Анализ мутаций в гене цитохрома P450 (СYP1B1) у пациентов с наследственными формами первичной открытоугольной глаукомы

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ
ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ
«БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»



Биологический факультет
Кафедра генетики и фундаментальной медицины

ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА МАГИСТРА
Савельевой Ольги Николаевны

Анализ мутаций в гене цитохрома P450 (СYP1B1) у пациентов с наследственными формами первичной открытоугольной глаукомы


                                   Выполнил: 
                                   Магистрант 2 года очной формы обучения
                                   Направление подготовки
                                   (специальность): Биология
                                   Направленность (профиль): 
                                   Медико-биологические науки
                                   


Допущено к защите в ГЭК и проверено на объем заимствования:

Заведующий кафедрой
д.б.н., проф.
____________  / Э.К.Хуснутдинова


   «___» _________ 2017 г.


Руководитель 
д.б.н., проф.
____________  / Э.К.Хуснутдинова
к.б.н.
____________   / С.Л.Лобов








Уфа – 2017
СОДЕРЖАНИЕ
     
     Список сокращений и условных обозначений …………………………....3
     Введение……………………………………………………………………….
     Глава 1. Обзор литературы……………………………………………...……
     1.2. Эпидемиология, этиология и патогенез………………………………...
     1.3. Факторы риска, роль отдельных факторов в развитии ПОУГ……….
     1.3. Влияние генетических факторов на возникновение и развитие наследственной формы первичной открытоугольной глаукомы ……………..
     1.3.1. Молекулярная генетика первичной открытоугольной глаукомы
     1.3.2. Ген цитохрома P 450 (СYP1B1), функции  белка и роль в патогенезе первичной открытоугольной глаукомы ……………….………………………...
     1.3.3. Мутации и полиморфные варианты в гене P 450 (СYP1B1), связанные с возникновением и развитием ПОУГ…………….………………….
     Глава 2. Материалы и методы исследований ………………...……….…..
     2.1. Материалы исследований……...……………………………………….
     2.3. Выделение геномной ДНК из периферической крови………….....….
     2.4. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК……………………….…
     2.5. SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)…………….……....
     2.6. Секвенирование ………………………………………………..……….
     2.7. Анализ in silico……………………………………………………….
     Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение……………………...
     Заключение…………………………………………………….……………..
     Список использованных источников и литературы………………………
     
     
     
     
     
     СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВГД - внутриглазное давление 
ВГЖ – внутриглазная жидкость
ДЗН – диск зрительного нерва
ПВГ – первичная врождённая глаукома
ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов 
ПОУГ - Первичная открытоугольная глаукома 
ПЦР - полимеразная цепная реакция 
ЦТР – центральная толщина роговицы
ЭПР – эндоплазматический ретикулум
CYP1B1 - ген цитохрома Р450
MYOC- ген миоцилин
NTF4 - ген нейтрофин-4
OPTN - ген оптиневрин
SSСР – Single Strand Conformation Polymorphism (анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК)
WDR36 - ген WD повторяющегося домена 36







ВВЕДЕНИЕ

     Актуальность. Глаукома является глобальной медико-социальной проблемой, одной из лидирующих причин, приводящих к развитию необратимой слепоты и слабовидения во всем мире [Hogewind B.F., 2007, Курышева, 2006]. Первичная глаукома является многофакторным, гетерогенным заболеванием, с наследственной предрасположенностью, проявляется различными вариантами течения. В начальной стадии развития симптомы глаукомы практически не проявляются. Нередко болезнь обнаруживается уже при необратимом поражении зрительного нерва [Нестеров А.П., 2008]. Первичная открытоугольная глаукома (ПОУГ) встречается более чем в 70% от общего числа случаев возникновения разных типов данного заболевания (от 72,3 до 96,1%) [Нестеров А.П., 2008, Бабушкин, 2011]. 
     Генетические и клинические различия  при определении причин возникновения ПОУГ,  разнообразие клинических проявлений [Загидуллина, 2015, Попова 2013], определяют необходимость  исследования их молекулярно-генетической природы и механизмов формирования. Своевременный поиск и идентификация изменений, определяющих риск возникновения и скорость прогрессирования заболевания ПОУГ у пробандов и их родственников, сделают возможным проведение профилактических мероприятий в семьях с большим риском развития ПОУГ. В связи с этим изучение этиопатогенеза и генетических аспектов различных форм ПОУГ является одной из наиболее актуальных проблем офтальмогенетики и молекулярной медицины.
     Степень научной разработанности проблемы.
     Объект изучения: контрольная группа 250 образцов ДНК не родственных мужчин и женщин не имеющих диагноз первичной открытоугольной глаукомы  и других сопутствующих заболеваний глаз и 215 пациентов с клиническим диагнозом первичная открытоугольная глаукома предположительно наследственной этиологии, проживающие в Республике Башкортостан. Средний возраст пациентов с ПОУГ - 68,6±0,6 лет с преобладанием лиц старше 40 лет (87,9%). Выборки пациентов и здоровых индивидов состоят преимущественно из трех этнических групп (русские, татары, башкиры).
     Предмет изучения: генетические факторы, определяющие предрасположенность к развитию первичной открытоугольной глаукомы.
     Целью работы является анализ мутаций в гене цитохрома P450 (СYP1B1) у пациентов с наследственными формами первичной открытоугольной глаукомы.
     Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
     1. Пополнение коллекции образцов ДНК пациентов с наследственными формами первичной открытоугольной глаукомы.
     2. Провести скрининг мутаций второго экзона гена CYP1B1 у пациентов с наследственными формами первичной открытоугольной глаукомы из Республики Башкортостан.
     3. Проведение анализа результатов секвенирования и определение патогенности выявленных изменений.
Методологическая основа исследования. В ходе выполнения работы были использованы такие методы как выделение ДНК, SSCP анализ, секвенирование, анализ in silicо. Обработка результатов была проведена с помощью программ Human Splicing Finder, PolyPhen, SIFT, PhD-SNP, SNAP, Meta-SNP, PANTHER, SNPs&GO, Mutation Assessor
Теоретическая значимость. Результаты работы в дальнейшем могут быть использованы при обучении студентов, при изучении темы молекулярно генетического наследования многофакторных заболеваний с наследственной предрасположенностью.
Практическая значимость. Найденные изменения в комплексе с уже имеющимися данными могут составить основу проведения ранней диагностики первичной открытоугольной глаукомы, что позволит  предотвратить возможные развития патологии зрительного нерва, путем предупреждения и своевременного начала проведения профилактики.
Апробация результатов. Хасанова, Р.Р. Молекулярно-генетический анализ генов CYP1B1 И PITX2 у пациентов с первичной врожденной и первичной открытоугольной глаукомой /Хасанова Р.Р., Джемилева Л.У., Лобов С.Л., Загидуллина А.Ш., Зайдуллин И.С., Гарипова Э.З., Савельева О.Н., Хуснутдинова Э.К. // Сборник трудов IХ Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика 2017»; под редакцией академика РАН В.И. Покровского. - 2017. – с. 436.
Структура ВКР. 
     Новизна исследования. Необходимость профилактики и лечения врожденных случаев ПОУГ обусловлена тем, что до сих пор не разработаны способы ранней диагностики и система профилактических мероприятий, при этом, одновременно, отсутствует повсеместный мониторинг форм ПОУГ среди населения. Не разработаны четкие диагностические алгоритмы обследования пациентов с наследственными дефектами световосприятия, нет полных данных по спектру и частоте мутаций в генах, вовлеченных в патогенез световосприятия у пациентов из различных этнических групп, проживающих на территории Республики Башкортостан (РБ). Таким образом, диагностика и профилактика наследственных форм ПОУГ является актуальной медицинской и социальной задачей.
     
     
     




ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Эпидемиология, этиология и патогенез

     Согласно данным Всемирной организации здравоохранения, в мире  страдают глаукомой от 64,3 до 105 млн. человек и к 2020 году ожидается увеличение этого числа еще на 10 млн. [Kapetanakis, 2015,Barkana, 2014, Егоров, 2013]. Первичная открытоугольная глаукома (ПОУГ) является наиболее распространенной формой глаукомы, встречающейся в 74% от всех случаев глаукомы. Почти половина из числа больных (47%) проживают в Азии, а 24% - в Европе [Quigley, 2006].По результатам литературных данных в России число пациентов с глаукомой превышает 1 млн. человек, которые в структуре первичной инвалидности составляют 28-29 % от общего количества заболеваний глаз [Либман, 2005, Дмитриева, 2014; Доганова, 2011]. С 2001 года глаукома занимает первое место в общем числе первичной инвалидности среди различных заболеваний глаз в Республике Башкортостан (РБ) [Ширяев, 2002]. 
     ПОУГ является наиболее распространенной формой глаукомы во всем мире и составляет в Европе, США и России, по оценкам разных авторов от 70 до 90 % случаев этого заболевания [Allingham, 2009]. ПОУГ имеет большой спектр фенотипов от внутриглазной гипертензии с начальными изменениями зрительного нерва до значительной дегенерации его при нормальном внутриглазном давлении (ВГД).
     Глаукома – группа болезней глаз характеризующихся постоянным или периодическим ВГД выше толерантного уровня (выше 21 мм рт. ст.), вызванных нарушением оттока водянистой влаги, сопровождающихся прогрессирующей нейрооптикопатией, которая проявляется атрофией зрительного нерва (с экскавацией) и специфическими дефектами поля зрения [Егоров, 2013]. 
     Глаукому классифицируют по этиологии (первичная и вторичная), анатомии передней камеры глаза (открытоугольная и закрытоугольная) и времени начала (инфантильно-ювенильная и взрослая). Первичную глаукому разделяют на 3 основные формы: открытоугольная (ПОУГ), закрытоугольная, врожденная (наследственная) глаукома [Загидуллина, 2015].
     Основным отличием вторичной ПОрУГ является развитие как последствие заболевания. При первичной ПОУГ изменения в функционировании и строении структур глаза происходят как часть патогенетического процесса, их дальнейшее развитие приводит к увеличению ВГД. При вторичной ПОУГ изменения вызваны различными заболеваниями, которые в некоторых случаях могут приводить к возникновению глаукомы  [Eгоров, 2008]. ПОУГ часто определяется скрытым началом и медленным развитием характерных поражений глаза. По данным Quigley [Quigley, 2006] с коллегами 62% пациентов не замечают начала развития заболевания.
     Глаукомы - это гетерогенная группа заболеваний, которые имеют две определяющие клинические характеристики: структурные дефекты (например, купирование оптического диска) и функциональные дефекты (например, потеря поля зрения). Было описано множество клинических факторов риска для развития ПОУГ, к которым относятся возраст, семейная история, повышенное ВГД, центральная толщина роговицы (ЦТР). Однако нельзя выделить отдельные факторы риска, например, глаукома может возникать при любом ВГД. ПОУГ, которая возникает при ВГД, которое никогда не поднимается выше порога 21 мм рт. ст., часто называется глаукомой нормального давления [Fingert, 2016]. 
     Первичная врожденная глаукома представляет собой аутосомно-рецессивно наследуемую тяжелую форму глаукомы, вызванную нарушением оттока внутриглазной жидкости (ВГЖ) из-за развития врожденных аномалий в углу передней камеры глаза [Faiq, 2013].Характерным признаком является буфтальм - патологическое увеличение размеров глазного яблока. Это изменение обусловлено высоким содержанием эластических волокон в склере. Механизм образования буфтальма включает растяжение склеры, зрительного нерва и связанных с ним структур из-за увеличенного ВГД . [Hoskins, 1989]. Любое увеличение диаметра роговицы (> 12 мм) в первый год жизни может быть признаком ПВГ 21. В случае ПВГ изменения зрительного нерва не похожи на изменения при глаукоме у взрослых. Опухоли зрительного нерва могут прогрессировать очень быстро как у новорожденных, так и у детей младшего возраста [Quigley, 1977], но могут быть и обратимыми, если вовремя восстановить нормальное ВГД. [Iwata,1977, Faiq 2013]. А глаукоматозное повреждение зрительного нерва у взрослых является необратимым [Quigley, 1977].
     Виды глаукомы, проявляющиеся во взрослом возрасте, такие как ПОУГ,  глаукома нормального внутриглазного давления, эксфолиативная и первичная закрытоугольная глаукома, являются сложными расстройствами с большим влиянием генетических факторов. Семейная история глаукомы для них является основным фактором риска [Leske, 2007; Sun, 2012; Mabuchi 2015].
     ВГД поддерживает постоянство сферической формы глаза и взаимодействие его структур, участвует в обменных процессах функционирующих частей глаза и выведении продуктов обмена. ВГД является ведущим фактором защиты глаз от деформации при движении глазного яблока и при моргании, предохраняет ткань глаза от отека при нарушении циркуляции крови в сосудах глаза, увеличении венозного давления и снижении давления крови. ВГЖ постоянно циркулирует, омывая различные части глаз (внутреннюю поверхность роговицы хрусталик), определяя сохранение функции зрения [Передерий, 2008].
     Поражение зрительного нерва может возникнуть в результате митохондриальной дисфункции  ганглиозных клеток сетчатки и астроцитов, поскольку при высоком ВГД, спровоцированном  метаболическим стрессом трудно будет восполнить уровень необходимой энергии для нормальной жизнедеятельности клеток [Ju, 2008]. 
     Баланс между секрецией ВГЖ в цилиарном теле и ее выведением через два независимых пути оттока - трабекулярной сети и увеосклерального пути определяется внутриглазным давлением. У пациентов с открытоугольной глаукомой, наблюдается повышенная устойчивость к оттоку жидкости через трабекулярную сеть. Увеличение ВГД может вызвать механическое напряжение и нагрузку задних структур глаза, особенно решетчатой пластинки и прилегающих к ней тканей [Robert, 2014].
     Нарушение микроциркуляции, поражение иммунитета, эксайтотоксичность, и оксидативный стресс могут также привести к глаукоме. Первичные нейронные патологические процессы могут вызвать вторичные нейродегенерации других нейронов сетчатки и клеток центрального зрительного пути, изменяя их окружающую среду и повышая их восприимчивость к повреждениям [Almasieh, 2012].
     Патогенез ПОУГ по А. П. Нестерову:
     1. Возрастные дистрофические и функциональные нарушения, определенные генетической предрасположенностью;
     2. Гидростатический сдвиг;
     3. Функциональный блок дренажной системы глаза;
     4. Нарушение гидродинамики глаза;
     5. Повышение ВГД, вторичные сосудистые дегенеративные изменения в переднем и заднем отрезках глаза;
     6. Органический блок дренажной системы глаза с атрофией зрительного нерва и потерей зрительных функций.
     К главным составным частям дренажной системы глаза относятся передняя камера и угол передней камеры (рис.1) [Передерий, 2008]. ВГЖ создается в задней камере глаза ресничными отростками цилиарного тела, затем через отверстие зрачка проникает в переднюю камеру глаза. Движение ВГЖ по структурам стекловидного тела определяет его трофическую и обменную функции. ВГЖ собирается в углу передней камеры глаза, где находятся передние и задние пути оттока, откуда через трабекулярную сеть, полость склерального синуса, коллекторные каналы и интрасклеральное сплетение впадает в водяные вены. Также из угла передней камеры глаза ВГЖ оттекает вдоль волокон цилиарной мышцы в супраувеальное и супрахориоидальное пространство и далее через толщу склеры наружу [Егоров, 2007].
     
Рис.1 Дренажная система глаза (схема) [Копаева, 2012].
1 - угол передней камеры; 2 - трабекулярный аппарат; 3 - шлеммов канал; 4 - коллекторный каналец.
     Для ПОУГ характерен функциональный блок венозного синуса склеры. Данное состояние характеризуется различной степенью смещения  трабекулярных пластин в сторону внешней стенки шлеммова канала [Cветлова, 2004], просвет которого сужается. Возникновение функционального блока чаще появляется в глазах пациентов с генетическим предрасположением к таким анатомическим особенностям как: переднее расположение венозного синуса склеры, недостаточное развитие склеральной шпоры в соотношении с задним расположением цилиарной мышцы. Поражения дренажной системы глаза в разной степени определяются нарушениями в работе нервной, сосудистой и эндокринной систем [Передерий, 2008].
     ВГД зависит от взаимодействия факторов таких как:
     1) кровенаполнение и тонус сети кровеносных сосудов глаза, состояние стенки сосудов;
     2) скорость обмена внутриглазной жидкости; продукция и отток жидкости, циркулирующей в передней и задней камерах глаза;
      3) процессы метаболизма, происходящие внутри глаза, которые часто приводят к появлению серьезных изменений тканей глаза, например набухание коллоидов стекловидного тела; 
     4) эластичность капсул глаз — склер [Передерий, 2008]. 
     Наименьшая толщина склеры располагается в области выхода волокон зрительного нерва, около решетчатой пластины, через которую выходят из глаза аксоны ганглиозных клеток сетчатки. Решетчатая пластина является наиболее уязвимым местом в стенке глаза. ВГД, индуцированное напряжением, может привести к сжатию, деформации и ремоделированию решетчатой пластинки с последующим механическим повреждением аксонов [Burgoyne, 2005], которое нарушает ретроградный аксональный транспорт, обеспечивающий доставку трофических факторов от ствола головного мозга к ганглиозным клеткам сетчатки  (нейроны латерального коленчатого тела) [Quigley, 2000]. Ганглиозные клетки сетчатки глаза являются третьим звеном зрительного анализатора, расположены в ретинальном слое сетчатки [Лазаренко, 2004]. Нарушение аксонального транспорта происходит на ранней стадии патогенеза глаукомы. В результате происходит накопление синаптических везикул и дезорганизация микротрубочек и нейрофиламентов в преламинарных и постламинарных областях зрительного нерва [Quigley, 1981]. Результатом также может быть митохондриальная дисфункция ганглиозных клеток сетчатки глаза и астроцитов [Ju, 2008].
     В процессе старения организма даже у здорового человека теряется определённое число нервных волокон, а при глаукоме степень они разрушаются намного быстрее. При глаукоме кроме гибели нервных волокон начинают разрушаться и ткани глаза. Характерным признаком пациентов является атрофия (отсутствие питания) диска зрительного нерва. Происходит нарушение связи между глазом и мозгом. Атрофия возникает в результате частичного или полного поражения нервных волокон, которые выходят в задней части глаза в виде пучков, формирующих зрительный нерв [Передерий, 2008].
     Периферическая часть передней камеры называется углом передней камеры (рис. 2). Передняя стенка угла образована корнеосклеральным соединением, задняя — корнем радужки, вершина— цилиарным телом. 


Рис.2. Передний сегмент глаза [Копоева, 2012].
1 - задняя камера; 2 - передняя камера; 3 - шлеммов канал (венозный синус склеры). Стрелками указан путь оттока водянистой влаги из задней камеры в переднюю.

     Симптомы глаукомы с нормальными значениями ВГД являются типичными для первичной глаукомы: сужение поля зрения, поражение зрительного нерва с глаукоматозной экскавацией диска зрительного нерва (ДЗН). Патология зрительного нерва часто бывает связана с пониженной толерантностью к ВГД, а также с атеросклерозом сосудов, кровоснабжающих зрительный нерв. Глаукома при нормальном ВГД часто бывает связана с вегетососудистой дистонией, протекающей по гипотензивному типу [Бойкова, 2007].
     При формировании ПОУГ ВГД увеличивается постепенно, изменения связаны с повышением сопротивления оттоку ВГЖ. С увеличением степени глаукоматозной атрофии ДЗН происходит и ухудшение зрительных функций. На поздних стадиях развития болезни концентрически суживается поле зрения (со всех сторон). Снижение остроты зрения обычно происходит на наиболее тяжелых стадиях развития ПОУГ [Бойкова, 2000].
     ПОУГ наиболее часто выявляется у пациентов старше 35 лет. К основным патогенетическим изменениям относится трабекулопатия и функциональный каналикулярный блок, увеличение ВГД. В результате предыдущих действий развиваются характерные для ПОУГ поражения в ДЗН, ганглиозных клетках сетчатки и ухудшение зрительных функций [Егоров, 2008].
     Главной концепцией патогенетических механизмов возникновения ПОУГ в настоящее время является мультифакторная теория. Согласно данной концепции развитие заболевания определяется взаимодействием наследственной предрасположенности, этнической принадлежности и факторов окружающей среды. Полигенная предрасположенность определена сочетанием аллелей нескольких генов, определённые варианты которых при взаимодействии с факторами внешней среды приводят к развитию мультифакторных заболеваний [Попова, 2013].
     Таким образом, патогенез ПОУГ включает два основных механизма: поражение дренажной системы глаза, приводящее к повышению ВГД, и комплекс изменений в заднем отделе, который служит причиной атрофии зрительного нерва.

1.2. Факторы риска, роль отдельных факторов при развитии первичной открытоугольной глаукомы

     ПОУГ относится к группе болезней с наследственной предрасположенностью, в этиологию которых наравне с факторами окружающей среды большой вклад вносят генетические составляющие [Нестеров, 2003]. Доля наследственно обусловленных случаев заболевания составляет, по данным различных авторов, от 20 до 60 % [Liu, 2011]. Основная часть случаев заболеваемости глаукомой не наследуется по законам Менделя, но родственники имеют большую вероятность приобретения болезни  [Flammer, 2004]. Для людей, ближайшие родственники которых, страдают от ПОУГ характерно десятикратное увеличение возможного риска развития данного заболевания, риск также возрастает  по мере общего увеличения числа заболевших в семье [Wang, 2011; Kong,2011, Gramer, 2011, Рахманов, 2005].
     Факторы риска развития ПОУГ:
     1. Наследственность. Число пациентов с ПОУГ среди кровных родственников увеличено в 5-6 раз по сравнению с общей популяцией.
     2. Возраст. ПОУГ чаще всего возникает у людей старше 40 лет, а общее число больных увеличивается  в более старших возрастных группах.
      3. Миопия. 
     4. Сахарный диабет, приводящий к нарушению гормонального обмена, в частности глюкокортикоидов.
     5. Выраженная пигментация трабекулярного аппарата. 
     6. Органические (атеросклероз) и функциональные (сосудистые спазмы) нарушения кровообращения в сосудах головного мозга и в глазничной артерии. 
     7. Расовая принадлежность [Егоров, 2008].
     Одной из теорий по определению генетических компонентов сложных заболеваний является определение основных эндофенотипов, которые, как правило, измеряются количественными признаками связанными с фенотипом болезни [Gottesman, 2003]. Эндофенотипы, также известные как промежуточные фенотипы, могут сильно зависеть от наследственности, а локусы, связанные с эндофенотипом  предрасполагать к общему риску развития заболевания [Charlesworth, 2010].Стратегия эндофенотипирования при полногеномном поиске ассоциаций позволяет  ранжировать участников исследования по возможному риску появления болезни [Cohen, 2006; Kathiresan, 2008]. К эндофенотипам ПОУГ относятся такие показатели как соотношение диаметров экскавации к диску зрительного нерва, ЦТР, ВГД , площадь диска зрительного нерва . Глубина передней камеры глаза является эндофенотипом ПОУГ, наследуемость которого является очень высокой [Chang, 2005; Sanfilippo, 2010].
     В работе группы исследователей была показана корреляция между величинами ВГД у членов семьи (наследуемость от 056 до 0,64) [Carbonaro, 2009]. Аналогичные исследования, определеляющие отношения диаметра экскавации к диску зрительного нерва сообщали о наследуемости от 0,48 до 0,56 [Chang, 2005]. Была определена  корреляция ЦТР между ближайшими родственниками  (наследуемость от 0,6 до 0,7) 24 и между близнецами (наследуемость 0,95) [Toh, 2005]. Наследуемость размеров ЦТР глаза по Dimasi et al. составляет до 95% [Dimasi, 2010]. Предполагается, что более тонкая роговица более восприимчива к поражению зрительного нерва. Эта ассоциация частично может быть объяснена влиянием ЦТР на изменение ВГД [Dueker, 2007; Copt, 1999]
      Каждый фактор не способен самостоятельно вызывать заболевание, но совокупное воздействие многих генетических и экологических факторов риска может привести к развитию ПОУГ. Поскольку на семьи (и этнические группы) влияют множество генетических факторов, сложные генетические формы глаукомы могут быть более распространены при семейных случаях наследования заболевания или в конкретных этнических группах [Fingert, 2016].
     В некоторых случаях сахарный диабет 2-го типа определяют как фактор риска к развитию ПОУГ, у пациентов с данным заболеванием часто повышается ВГД, что может приводить к глаукоматозному повреждению зрительного нерва [Zhao, 2015; Mitchell 1997]. Сахарный диабет представляет собой сложное расстройство, характеризующееся нарушением регуляции в многочисленных интерактивных процессах, которые могут иметь различные биологические эффекты для развития ПОУГ. Но данные результаты являются противоречивыми, многие исследования не обнаружили существования ассоциации заболевания с ПОУГ [Дорофеев, 2014, Tan,2010, de Voogd, 2006].
     Результаты многих работ определяли миопию в качестве  важного фактора риска для развития ПОУГ [Xu, 2007, Kuzin, 2010, Marcus, 2011]. Риск проявлялся наиболее сильно у пациентов с близорукостью средней и высокой степени (ниже -3.00 диоптр) [Perera, 2010, Liang, 2011]. Влияние может быть объяснено увеличением осевой длины глаза при близорукости, которая может определить повреждение соединительной ткани в области диска зрительного нерва и деформацию решетчатой пластины, следствием чего является развитие ПОУГ [Marcus, 2011].
     Генетические факторы определяют анатомическую предрасположенность к поражениям гидростатики и гидродинамики, что вызывает повышение ВГД. По мере старения тканей и оболочек глаза уменьшается пульсовое давление крови и периферический объем циркулирующей крови, что приводит к общему снижению объема крови, увеального тракта передней части глаза [Передерий, 2008]. Старение тканей глаза [Затулина, 2000;Светлова, 2003] и ТС определяет повышение ВГД как в здоровых, так и в глаукомных глазах. ВГД у большого числа пациентов с ПОУГ начинает увеличиваться в возрасте 40-50 лет, а иногда и в более поздний период жизни [Передерий, 2008, Балалин, 2013]. 
     Разными авторами были предложены механизмы влияния гипертонии на развитие ПОУГ. Гипертония может привести к изменению микрососудистой системы клеток сетчатки глаза и области ДЗН, что, в свою очередь, может уменьшить приток крови к ДЗН [Flammer, 2002; Fuchsjager, 2004]. Также гипертония может нарушить отток водянистой влаги, образующейся в цилиарном теле, в задней камере глаза, препятствуя кровоснабжению зрительного нерва [ Кунин, 2002Wong, 2007; Hayreh, 2003],
     Риск и подтипы глаукомы различаются cреди разных рас и стран. Многочисленные эпидемиологические исследования подтвердили, что число случаев заболевания ПОУГ у афроамериканцев намного выше по сравнению с другими этническими группами [Yih-Chung,2014, Friedman, 2006] У афроамериканцев ПОУГ развивается в среднем на 10 лет раньше и в 4 раза чаще, чем у людей с белым типом кожи [Tielsch, 1991].
     На сегодняшний день определено множество генных мутаций, являющихся причиной развития ПОУГ [Monemi, 2005; Pasutto, 2009; Pasutto, 2012]. Генетические анализы, в том числе ассоциативные исследования, определили 65 генов кандидатов, предрасполагающих к развитию ПОУГ, [Janssen, 2013] которые можно разделить на 2 группы. Первая включает гены, изменения в которых связаны с повышением ВГД. Вторая группа включает гены, для которых нарушение функции белка связано с повышением уязвимости клеток сетчатки глаза и / или зрительного нерва независимо от ВГД, может включать генетические варианты, связанные с апоптозом ганглиозных клеток сетчатки, [Almasieh, 2012] близорукостью, [Kuzin, 2010, Marcus, 2011] циркуляцией зрительного нерва [Janssen, 2013].
     ПОУГ относится к группе мультифакторных заболеваний с наследственной предрасположенностью. Существуют противоречивые мнения о степени влияния наследственных факторов на развитие ПОУГ [Dong, 2012], однако большое число результатов исследований определяет генетические особенности как один из наиболее значимых факторов риска [Fuse, 2010; Romanenko, 2009]. Эпидемиологические исследования продемонстрировали, что генетические и экологические факторы могут влиять на этиологию заболевания, в то время как генетические факторы в основном участвуют в возникновении ПОУГ [Wang, 2015; Stone, 1997].
     Основное лечение ПОУГ направлено на снижение ВГД и является эффективной терапией для замедления прогрессирования поражения зрительного нерва или предотвращения развития болезни. Необходимым условием клинической практики служит то, что пациенты будут выявлены на ранней стадии патологического процесса заболевания [Heijl, 2002; Souzeau, 2016]. Снижение ВГД достигается с помощью лекарственных препаратов, с помощью лазера или при хирургическом вмешательстве. В эпоху персонализированной медицины прогнозирование развития болезни предоставляет возможность планирования и проведения своевременного лечения. Учитывая трудности диагностики  глаукомы на ранних стадиях развития и необходимость проведения эффективных превентивных мер для ПОУГ, генетическое тестирование родственников при ранее выявленных наследственных вариантах развития болезни определяет реальную возможность увеличения эффективности терапии и предотвращения развития слепоты [Healey,2004; Souzeau, 2014, Williams, 2015].
     Согласно проанализированным данным по степени влияния различных факторов риска на развитие и прогрессирование ПОУГ можно отметить важность проведения генетической диагностики, особенно при семейных случаях заболевания глаукомой. Таким образом, представляется необходимым поиск и анализ изменений в генах кандидатах, определяющих предрасположенность к возникновению и развитию ПОУГ.

1.3. Влияние генетических факторов на возникновение и развитие наследственной формы первичной открытоугольной глаукомы

1.3.1. Молекулярная генетика первичной открытоугольной глаукомы

     По некоторым данным глаукома, характеризуются как болезнь фенотип которой проявляет генетическую гетерогенность, полигенное наследование, и неполную пенетрантность [Gemenetzi].
     Мутации в генах, которые приводят к ПОУГ, можно разделить на две большие группы. Один класс мутаций способен «предопределять» ПОУГ самостоятельно, влияние других генов или окружающей среды незначительно. Это моногенные формы глаукомы, которые ответственны за заболевание,  передающееся как менделевский признак, часто с аутосомно-доминантным типом наследования. Другой класс мутаций, «аллели риска», может определять развитие ПОУГ в сочетании с другими аллелями риска глаукомы и факторами окружающей среды, но не вызывает болезней самостоятельно. Эти аллели или генетические факторы риска статистически более часто встречаются у пациентов с ПОУГ, хотя очень часто одинаковые изменения обнаруживаются и у пациентов и у контрольной группы [Fingert, 2011].
     По результатам исследований к основной группе генов, различия и изменения в которых способны вызывать ПОУГ с минимальным влиянием от другого гена(ов) или окружающей среды относятся миоцилин (MYOC), оптиневрин (OPTN), WD повтор домена 36 (WDR36), цитохром Р450 семейства 1, подтипа в, полипептид 1 (CYP1B1) и нейротрофин 4 (NTF4) [Janssen, 2013].
     MYOC является первым геном, изменения в котором были ассоциированы с развитием ПОУГ. Этот ген находится  на локусе GLC1A на хромосоме 1q23, состоит из трех экзонов, кодирует белок миоцилина. Наследование изменений в гене  MYOC происходит по аутосомно-доминантному типу и характеризуется высокой пенетрантностью, а у носителей мутаций обычно в более молодом возрасте начинается увеличение ВГД [Souzeau, 2013]. Со времени открытия гена MYOC в 1997 году было описано более 80 изменений, ассоциированных с развитием ПОУГ, среди которых наиболее распространена мутация p.Gln368Ter [Hewitt, 2008]. Большинство изменений было обнаружено в третьем экзоне гена MYOC, кодирующем ольфактомедин - подобный домен [Kwon, 2009]. Фенотипическая изменчивость изменения p.Gln368Ter имеет переменную пенетрантность около 50%, причем наибольшее число пациентов старше 50 лет [Craig, 2001]. Другие варианты, ассоциированные с развитием заболевания, такие как p.Pro370Leu и p.Gly367Arg характеризуются полной пенетрантностью и возрастом проявления заболевания близком к 50 годам [Shimizu, 2000; Souzeau, 2013]
     Белок миоцилин был обнаружен в большинстве глазных тканей, таких как трабекулярная сеть, склера, радужная оболочка глаза, роговица, хрусталик, цилиарное тело, сетчатка и зрительный нерв, также  белок MYOC был выделен из стекловидного тела [Souzeau, 2013].
     Наиболее распространенная гипотеза о влиянии мутаций в гене MYOC на развитие ПОУГ связывает поражение зрительного нерва с формированием и накоплением неправильно свернутого внутриклеточного белка MYOC в трабекулярную сеть, что приводит к снижению оттока влаги, влияя на регуляцию ВГД [Gemenetzi, 2012, Gobeil, 2004]. Измененный белок MYOC вовлечен в блокирование оттока воды через ТС, что приводит к увеличению ВГД и повреждению зрительного нерва [Tan et al., 2006].
     Важность изучения I экзона была определена выявлением мутации Arg46Stop, которая является второй по распространенности мутацией после Gln368Stop. Мутация Gln368Stop (rs74315329) в настоящее время является наиболее распространенной и встречается в более чем 40% случаев ПОУГ, ассоциированных с мутацями в гене MYOC [Nag, 2017; Fingert, 1999]. Полиморфный вариант в 1 экзоне гена MYOC Gln48His был обнаружен среди пациентов с ПОУГ из Индии в когорте Восточной и Южной Индии, но эта мутация отсутствовала у пациентов из Мадурая и Каньякумари в силу демографических различий [Kumar, 2017].
     При повышенной экспрессии белка MYOC с мутацией Pro370Leu в клетках трабекулярной сети проявляются признаки митохондриальной дисфункции и, таким образом, данное изменение может увеличить число клеточных инсультов, вызывает нарушение клеточных функций и даже смерть [Yuan, 2009].
     В результате исследования культуры клеток было обнаружено, что белки, возникающие при экспрессии гена MYOС, измененного в результате миссенс-мутаций, вызывающих заболевание ПОУГ, подвержены агрегации в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР) [Liu, 2004]. Последствиями являются структурные изменения в ЭПР [Zode, 2011; Kanagavalli, 2007] и гибель части его клеток [Liu, 2004, Yam, 2007]. Предполагается, что этот каскад приводит к уменьшению оттока жидкости из трабекулярной сети и ускорению процессов развития глазной гипертензии, которая является основным факторо.......................