом низкомолекулярные фракции фукоидана из P. canaliculata ингибировали активность тромбина как через HC II, так и посредством активации АТ III, что свидетельствует о значении структурных особенностей в реализации механизма антикоагулянтного действия. A. Cumashi, М. Pereira показали, что фукоиданы с разветвленной структурой ингибируют активность тромбина путем прямого воздействия, а с линейной – опосредованно через HC II и АТ III [26] Таким образом, большая часть фукоиданов ингибирует тромбин в отсутствие АТ III, что отличает их от гепарина, хотя у ряда этих полисахаридов антикоагулянтная активность значительно возрастает в присутствии АТ III [27]. 
  
  1.4.2 Регуляция углеводного обмена
     Ученые провели исследования механизма действия сульфатированнного полисахарида при нарушении углеводного обмена. В результате было доказано:
     1. фукоидан способен стимулировать активацию АМФК в дифференцированных L6 миотрубках;
     2. перспективно использование фукоидана при сахарном диабете. Исследования показали, что сульфатированный полисахарид предотвращает гиперликемию у животных и снижает уровень глюкозы в крови;
     3. фукоидан тормазит развитие диабетической нефропатии при сахарном диабете;
     4. при употреблении фукоидана (500 мг в сутки) у пациентов наблюдалось снижение диастолического альтериального давления и уровня ЛПНП. А также результаты показали, то при приеме фукоидана в течение трех месяцев у пациентов снижалась секреция инсулина;
     5. сульфатированный полисахарид способствует нормализации показателей углеводного, жирового обмена и содержание иодидов в крови [28]. Благодаря фукоидану снижается холестерин за счет отрицательно заряженных сульфатированных групп, которые связывают его и желчные кислоты, выполняющие функцию доставки жиров из кишечника в кровь [29];
     6. фукоидан обладает способностью связывать металлы (свинец), предотвращая отравление.
  
1.4.3 Противовирусная и противоопухлевая активность фукоидана
     Сульфатированные полисахариды морских водорослей угнетающе действуют на РНК- и ДНК-содержащие вирусы. 
     Некоторое количество лет назад было установлено, что фукоиданы из бурых водорослей Macrocystis pyrifera и Fucus vesiculosus затормаживают цитопатическое действие вируса везикулярного стоматита.
     В настоящее время являются важными результаты работ ученых по поиску сульфатированных полисахаридов, обладающих в условиях in vitro селективным ингибирующим действием на вирус иммунодефицита человека. Как и многие сульфатированные полисахариды, фукоиданы блокируют процесс определения и связывания между гликопротеином оболочки gpl20HIV и клеточным рецептором CD4. Ко всему анти-ВИЧ активность сульфатированных полисахаридов не взаимодействует с их антикоагулянтными свойствами и поэтому эти два эффекта взаимонезависимы.
     Важные данные получены японскими исследователями, установившие синергизм анти-ВИЧ эффекта in vitro при взаимном применении фукоидана с азидотимидином. Воздействие на раковые клетки фукоидана привело к самоуничтожению опухолевых клеток, но окружающие здоровые клетки повреждены не были. Результат, который был проявлен через 72 часа воздействия фукоидана, превосходил результат серии сеансов химиотерапии [32].
     Большинство клинических исследований определили, что фукоидан не только эффективен при различных формах рака, но и восстанавливает функции организма у пациентов, прошедших курс интенсивной химии и лучевой терапии.
     Процесс восстановления у этих пациентов протекает быстрее, при этом улучшается общее состояние организма и восстанавливается функция печени. Действие фукоидана уже доказано рядом исследований на человеке. Лечение дукоиданом дает хорошие результаты, оно оказывается эффективным при многихзаболеваниях, не исключая онкологические [33].
  
  1.4.4Способность фукоиданов связывать металлы
  
     Установлено, что фукоидан, из бурой водоросли Ascophyllum nodosum, связывает двухвалентные катионы в следующей последовательности: Pb> Ba> Cd> Sr> Cu> Fe> Co> Zn> Mg> Mn> Cr> Ni> Hg> Ca [31]. Необходимо отметить очень низкое сродство фукоидана к ионам кальция, которые играют существенную роль в жизнедеятельности организмов. В экспериментах на животных сочетанное введение свинца и исследуемого фукоидана приводило к значительному снижению всасывания свинца и поступления его в организм. Биологическая активность фукоидана из Ascophyllum nodosum зависит от вязкости его растворов [34], а также от наличия и положения в полимерной молекуле функциональных групп.
  
  1.5 Методы выделения фукоидана из водорослей
  
     С практической точки зрения, как источник фукоидана, наибольший интерес вызывает водоросль Fucus evanescens. Она произрастает в дальневосточных морях на мелководье и имеет широкий ареал распространения [28].
     По литературным данным существует несколько различных способов извлечения фукоидана из бурых водорослей, имеющих общую основу, но  различающихся субстратом и концентрацией реагентов.
     Исходя из проанализированных литературных данных можно выделить 3 основные метода выделения фукоидана из водоросдей:
     1 Способ предусматривает использование свежей, мороженной или сушеной водоросли, которую  измельчают и экстрагируют 96% этанолом в соотношении 1:1 при температуре 50°C в течение 22 ч. Экстракт содержащий этанол сливают, спирт отгоняют и получают концентрат биологически активных низкомолекулярных соединений. Спирт после отгонки используют повторно. Обработанную водоросль высушивают при комнатной температуре и экстрагируют 0,1 М раствором соляной кислоты 12 ч при 25°C в течение 2 ч при перемешивании. После чего экстракт концентрируют до 1/5 от первоначального объема на ультрафильтрационной установке с мембраной, имеющей поры 5 кДа, нейтрализуют раствором гидроксида натрия и упаривают на роторном испарителе и проводят осаждение фукоидана  двумя объемами 96% этанола [12].
     2  Способ основан на использовании свежей, замороженной или высушенной водоросли. Массу водорослей очищают от механических примесей, измельчают до размера частиц 3 мм и экстрагируют 90-96%-ным этанолом в соотношении 1:6 в аппарате Cокслета при температу.......................