Значение экстремофильных грибов и их использование в биотехнологии

                  
                  МИНОБРНАУКИ РОССИИ 
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего образования
 «Московский технологический университет»
МИРЭА
		
      Институт Тонких Химических Технологий
      Кафедра химии и технологии биологически активных соединений, медицинской и органической химии
		

РАБОТА ДОПУЩЕНА К ЗАЩИТЕЗаведующий кафедрой____________________
«____» ___________ 20____ г.

Выпускная квалификационная работа магистра
по направлению 19.04.01 «Биотехнология»

Руководитель (научный)


кандидатхимических наук, доцентГроза Н.В.
Консультант



доктор биологических наук, зав. лаб.Терёшина В.М.
(ФИЦ «Биотехнологии» РАН)




МОСКВА 2018
Электронная версия ВКР передана на выпускающую кафедру


ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ	3
ВВЕДЕНИЕ	4
1.	ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР	5
1.1.	Значение экстремофильных грибов и их использование в биотехнологии.	5
1.1.1.	Психрофильные грибы	5
1.1.2.	Термофильные грибы	8
1.1.3	Осмофильные грибы	10
1.1.4	Галофильные грибы	12
1.1.5	Ацидофильные грибы	14
1.2.	Экстремофилия грибов	18
1.2.1	Термофилия	18
1.2.2	Алкалофилия	24
1.2.3	Галофилия	27
1.3.	Биохимические основы ответа неэкстремофильных грибов на стрессорные воздействия	30
1.4.	Ответ экстремофильных грибов на тепловой, осмотический и рН стресс	35
2.	РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ	36
3.	ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ	37
3.1.	Цели и задачи:	37
3.2.	Методы и материалы исследования:	37
3.2.1.	Анализ липидов	37
3.2.2.	Анализ растворимых углеводов цитозоля	40
ВЫВОДЫ	41
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ	42



СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
     
     HOG – (high osmolarity glycerol) высокоосмолярный глицерин
     MAPK – (mitogen-activated protein kinase) митоген активируемая протеинкиназа
     STRE – (stress response elements) участокпромоторагена
     БТШ – белки теплового шока 
     ДАГ - диацилглицерины
     КЛ – кардиолипины 
     ЛФЭ - лизофосфатидилэтаноламин
     СЛ – сфинголипиды 
     СН – степень ненасыщенности 
     Ст – стерины
     ТАГ – триацилглицерины 
     ТШ – тепловой шок 
     ФИ – фосфатидилинозиты
     ФК – фосфатидные кислоты 
     ФС – фосфатидилсерины
     ФХ – фосфатидилхолины
     ФЭ – фосфатидилэтаноламины
     

ВВЕДЕНИЕ

     	


1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Значение экстремофильных грибов и их использование в биотехнологии.
     Экстремофильные грибы – группа грибов, подгруппы которой способны существовать и размножаться в экстремальных условиях окружающей среды: при низких (4°С) и высоких (60°С и выше) температурах, при высоком давлении, при высоких концентрациях солей, при рН ниже 2 и выше 11 и др. 
     В зависимости от толерантности к тем или иным условиям, различают несколько видов грибов: 
> Психрофилы (способны существовать при низких температурах);
> Термофилы (способны существовать при высоких температурах);
> Осмофилы (способны существовать при высоком осмотическом давлении);
> Галофилы (способны существовать при высокой солёности среды);
> Ацидофилы (способны существовать при низких значениях рН);
> Алкалофилы (способны существовать при высоких значениях рН);
> Полиэкстремофилы (способны существовать при одновременном воздействии нескольких факторов)[1].

1.1.1. Психрофильные грибы
     Психрофильные грибы – вид грибов, температурный оптимум которыхлежит в пределах от 0? или ниже до 20? и нижес В пределах данного вида различают облигатные и факультативные психрофильные грибы. Облигатные грибы чувствительны к температуре свыше 15?, при этом оптимальной для них считается температура 4-10? и ниже, максимальной – 20-22?. Факультативные грибы могут расти при низких температурах, но предпочитают умеренные, они отличаются более высокими максимальными температурами (до 37?), чем облигатные грибы. Оптимальная температура для этих грибов составляет 20-30?. Факультативные психрофильные грибы также называют еще холодоустойчивыми, или психротолерантными[3].
     Психрофильные грибы и продукты их метаболизма используют в сельскохозяйственной и медицинскойпромышленностях. В основном, широкое применение в биотехнологии получили ферменты грибов.
     В частности, ферменты психрофильных грибов применяются в пищевой промышленности: производство сыров и йогуртов, удаление лактозы из молока, а также модификация вкуса[4].В промышленности фруктовых соков использование пектиназ помогает процессу экстракции сока, снижает вязкость и помогает очистить конечный продукт; в мясной промышленности протеазы помогают смягчать мясо, а в хлебопечении, ферменты, такие как амилазы, протеазы и ксиланазы, могут быть использованы для сокращения времени брожения теста, улучшения свойств теста в дополнение к сохранению ароматов и уровней влажности.
     Хорошо известным и важным применением ферментов, таких как протеазы, липазы, ?-амилазы и целлюлазы, является их использование в качестве добавок в детергентах. Однако, какими будут преимущества холодной мойки? Очевидными преимуществами являются сокращение потребления энергии и снижение износа. Но каков был бы недостаток использования ферментов, адаптированных к холоду? Возможно, их нестабильность при добавлении в конечный продукт и их хранение. Однако эти ферменты являются рекомбинантными ферментами и, по-видимому, возможно улучшить стабильность фермента, адаптированного к холоду, при сохранении его высокой каталитической эффективности при низких температурах.
     Можно представить себе использование адаптированной к холоду целлюлазы для процессов биополирования и окраски одежды. В текстильном производстве ткани часто имеют концы хлопкового волокна, выступающие из основных волокон, которые уменьшают гладкость и изменяют внешний вид предмета одежды. Эти свойства ухудшаются путем последовательных промывок. Предварительная обработка целлюлазами при соответствующих условиях путем удаления торчащих концов увеличивает долговечность и мягкость ткани. Однако текущая обработка сопровождается потерей механической прочности вследствие изменения основного волокна в результате устойчивости фермента к инактивации. Адаптированная к холоду целлюлаза позволила бы снизить температуру процесса и концентрацию требуемых ферментов. Механическая стойкость конечного продукта также будет улучшена в результате спонтанной быстрой инактивации фермента.
     Идея использования микроорганизмов для уменьшения загрязнения окружающей среды, например, в почвах и сточных водах, не нова, но представляется возможной альтернативой физико-химическим методам.
     В регионах с умеренным климатом сильные сезонные колебания температуры снижают эффективность микроорганизмов в разложении органических загрязнителей, таких как жиры и липиды. Тем не менее, биоаугментация и инокуляция загрязненных сред конкретными микроорганизмами, адаптированными к холоду, в смешанных культурах должны способствовать улучшению биодеградации трудноразрушимых химических веществ. В результате высокой каталитической эффективности их ферментов и их уникальной специфичности при низких и умеренных температурах микроорганизмы, адаптированные к холоду, должны быть идеальными для целей биоремедиации.
     Однако об этих микроорганизмах известно мало, и оптимальные условия их использования должны быть тщательно оценены. Недавние программы Европейского союза, ориентированные на психрофильные микроорганизмы, помогли улучшить наше понимание этих организмов и создать соответствующие научные условия для их оценки. Обработка сточных вод, загрязненных в результате деятельности человека, вероятно, будет самым простым способом начать изучение потенциальных применений микроорганизмов, адаптированных к холоду, в снижении количества токсичных соединений, например, нитратов, углеводородов, ароматических соединений, тяжелых металлов и биополимеров, такие как целлюлаза, хитин, лигнин, белки и триацилглицерины [5].

1.1.2. Термофильные грибы
     Термофильные грибы – вид грибов, имеющие максимальную температуру роста не ниже 50?, а минимальную не ниже 20?. Термотолерантными считаются грибы, для которых максимальная температура роста также близка к 50? , но минимальная – существенно ниже 20?[2].
     Термофильные грибы занимают первое место в природе по объему выделения ксиланаз, которые широко применяются в бумажной и сельскохозяйственной промышленностях. Ксиланазы полезны в бумажной промышленности своей способностью отбеливать крафт-целлюлозу, а в сельскохозяйственной используются для улучшения усвояемости кормов для животных, а также способны катализировать переработку отходов, в результате которой получаются полезные химикаты и топливо [6].
     Моющие средства являются основными потребителями ферментов, продуцируемыми термофильными грибами, как по объему, так и по стоимости. Использование таких ферментов в препаратах в качестве детергентов повышает способность моющих средств удалять стойкие пятна и делает моющее средство экологически безопасным. Амилазы являются вторым типом ферментов, используемых в составе ферментативного детергента, а также 90% всех жидких моющих средств содержат эти ферменты. Данные ферменты используются в качестве детергентов для стирки в стиральной машине и мойки в автоматической посудомоечной машине для деградации остатков крахмалистых продуктов, таких как картофель, соусы, заварной крем, шоколад и т.д. до декстринов и других небольших олигосахаридов. Также окислительная стабильность амилаз является одним из важнейших критериев их использования в моющих средствах, где моющая среда сильно окисляется. Удаление крахмала с поверхностей в свою очередь важно для обеспечения белизны, так как крахмал может быть аттрактантом для многих типов загрязняющих частиц [7].
     Термофильные амилазы также широко применяются в пищевой промышленности, такой как хлебопечение, пивоварение, подготовка пищеварительных средств, производство тортов, фруктовых соков и сиропов крахмала. ?-Амилазы широко используются в хлебопекарной промышленности. Эти ферменты могут быть добавлены к тесту, чтобы разложить крахмал в муке на короткие декстрины, которые затем ферментируются дрожжами. Добавление амилазы к тесту приводит к повышению скорости ферментации и снижению вязкости теста, что приводит к улучшению объема и текстуры продукта. Кроме того, амилаза способствует выработке дополнительного сахара в тесте, что улучшает вкус, цвет корки и качество поджаривания хлеба. Помимо образования ферментируемых соединений, ?-амилазы также улучшают/повышают сохранение мягкости хлебобулочных изделий, увеличивая срок хранения этих продуктов. Амилазы также используются для осветления пива или фруктовых соков.
     Амилазы используются в текстильной промышленности на стадии удаления клея с ткани. Клеящие агенты, такие как крахмал, наносятся на пряжу до производства ткани, чтобы обеспечить быстрый и безопасный процесс ткачества. Крахмал используется повсеместно, потому что он дешевый, легко доступен в большинстве регионов мира, и его можно легко удалить. Затем крахмал удаляют из тканого материала во влажном процессе в текстильной отделочной промышленности. Стадия удаления клея включает удаление крахмала из ткани, который служит в качестве усиливающего агента для предотвращения разрушения нити основы в процессе ткачества. Амилазы выборочно удаляют клей и не разрушают волокна ткани [7].
     Использование ?-амилаз в целлюлозно-бумажной промышленности относится к модификации крахмала мелованной бумаги, то есть для получения маловязкого высокомолекулярного крахмала. Обработка покрытия служит для того, чтобы поверхность бумаги была достаточно гладкой и прочной, чтобы улучшить качество печати бумаги. Для этого применения вязкость натурального крахмала слишком велика для проклеивания бумаги, и это может быть изменено путем частичного разрушения полимера амилазами в периодических или непрерывных процессах. Клей увеличивает жесткость и прочность бумаги. Примеры амилаз, полученных из микроорганизмов, используемых в бумажной промышленности, включают Amizyme® (PMP Fermentation Products, Peoria, USA), Termamyl®, Fungamyl, BAN® (Novozymes, Denmark) и ?-амилазу G9995® (Enzyme Biosystems, США) [8].

1.1.3 Осмофильные грибы
     Осмофильные грибы – вид грибов, способных расти при высоком осмофильном давлении. Причем давление может обеспечивать химический состав среды: в зависимости от ионного состава.
     Эритрит (1,2,3,4-бутантетрол) представляет собой четырехуглеродный сахарный спирт с молекулярной массой 122. Из-за его низкой энергетической ценности, свойств не стимулировать инсулин и превосходного вкуса, эритрит используется в качестве фармацевтического наполнителя и некалорийного подсластителя.К запатентованным веществам, в состав которых в качестве подсластителя входит эритрит, относятся шоколад, жевательная резинка, бисквит и крем[9].Промышленное производство эритрита началось в Японии в 1990 году. Эритрит производится аэробной ферментацией, а не процессами химического синтеза, такими как гидрирование при высокой температуре и давлении под никелевым катализатором Ренея. Известно, что осмофильные дрожжеподобные грибы могут продуцировать эритрит, и многие исследования были проведены для получения высокопродуктивных организмов и улучшения методов ферментации для высокоэффективного производства. Trichosporonoides megachiliensis является единственным продуцентом, используемым для промышленного производства эритрита в Японии [10].
     Ферменты осмофильных грибов способны производить итаконовую кислоту, причем в таких количествах, с которыми не может конкурировать ни один химический или биотехнологический способ получения кислоты. 
     Итаконовая кислота и её полимеры (полиитаконовая кислота) имеют большое количество промышленных применений в качестве альтернативы существующим полимерам. Эфиры итаконовой кислоты, такие как метил, этил или винил, могут быть полимеризованы и использованы в качестве пластмасс, адгезивов, эластомеров или покрытий. Резиноподобные смолы, состоящие из сополимеров итаконовой кислоты, обладают превосходной прочностью и гибкостью и имеют огромное применение в качестве водонепроницаемых покрытий с хорошей электроизоляционной способностью. Проведенные исследования показали, что пигментированные дисперсионные смолы, содержащие 0,1-1,5% итаконовой кислоты, обладают улучшенной устойчивостью к абразивному износу [11].
     Щелочные соли гомополимеров полиитаконовой кислоты рекомендуются для использования в различных моющих средствах. Исследователи Гордон и Купланд выяснили, что реакция итаконовой кислоты с аминами приводит к N-замещенному пирролидону, который может быть использован в моющих средствах, шампунях, фармацевтических препаратах, гербицидах и загустителях в смазке. Итаконовая кислота также обладает биологически активными свойствами и, следовательно, её можно использовать в качестве активного ингредиента при получении биологически активных соединений. Проведенные исследования показали, что моно- и диэфиры частично замещенной итаконовой кислоты обладают значительной противовоспалительной или обезболивающей активностью, поэтому было высказано предположение, что итаконовую кислоту также можно использовать в качестве промежуточного вещества в получении некоторых потенциальных ноотропных агентов.
     Полиитаконовая кислота является водорастворимым полимером, который обладает широким спектром применений: является суперабсорбентом, а также противоизвестковым агентом при обработке воды, применяется в качестве ингредиента в моющих средствах и в качестве диспергатора для минералов в покрытиях. Кроме того, полиитаконовая кислота может быть использована при производстве гидрогелей, чувствительных к рН, путем соединения с альгинатами [11].

1.1.4 Галофильные грибы
     Галофильные грибы – вид грибов, способных расти в условиях высокой концентрации соли. Различают слабые, умеренные и экстремальные галофилов, а также галотолерантов. К слабым галофилам относятся грибы, растущие на средах, которые содержат 0,2-0,5 М соли. Умеренные галофилы растут на средах с концентрацией соли 0,5-2,5 М. Экстремальные галофилы предпочитают среду с концентрацией соли 2,5-5,2 М. А к галотолерантам относятся грибы, которые выдерживают присутствие соли в среде концентрацией не более 2,5 М[2].
     Галофильные грибы, как и большинство живых организмов, производят широкий спектр биоактивных молекул, что делает их богатым источником различных видов лекарств. Постоянная потребность в новых антибиотиках из-за устойчивости к ним делает галофильные грибы хорошим выбором природных источников из-за их высокой антибактериальной активности. Проведенные исследования показали, что активность антибиотиков у галофильных/галотолерантных грибов более эффективна при низкой активности воды или повышении концентрации соли. Их изоляты были более активными против Bacillussubtilis, чем Escherichiacoli. В результате исследований, большинство изолятов показали высокую активность против E. coli и умеренную активность против B. subtilis. Aspergillusflavus был признан наиболее эффективным против B. subtilis, но A. рenicillioides  выделялся как самый активный штамм среди изолятов в антибактериальной активности, потому что он показал наивысшую активность против E. coli и также проявлял умеренную активность против B. subtilis, доказав широкий спектр антибактериального потенциала. Сообщалось, что галофильные/галотолерантные бактерии устойчивы к большинству антибиотиков, в этом случае антибактериальные результаты исследований дают возможность для надлежащей экстракции антибиотиков из галофильных грибов, которые могут действовать лучше всего на галофильные/галотолерантные бактерии при высоких концентрациях солей[12].
     Антиоксиданты задерживают процесс окисления путем блокирования окислительных цепных реакций. Ограничение на использование синтетических антиоксидантов из-за их канцерогенности увеличило спрос на натуральные антиоксиданты. Мицелиальные грибы рассматриваются как источник консервирования продуктов питания. Сообщается, что многие Aspergillus производят антиоксиданты. По результатам исследований ученые сообщили об увеличении антиоксидантной способности галофильных. Установлено, что фенольные соединения связаны с продолжительностью жизни грибов благодаря их антиоксидантной защите от стресса факторов окружающей среды. 
     Для различных промышленных применений ферменты должны быть стабильными в экстремальных условиях. Ферменты, полученные из галофильных организмов, проявляют полиэкстремофильные свойства. Как правило, такие галофильные грибы представляют собой галоалкалофилов и термотолерантов, что делает их применимыми в широком диапазоне промышленных процессов, проводимых при экстремальных значениях pH и температуры. Если рассматривать галотолерантные грибы, то. они могут работать при низкой активности воды и высоких физиологических условиях и могут применяться для промышленных процессов, требующих высоких концентраций соли, таких как: применение амилазы для очистки сточных вод, целлюлазы и ксиланазы для производства биотоплива в ионных растворах, липазы для биоремедиации разливов солевого масла и протеазы для производства рыбного соуса[12].

1.1.5 Ацидофильные грибы
     Ацидофильные грибы – вид грибов, способных расти в среде с рН от 0 до 4[2].
     Большой интерес представляет фермент, производимый ацидофильными грибами – ?-маннаназа, способная работать при низких значениях рН: от 1,0 до 2,5. Данный фермент имеет множество применений в промышленных процессах таких, как повышение качества продуктов питания и кормов, а также обесцвечивание целлюлозы хвойных пород в бумажной и целлюлозно-бумажной промышленности[13].
     Наиболее эффективное применение маннаназы соответствует её потенциальному использованию в ферментативном отбеливании целлюлозы хвойной древесины. Извлечение лигнина из древесных волокон является важной ступенью в отбеливании растворяющейся целлюлозы. Предварительная обработка целлюлозы в щелочных условиях гидролизует гемицеллюлозы, ковалентно связанные с лигнином, и, таким образом, облегчает последующее удаление лигнина. Однако существует недостаток в щелочной обработке древесной целлюлозы, поскольку она создает проблему загрязнения окружающей среды. Альтернативное использование маннаназ в равной степени облегчает удаление лигнина при отбеливании целлюлозы и дает результаты, сравнимые со щелочной предварительной обработкой. Следовательно, такая замена дает возможность значительного снизить загрязнения окружающей среды и, соответственно, представляет значительный интерес для целлюлозно-бумажной промышленности. Однако, чтобы осуществить такую замену, ферментативное отбеливание требует, чтобы обработка гемицеллюлазой не ухудшала качество древесной массы, несмотря на её воздействие на целлюлозные волокна. Хвойные породы, из которых получают основную массу целлюлозы, содержат целых 15-20% гемицеллюлозы в форме галактоманнана. Маннаназы, имеющие субстратную специфичность для составляющих галактоманнана, станут отличными кандидатами для использования в ферментативном отбеливании целлюлозы из мягкой древесины. Более того, переработку в бумажную массу лучше всего проводить при повышенных температурах, термофильные маннаназы могут иметь значительные преимущества по сравнению с мезофильными маннаназами с точки зрения их более высокой собственной устойчивости и эффективности каталитического действия при таких повышенных температурах. Маннаназа полезна в процессах отбеливания без хлора для бумажной массы, чтобы увеличить яркость бумаги, тем самым уменьшая или исключая необходимость перекиси водорода в процессе отбеливания.
     Различные препараты маннаназы используются для гидролиза кофейного маннана, что значительно снижает вязкость кофейных экстрактов. Маннан является основным полисахаридным компонентом этих экстрактов и отвечает за их высокую вязкость, что отрицательно влияет на технологию обработки растворимого кофе. Маннаназа также может быть использована для гидролиза галактоманнанов, присутствующих в экстракте жидкого кофе, предпочтительно для предотвращения образования геля во время сублимационной сушки кофе. 
     Применение карбогидраз в моющих средствах хорошо известно. Амилазы и целлюлазы являются наиболее распространенными ферментами. В последнее время щелочные маннаназы, устойчивые к компонентам моющих средств, нашли применение у небольшогопроцента прачечных в качестве бустеров удаления пятен. Маннаназы гидролизуют материалы, содержащие маннан, такие как смолы (галактоманнаны, глюкоманнаны и гуаровая камедь). Эти смолы используются во всем мире в качестве загустителей или стабилизаторов во многих видах бытовых изделий и продуктов питания, включая мороженое, соусы для барбекю, гели для укладки волос, шампуни, кондиционеры и зубную пасту. Пятна, содержащие маннан, обычно трудно удалить, поскольку маннаны склонны адсорбироваться к целлюлозным волокнам и, следовательно, связываться с хлопковыми тканями. Кроме того, маннан также обладает «эффектом клея». Этот эффект склеивания означает, что частицы пятна, удаленные во время цикла стирки или последующей стирки, могут связываться с невидимыми остатками маннана. Другими словами, снова появляется не только много пятен маннана, но он также может быть перенесен на другие чистые ткани во время стирки, что приведет к потускнению цвета. Маннаназы расщепляют ?-1,4-соединения маннанов посредством гидролиза, тем самым разрушая полимер жевательной резинки на более мелкие фрагменты углеводов. Эти меньшие полисахаридные фрагменты, которые более нерастворимы в воде, остаются свободными от ткани и удаляютсяв процессе слива воды из стиральной машинки. Таким образом, маннаназы могут предотвратить повторное осаждение пятен, удаленных во время стирки[14].
     Маннаназы также способствуют здоровью человека, поскольку они разрушают маннаны, которые устойчивы к пищеварительным ферментам млекопитающих в тонком кишечнике, но легко ферментируются в толстой кишке, в частности пробиотическими бактериями, принадлежащими к родам Bifidobacteria и Lactobacillus. Считается, что пребиотические олигосахариды, включая манноолигосахариды, то есть продукты гидролиза маннана, способствуют селективному росту и распространению полезной микрофлоры кишечника человека.
     Галактоманнаны, такие как гуаровая камедь и камедь плодов рожкового дерева широко используются в качестве загустителей, например, в пищевой и печатной пасте для текстильной печати, такой как рисунки на футболках. Маннаназу можно использовать для снижения вязкости остаточных продуктов питания в обрабатывающем оборудовании и тем самым облегчить очистку после обработки. Фермент или ферментный препарат полезен для снижения вязкости печатной пасты, тем самым облегчая вымывание избыточной печатной пасты после текстильной печати.
     Маннаназы могут использоваться в ферментативной экстракции масла кокосовой мякоти. Основными компонентами структурной клеточной стенки кокосовой мякоти являются маннан и галактоманнан. В этом процессе достигается высокий выход масла. В традиционном методе экстракции масла экспеллером, антисанитарная обработка, радикальная переработка копры для добычи масла, рафинирование продукта, присутствие полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), содержащихся в кокосовом масле, не только уменьшает качество побочного продукта подобного белку, но также делает продукт восприимчивым к загрязнению афлатоксином и окислительной прогорклости. Ферментативный процесс экстракции масла не только устраняет такие проблемы, но также улучшает вкусо-ароматические качества продуктов. Кроме того, улучшение качества кокосового масла сводит к минимуму потребность в его рафинировании, поскольку качество масла уже сопоставимо с качеством полуочищенногомасла. Этот ферментативный процесс дает три ценных продукта: кокосовое масло, жидкость, содержащую ароматические белки, которые могут быть использованы в качестве основы для напитков и изолята белка кокосового ореха[14].
     

1.2. Экстремофилия грибов
     Давно известно, что некоторые грибы способны существовать при высоких или низких значениях температуры, кислых или щелочных значениях рН, больших давлениях, в условиях интенсивного облучения, а также при высоких концентрациях различных растворенных веществ. Ранее такие грибы изучались либо как «биологические курьёзы», либо как агенты, вызывающие порчу пищевых продуктов. Спустя некоторое время интерес к таким грибам возрос, когда стало очевидным, что они могут служить важными объектами для изучения самых глубоких аспектов клеточной и молекулярной биологии; помимо этого, они расширяют наши представления о многообразии используемых живыми существами физиологических и биохимических механизмов, а также помогают понять особенности жизни в различных экстремальных условиях [2].
1.2.1 Термофилия
     Предложено много гипотез для объяснения способности грибов расти при высоких температурах, но среди них можно выделить несколько основных в зависимости от того, какое явление или свойство считают исходным. Прежде всего это гипотезы, основанные на признании доминирующей роли более быстрого ресинтеза у термофилов существенных метаболитов клетки. Есть гипотезы, которые трактуют термофилию, как свойство организма, в основе которого лежит способность липидов клеток в зависимости от температуры среды находиться в определенном физико-химическом состоянии.
     В настоящее время в литературе широко исследуется вопрос о преобладающей роли в явлениях термофилии термостабильности биологически важных макромолекул, таких, как нуклеиновые кислоты и белки [15].
     В. Я. Александров выдвинул интересную гипотезу о механизмах адаптации организмов к повышенной температуре, заключающуюся в том, что для нормального функционирования организмов при высокой температуре их белки, нуклеиновые кислоты и липиды должны обладать определенным уровнем конформационной гибкости, т.е. они должны находиться в «семистабильном» или «семилабильном» состоянии.
     Способность термофилов развиваться при высокой температуре обусловлена в первую очередь специфическими особенностями их клеток: физиолого-биохимическими и, в меньшей степени, морфологическими, ибо жизнь при высоких температурах накладывает целый ряд ограничений и особенностей в функционировании внутриклеточных компонентов как структурного, так и физико-химического порядка.
     Установлено, что генетические структуры термофилов, в частности ДНК, более резистентны к действию высокой температуры, чем ДНК мезофилов. Это показано при исследовании целого ряда их свойств: гиперхромного эффекта, нуклеотидного состава, кривых температур плавления, увеличения частоты встречаемости и плотности ГЦ-пар и т.д.
     Белоксинтезирующие системы термофилов (иРНК, тРНК и тРНК-лигаза, рибосомальная РНК и рибосомы) в силу специфического, отличного от мезофилов химического строения (увеличение степени спирализации, увеличение температуры плавления), более стабильны при высоких температурах.
     Ферменты, синтезируемые термофильными микроорганизмами (как внеклеточные, так и внутриклеточные), устойчивы к действию такого денатурирующего фактора, как повышенная температура. Эта термоустойчивость связана с различными конформационным состоянием и свойствами их белков[15].
     Клетки мембран термофилов характеризуются значительными отличиями в составе липидно-белкового комплекса: липиды у изученных видов термофилов состоят из более насыщенных жирных кислот с разветвленной углеродной цепочкой. Эти изменения оказывают значительное влияние на поддержание ригидности клетки и нативной структуры мембран, что обеспечивает нормальную их функцию при высокой температуре. При этом процессы образования определенных типов жирных кислот в зависимости от условий культивирования организма очень тонко регулируются ферментными системами сатураз и десатураз.
     Таким образом, полученные ранее экспериментальные данные убедительно показывают, что между теплолюбивостью организма и свойствами важнейших компонентов клетки в процессе эволюции выработался удивительный параллелизм [15].
     Чем выше максимальная температура роста термофильного организма, тем более устойчивы к повреждающим факторам, в частности к высокой температуре, клеточные компоненты, ответственные за основные за основные процессы жизнедеятельности организма. Конечно, имеется целый ряд других факторов, играющих определенную роль для существования организмов при высоких температурах (наличие определенных ионов, степень гидратации белковых молекул и т.д.), но они не настолько значительны, как генетические, белоксинтезирующие, мембранно-липидные системы клетки.
     На сегодняшний день известно четыре основные гипотезы термофилии: биохимическая, динамическая, макромолекулярная и ультраструктурная [16, 17].
     Биохимическая гипотеза построена на предположении о том, что способность термофильных грибов расти при таких высоких температурах, при которых гибнут большинство представителей данного царства, может быть определенаособой термостабильностью их мембран. Чтобы мембрана функционировала правильно необходимо, чтобы она находилась в промежуточном состоянии, пограничном между кристаллическим и жидким. Только при таком состоянии мембраны,её проницаемость достаточна, чтобы управлять селективным транспортом молекул из клетки и в неё. Учитывая разнообразие функций, которые выполняет мембрана в клетке, вероятно, что именно липидная составляющая этих организмов играет важную роль в термоустойчивости. Именно термофильные грибы обладаютшироким разнообразием липидного состава. Нейтральные липиды, как правило, составляют от 35 до 88% от общих липидов, большая часть из них приходится на стерины и их эфиры, на основании чего существует предположение об особенной роли стеринов в термостабильности мембран. Полярные липиды составляют от 11 до 67% и представляют фосфолипиды (в основном, фосфатидилхолины (ФХ) и фосфатидилэтаноламины (ФЭ)), кардиолипины (КЛ) и фосфатидные кислоты (ФК). На том основании, что значительное количество фосфатидных кислот было обнаружено в термофильных грибах H. grisea var. thermoidea и Pythium ultimum, было выдвинуто предположение и об особой роли фосфатидных кислот в термофилии [18]. Основными жирными кислотами в составе липидов у грибов являются пальмитиновая (C16:0), стеариновая (C18:0), олеиновая (C18:1n9c), линолевая (C18:2n6c) и ?-линоленовая (C18:3n3). При сопоставлении с мезофилами, жирные кислоты термофилов более насыщенные, аполярные липиды у термофилов, как правило, менее насыщенные, чем нейтральные [17]. Соотношение насыщенных и ненасыщенных жирных кислот играет важнейшую роль в поддержании требуемой проницаемости и текучести мембран при изменениях температуры. Многие организмы умеют изменять жирнокислотный состав мембранных фосфолипидов, чтобы поддерживать постоянство текучести мембран, необходимой для оптимального функционирования, так как с повышением температуры увеличивается доля насыщенных ЖК в фосфолипидах, а с понижением – доля ненасыщенных жирных кислот. Вследствие ряда исследований были получены данные о том, что термофилы синтезируют более насыщенные липиды и в большем количестве, чеммезофилы и психрофилы [19]. Если выращивание термофильных грибов осуществлялось при разных температурах (в пределах оптимального диапазона), то более высокие температурысовпадали с большей степенью насыщенности ЖК в составе липидов. Эти данные были объяснены меньшей активностью десатураз, вследствие дефицита растворенного кислорода при повышенной температуре.
     Так, согласно данной гипотезе, главную роль в термостабильности играет липидный состав мембран, причём значительный интерес представляет изучение роли стеринов и фосфолипидов в защите мембран при высоких температурах.
     Динамическая гипотеза основывается на предположении о том, что термофилия возможна из-за особо активного обмена важнейших метаболитов, в результате которого термолабильные соединения (белки и/или ферменты) образуются со скоростью равной, или даже превышающей скорость их термического разложения. Таким образом, организм поддерживает постоянный избыток необходимых метаболитов, что делает возможным его существование при температурах, которые обычно приводят к гибели. Главную роль данной гипотезыиграет высокоскоростное обновление белков [20]. Динамическая гипотеза не нашла надежного экспериментального подтверждения. Если предположить, что термостабильные компоненты не требуются для существования организма, то нельзя пренебрегать тем фактом, что сама метаболическая система должна состоять из термостабильных компонентов. Последующие исследования показали, что более или менее быстрое обновление белков определенно имеется, однако скорость его различна для разных термофилов и даже в отдельных случаях оказывается ниже, чем у мезофильных грибов. Тем не менее, вероятно, что специфические ферменты могут иметь высокие скорости обновления [21].
     Макромолекулярная гипотеза предполагает, что термофилы могут синтезировать жизненно необходимые макромолекулы, такие как ферменты и иные белки, которые обладаютчрезвычайно высокой термостабильностью. По мере повышения температуры, эти соединения сохраняют свои свойства, что делает возможным в дальнейшем расти и развиваться организму. В пользу гипотезы выступает тот факт, что и.......................