Воздействие ионов и наночастиц железа на пробиотические штаммы B. subtilis 534, B. cereus 5832, B. subtilis 7048 и B. licheniformis 7038

УДК 579:615

ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ИОНОВ И НАНОЧАСТИЦ ЖЕЛЕЗА НА РОСТ БАКТЕРИЙ РОДА BACILLUS, ВХОДЯЩИХ В СОСТАВ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ 

Т.А. КЛИМОВА, Е.С. БАРЫШЕВА

Ключевые слова: ионы железа, наночастицы железа, пробиотические препараты

Аннотация. 

Цель работы – изучить воздействие ионов и наночастиц железа на пробиотические штаммы B. subtilis 534, B. cereus 5832, B. subtilis 7048 и B. licheniformis 7038.

Материалы исследования: пробиотические штаммы, входящие в состав препаратов («Споробактерин», «Бактисубтил», «Ветом-2»), ионы и наночастицы железа. Применяемый метод – фотоэлектроколориметрический метод. Для определения оптической плотности придерживались стандартной методики работы на приборе ФЭК-КФК-2 [1].

Полученные результаты позволяют сделать вывод, что ионы железа оказывают ингибирующее действие на рост пробиотических штаммов B. subtilis 534, B. cereus 5832, B. subtilis 7048 и B. licheniformis 7038. Было установлено, что присутствие ионов и наночастиц железа оказывает стимулирующее действие на рост B. cereus 5832 и B. subtilis 534.

Актуальность исследования. Металлы обладают способностью к биоаккумуляции [2]. Микроорганизмы способны извлекать и концентрировать металлы. Данной способностью обладают бактерии рода Bacillus, которые входят в состав пробиотических препаратов [3]. В связи с этим изучение способности бактерий рода Bacillus, входящих в состав пробиотиков, к накоплению тяжелых металлов является важным с целью оценить эффективность применения пробиотиков на их основе при отравлении тяжелыми металлами. В дальнейшем это может послужить основой для совершенствования пробиотических препаратов для лечения и профилактики кишечных инфекций при одновременном удалении из организма токсичных веществ, а также основой для доставки химических элементов в организм человека. Существуют исследования, по оценке антитоксической эффективности пробиотических препаратов при интоксикации цинком [4]. А также получены данные, которые свидетельствуют о высокой сорбции свинца, цинка и железа пробиотическими штаммами [5].

Мы проводим исследования по способности пробиотических штаммов аккумулировать металлы, и нами проведены серии экспериментов в условиях in vivo с целью доставки элементов в организм лабораторных животных с помощью пробиотических штаммов [6]. Но ряд литературных данных указывает на то, пробиотические препараты хорошо аккумулируют наночастицы металлов [7]. Поэтому важным этапом стало определение воздействия ионов и наночастиц металлов на пробиотические штаммы.  

Исходя из литературных данных, известно, что процесс накопления металлов микроорганизмами осуществляется в стационарной фазе роста. Процесс накопления возможно связан с тем, что в данной фазе наблюдается истощение субстрата и накопление токсичных продуктов, что вынуждают бактерии к поиску других источников энергии и детоксикации среды обитания [8]. 

Цель и задачи исследования. Вышеизложенное определило дальнейшее направление нашей работы: изучить воздействие ионов и наночастиц железа на пробиотические штаммы B. subtilis 534, B. cereus 5832, B. subtilis 7048 и B. licheniformis 7038. Для реализации цели перед нами были поставлены и решены следующие задачи:

1) определение фаз роста, с целью выявления оптимального времени роста на периодической культуре;

2) оценка влияния ионов и наночастиц железа на динамику роста исследуемых микроорганизмов. 

Материалы и методы исследования. Были выбраны для исследования пробиотические препараты: «Споробактерин жидкий», «Бактисубтил», «Ветом-2», ионы железа (сульфат железа) и наночастицы железа I. 

B. subtilis 534 – основа препаратв «Споробактерин жидкий». Производитель препарата – ООО «Бакорен», г. Оренбург (Россия).

B. cereus 5832 – основа препарата «Бактисубтил». Производитель препарата – «Marion Merrel», Франция.

Препарат «Ветом-2» – является бипрепаратом, содержит иммобилизованную, высушенную споровую биомассу бактерий B. subtilis ВКПМ В 7048 и B. licheniformis ВКПМ В 7038. Производитель препарата – ООО НП «Исследовательский центр», г. Новосибирск (Россия).

Сульфат железа (II) – неорганическое бинарное соединение. Нелетуч, не имеет запаха. Используемая в наших исследованиях соль относится к категории чистой для анализа, производится ОАО «Фармстандарт», Уфа.

Наночастицы железа I составляют 90 нм. По составу - железо не менее 99,8 процентов массы, остальное – сорбированные газы – CH4, CO2, Ar, N2. 

Определение оптимального времени роста на периодической культуре осуществлялось путем культивирования штаммов B. subtilis 534, B. cereus 5832, B. subtilis 7048 и B. licheniformis 7038 в периодической культуре в жидкой питательной среде и измерении оптической плотности на приборе ФЭК-КФК-2 каждые три часа, начиная с нулевого часа. При измерении оптической плотности были получены три приблизительно одинаковые значения оптической плотности, что свидетельствует о наступлении стационарной фазы роста [8]. 

Полученные данные подвергали статистической обработке с использованием t-критерия Стьюдента [9].



Результаты исследования и выводы.

По полученным результатам для каждого штамма были выстроены кривые роста (рисунок 1).







Рисунок 1 – Рост бактерий рода Bacillus в периодической культуре

Исходя из полученного графика следует, что лаг-фаза у исследуемых штаммов длится примерно 3 часа. Продолжительность экспоненциальной фазы роста для B. subtilis 534, B. subtilis 7048 составляет 21 час, для B. licheniformis 7038 – 18 часов, а для B. cereus 5832 – 24 часа культивирования. Наступление стационарной фазы для B. subtilis 534, B. subtilis 7048 и B. licheniformis 7038 наблюдается через 24 часа, а для B. cereus 5832 – 27 часов культивирования.

Изучение влияния ионов и наночастиц на динамику роста бактерий рода Bacillus проводилось аналогично, для этого в среду культивирования вносилась рабочая концентрация исследуемого вещества и осуществлялось культивирование до наступления стационарной фазы роста. 

В случае с B. subtilis 534 (рисунок 2) при воздействии ионов железа лаг-фаза не изменилась, однако произошло увеличение продолжительности фазы экспоненциального роста на 6 часов (27 часов), в связи, с чем выход на стационарную фазу был зарегистрирован лишь к 30 часам культивирования.

При воздействии наночастиц железа также лаг-фаза составляет примерно 3 часа, однако продолжительность экспоненциальной фазы по сравнению с ионами железа увеличилась на 3 часа и составила 24 часа, следовательно, стационарная фаза наступила через 27 часов культивирования.

При воздействии ионов железа на рост B. cereus 5832 (рисунок 3) лаг-фаза не менялась, но увеличилась продолжительность экспоненциальной фазы, равная 27 часам, следовательно, и стационарная фаза наступила через 30 часов культивирования. По сравнению с ионами железа, при воздействии наночастиц железа экспоненциальная фаза составляет 30 часов, а стационарная фаза наступает через 33 часа.







Рисунок 2 – Влияние ионов и наночастиц железа на динамику роста B. subtilis 534





Рисунок 3 – Влияние ионов и наночастиц железа на динамику роста B. cereus 5832

Ситуация с двумя другими штаммами несколько иная. У B. subtilis 7048 и B. licheniformis 7038 (рисунок 4 и рисунок 5) при воздействии ионов железа неизменной остается лаг-фаза, равная 3 часам. Увеличение экспоненциальной и стационарной фазы роста на 3 часа (24 и 27 часов).

Наночастицы железа не оказали существенного воздействия на фазы роста, продолжительность всех фаз роста не изменилась. 





Рисунок 4 – Влияние ионов и наночастиц железа на динамику роста

B. subtilis 7048



Рисунок 5 – Влияние ионов и наночастиц железа на динамику роста

B. licheniformis 7038

По результатам исследований следует отметить, что у всех исследуемых бактерий, как при воздействии ионов, так и наночастиц железа на протяжении всех фаз роста наблюдался значительный прирост биомассы клеток.

Расчет t-критерия Стьюдента показал, что изменения значений плотности для всех исследуемых микроорганизмов в присутствии ионов и наночастиц железа являются достоверными для всех фаз роста.

Как известно, железо входит в группу биогенных элементов, и следовательно в небольших концентрациях не должно оказывать сильного губительного эффекта на микроорганизмы, но получается наоборот. У двух из четырех штаммов получились одинаковые результаты, и они свидетельствуют о том, что ионы и наночастицы железа увеличивают наступление стационарной фазы примерно на 6 часов, экспоненциальная в данном случае составляет 27 или 30 часов. 

В некоторых литературных данных известно, что наночастицы железа оказывают ингибирующее действие на E. coli. С ионами железа наблюдается такая же картина, ионы железа оказывают ингибирующее действие на рост бактерий, было на также выявлено ингибирующее действие на рост E. coli, выступающей в качестве грамотрицательных бактерий [71, 72]. Таким образом, в результате эксперимента было установлено, что присутствие ионов и наночастиц железа оказывает стимулирующее действие на рост B. cereus 5832 и B. subtilis 534.

















Климова Татьяна Андреевна – аспирант, ФГБОУ Оренбургский Государственный Университет.



Барышева Елена Сергеевна – заведующий кафедрой биохимии и микробиологии ФГБОУ Оренбургского Государственного Университета, доктор медицинских наук, доцент.



Контактная информация: проспект Победы 13, г. Оренбург, РФ, 460026. Тел. 89878494166. E-mail: ga-lche-nok@mail.ru



Литература. 1. Буянова Е.С., Емельянова Ю.В. Руководство к лабораторному практикуму дисциплины «Оптические методы анализа объектов окружающей среды и пищевых продуктов» // Уральский государственный университет. 2008. С. 3-6. 2. Холопов Ю.А. Тяжелые металлы как фактор экологической опасности: Методические указания к самостоятельной работе по экологии для студентов // изд-во СамГАПС. – Самара, 2003. – 42 с. 3. Чубуков, В.Ф. Микробы запасают металлы // Химия и Жизнь. 1982. № 11. С. 53-55. 4. Сизенцов А.Н. Эффективность применения пробиотических препаратов при интоксикации цинком // Вестник Ветеринарии: изд-во Энтропос. – Ставрополь, 2013. № 2. С. 34-36. 5. Сизенцов А.Н., Пешков С.А. Биоаккумуляция тяжелых металлов микроорганизмами, входящими в состав пробиотических препаратов в условиях in vitro // Вестник Оренбургского Государственного Университета: изд-во Оренбургский Государственный Университет. – Оренбург, 2013. № 10. С. 142-144. 6. Эффективность применения пробиотических препаратов на основе бактерий рода Bacillus в системе доставки железа / А.Н. Сизенцов [и др.] // Вестник восстановительной медицины: изд-во Объединение специалистов восстановительной медицины. – Москва, 2014. № 2. С. 66-75. 7. Дорошенко М.С., Аркуш Ю.В. Модифицированные пробиотики в профилактике и лечении желудочно-кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных и птицы // III Международная научная интернет-конференция «Инновации и традиции в современной научной мысли», 2012. 8. Исследование влияния микроэлементов и макроэлементов на организм человека и биоаккумуляции некоторых ионов тяжелых металлов микроорганизмами / Ю.Е. Никитина [и др.] // VIII Международная студенческая электронная научная конференция «Студенческий научный форум – 2016», 2016. С. 27-28.



Klimova Tatyana Andreevna - post-graduate student, FGBOU Orenburg State University.



Barysheva Elena - Head of the Department of Biochemistry and Microbiology FGBOU Orenburg State University, Doctor of Medical Sciences, Associate Professor.



Contact Information: Victory Avenue 13, Orenburg, Russia, 460026. Tel. 89878494166. E-mail: ga-lche-nok@mail.ru



Literature. 









Ответственная за контакты с журналом: Климова Татьяна Андреевна, E.mail: ga-lche-nok@mail.ru, тел. +79878494166........................