Разработка способа генотипирования штаммов сенной палочки с использованием ПЦР

 МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования 
Вятский государственный университет
Институт биологии и биотехнологии
Кафедра микробиологии


Допускаю к защите
    Заведующий кафедрой микробиологии
д.м.н., профессор
________________________________  Дармов И.В.

 «      »  июня  2018г.


РАЗРАБОТКА СПОСОБА ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ШТАММОВ 
СЕННОЙ ПАЛОЧКИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПЦР
ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА МАГИСТРА

Разработал  
студент гр. БМ-2101-01-00

________________
Жилин Д.С.
«       » июня 2018 г.
Руководитель 
д.х.н., доцент

________________
Лундовских И.А.
«      » июня 2018 г.
Нормоконтролер 
д.м.н., профессор

_________________
Погорельский И.П.
«      » июня 2018 г.





Киров 
2018
    Содержание
Введение……………………………………………………………………...

1 Обзор научно-технической и патентной литературы…………………....

1.1 Общая характеристика бактерий группы Bacillus subtilis  …………

1.2 Физиология и биохимические характеристики………..………….…

1.3 Спорюляция и прорастание спор…………….………….....................

1.4 Бактерицидная и фунгицидная активность ………………………….

1.5 Таксономия ………………………….....................................................

2 Роль сенной палочки в природе и хозяйственной деятельности человека ……………………….................................................................…..

2.1 Экология и распространение бактерий группы сенной палочки 

2.2 Использование в сельском хозяйстве ……….................................…

2.3 Использование в медицине ……………………...…..................…….

2.4 Бактерии группы сенной палочки как объект промышленного культивирования ………………………………………..…..............…….

2.5 Использование B.subtilis в генной инженерии ………………...……

3 Культивирование бактерий группы сенной палочки ……………...……

3.1 Основные среды для культивирования ……………………..…….....

3.2 Способы длительного хранения культур …………………….......….

4 Идентификация бактерий группы сенной палочки …………..............…

4.1 Традиционные методы идентификации бацилл ……………………

4.2 Молекулярно-генетические методы идентификации бацилл …...…

5 Полимеразная цепная реакция…………………………………………….

  5.1 Проведение ПЦР………………………………………………………

  5.2 Компоненты, необходимые для проведения ПЦР…………………..

  5.3 Праймеры………………………………………………………………

  5.4 Ход реакции……………………………………………………………

  5.5 Cтадии постановки ПЦР……………………………………………...

  5.6 Проблема контаминации……………………………………………...

  5.7 Требования к проведению ПЦР………………………………………

  5.8 Преимущества и недостатки метода ПЦР…………………………...

6 Выбор направлений исследований……………………………….…...…..

7 Материалы и оборудование………………………………………..…..….

7.1 Материалы ……………………………………………………..….…...

7.2 Оборудование …………………………….…………………………....

7.3 Приготовление питательных сред и растворов………………..….…

8 Теоретические и экспериментальные исследования …………................

8.1 Выделение исходных культур микроорганизмов ……………...…....

8.2 Определение культурально-морфологических свойств ……..……..

8.3 Выделение ДНК бацилл ……………….…………………………..….

8.4 ПЦР-анализ образцов ДНК ………………………………………...…

9 Обсуждение результатов исследований и выводы ………………..….....

Список сокращений и условных обозначений………………………..…..

Список определений и терминов………………………………………..…..

Список литературы………………………………………………………..…

Приложение 1–Задание на выполнение выпускной квалификационной работы…………………………………………………………………..…….

Приложение 2–Авторская справка…………………………………..……..

Приложение 3–Доклад ………………………………………………..…….

Приложение 4–Презентация…………………………………………..…….

Приложение 5–Отзыв научного руководителя…………………………….

Приложение 6–Рецензия………………………………………..…………...


Введение
      Бактерии рода Bacillus привлекают внимание ученых с давних времен. Этот интерес вызван и экономическими, а также научными причинами [1]. Одним из важнейших представителей этого рода является Bacillus subtilis – грамположительный микроорганизм, продуцент различных протеаз [2].
      Штаммы микроорганизмов, относящиеся к роду Bacillus, используются в качестве пробиотиков для коррекции дисбиотических нарушений желудочно-кишечного тракта и входят в состав большого количества препаратов для человека и сельскохозяйственных животных. 
      Активность бацилл проявляется в отношении большого диапазона патогенных и условно патогенных микроорганизмов. Благодаря синтезу разнообразных ферментов и других веществ они регулируют и стимулируют пищеварение, оказывают противоаллергенное и антитоксическое действие. При применении бацилл существенно повышается неспецифическая устойчивость макроорганизма. Эти микроорганизмы технологичны в производстве, стабильны при хранении и экологически безопасны [3].
      Наиболее ценными пробиотическими свойствами обладают бактерии группы Bacillus subtilis. В данную группу входят следующие виды: B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. vallismortis, B. atrophaeus, B. sonorensis и B. mojavensis. Эти виды выделяются сходством на фенотипическом уровне [4].
    В комплекс B. subtilis входят виды, чрезвычайно близкие по фенотипическим и филогенетическим признакам, и характеризующиеся многообразием. Поэтому традиционные методы идентификации, основанные на морфологических и биохимических признаках, антагонистической активности , как правило, недостаточно точны. 
     Решить эту задачу позволяют молекулярно генетические методы такие, как ПЦР-анализ, обладающий рядом достоинств, к которым относятся относительная простота, дешевизна, высокая разрешающая способность и чувствительность.
     В группу микроорганизмов, родственных B.subtilis, входят виды бактерий, имеющих высокую степень гомологии ДНК. Высокая гомология нуклеотидных последовательностей большинства генов этих микробов затрудняет их типирование с помощью ПЦР, поэтому необходимо было провести работу по исследованию уникальных генетических детерминант B.subtilis. 
     Целью настоящей работы является разработка методики типирования B. subtilis методом ПЦР с помощью праймеров «нацеленных» на уникальные гены этого микроба. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
     1. Провести анализ данных  научной и патентной литературы по уникальным генетическим детерминатам B.subtilis. 
     2. В базе данных секвенированных нуклеотидных последовательностей сенной палочки найти сиквенсы её уникальных генов.
     3. Провести первичный анализ этих нуклеотидных последовательностей и отобрать перспективные для видового типирования B.subtilis.
     4. С использованием компьютерной программы Blast проверить уникальность выбранных генетических детерминантов.
     5. С помощью компьютерной программы Oligo 6 выбрать праймеры для видового типирования B.subtilis.
     6. С использованием компьютерной программы Blast проверить уникальность выбранных праймеров.
     7. Заказать синтез праймеров. После синтеза осуществить входной контроль (определить концентрацию).
     8. Из препаратов «Бактофит», «Фитоспорин-М» и «Ветом 4», «Гамаир», «Алирин» «Бактисубтил», «Битоксибациллин», «Эндобактерин» выделить штаммы B.subtilis, B.licheninformis, B.cereus, B. pulvifaciens и B.thuringiensis.
     9. Получить биомассу B.subtilis, B.licheninformis, B.cereus, B. pulvifaciens, B.thuringiensis и выделить очищенную ДНК.
     10. С использованием ДНК провести экспериментальную проверку уникальности выбранных праймеров. 
     11. Отработать оптимальные режимы проведения ПЦР с целью типирования штаммов группы B.subtilis.
     
     
1 Обзор научно-технической и патентной литературы
     1.1 Общая характеристика бактерий группы Bacillus subtilis.
     Бактерии рода Bacillus – это аэробные, образующие эндоспоры, грамположительные палочки. Род был «создан» в 1872 г. Фердинаном Коном. Типовым видом рода до сих пор является Bacillus subtilis.
     Это прямые палочки до 10 мкм, имеющие закругленные или обрубленные концы. Клетки штаммов Bacillus бывают одиночными или соединёнными в цепочки, достигающие значительной длины. Часто наблюдаются нити, но как правило, они состоят из цепей клеток, поперечные стенки которых трудно увидеть в обычный микроскоп. В то время как длина клеток у Bacillus может меняться в зависимости от условий культивирования, ширина клеток имеет более постоянный характер. Клетки подвижны за счет наличия у них перитрихиальных жгутиков.
     Форма колоний Bacillus subtilis могут сильно изменяться. Даже в чистой культуре колонии различаются по прозрачности и иные могут быть совсем непрозрачными. Часто это зависит от различий в степени споруляции внутри колоний. Культуральные особенности видов, выросших на разных средах, различны. На твердых питательных средах образуются колонии от 
     1-2 до 5 мм и более в диаметре: зернистые, пленчатые, гладкие, складчато-морщинистые, сухие с характерной структурой края. Культуры группы сенной палочки характеризуются образованием плотных, вросших в агар, сухих морщинистых колоний. При развитии на жидких средах обнаруживается тенденция к образованию поверхностной пленки.
     При росте на питательном агаре, клетки Bacillus образуют эндоспоры. Они могут быть овальными, цилиндрическими или сферическими. Клетки, содержащие споры и их свойства является еще одним важным и характерным признаком видов Bacillus. Форма и величина спор — константные признаки — имеют важнейшее значение при групповом и видовом разграничении спорообразующих бактерий [1].
     1.2 Физиологические и биохимические характеристики
     Аэробные спорообразующие бактерии относятся к гетеротрофам, то есть к микроорганизмам, которые нуждаются в готовых органических соединениях. Для большинства спорообразующих бактерий лучшими источниками азотного питания являются белки и аминокислоты сложных органических соединений. На средах с минеральными соединениями азота большая часть этих бактерий развивается слабо.
     Хемогетеротрофы, метаболизм строго дыхательный или дыхательный и бродильный одновременно.
     Бактерии группы сенной палочки обладают выраженной протеолитической и амилолитической активностью. В данное время культуры этих видов спороносных бактерий широко используются во многих странах для промышленной выработки амилазы и различных протеаз [6].
     Основным полимером в составе клеточных стенок большинства бактерий является пептидогликан муреин.
     Состав ДНК у видов рода Bacillus варьирует в пределах 32-69 мол. % G+C, что свидетельствует о генетической гетерогенности этого вида [1].
     1.3 Споруляция и прорастание спор
     Недостаток питательных соединений в среде включает у бацилл ряд реакций, цель которых либо предотвратить голодание, либо приготовить клетку к длительному периоду, в течение которого питательные вещества будут недоступны [1]. Споры образуются при  неблагоприятных условиях существования бактерий (дефицит питательных веществ, высушивание и др.). Внутри бактериальной  клетки образуется одна спора (эндоспора). Образование спор способствует сохранению вида и способом  размножения, как у грибов, не является. Спорообразующие бактерии рода Bacillus имеют споры, не превышающие диаметр клетки [51].
     Споруляция разделяется на стадии, различия в которых основаны на цитологических изменениях, происходящих в процессе образования споры Подготовительная стадия споруляции видна в конце логарифмической фазы роста. В лабораторных условиях процесс споруляции обычно занимает около 6-8 часов [1].
     Поверхность наружной оболочки спор разнообразна у аэробных бактерий: либо с выростами (выступами и почками), либо гладкая. Оболочка составляет значительную часть споры. Большую часть ее компонентов составляют белки (60-90%) и липиды. 
     Под оболочкой располагается кора споры, состоящая в большей степени из муреина, являющийся нерастворимым структурным материалом коры. В течение многих лет покоящаяся спора рассматривалась как почти инертное тело, обладающее несколькими ферментами или вовсе лишенное их. Некоторых ферментных систем, имеющихся в вегетативной клетке, например цитохромов и ферментов цикла трикарбоновых кислот, ничтожно мало в споре. Это указывает на иной путь осуществления в спорах анаэробного энергетического метаболизма, нежели в клетках. Аналогичные ферменты спор и вегетативных клеток в спорах более термоустойчивы.
     Споры аэробных бактерий обладают различной термоустойчивостью. Это обусловлено как видовыми особенностями, так и условиями их образования. Установлено, что споры, которые образуются при высокой температуре, а также полученные на средах с высоким содержанием кальция, парааминобензойной кислоты и некоторых жирных кислот, более жароустойчивы. Споры более устойчивы, чем вегетативные клетки, от которых они образовались, к воздействию проникающей радиации, разрежения, ультразвука, гидростатического давления, замораживания и др. Устойчивость спор к кислотам и щелочам во многом зависит от такого фактора, как принадлежность к различным видам бактерий. Споры некоторых культур бактерий остаются жизнеспособными даже при кипячении в концентрированной соляной кислоте в течение 30 мин. При этом сопротивляемость спор во много раз повышается при их обезвоживании.
     Устойчивость спор к спиртам и другим органическим растворителям намного выше, чем у вегетативных клеток. Споры менее устойчивы к действию алкилирующих агентов. При воздействии ряда определенных ферментов удается достигнуть растворения спор.
     Механизм устойчивости спор к действию различных физико-химических факторов полностью еще не выяснен. Температурная устойчивость спор объясняется наличием кальция, дипиколиновой кислоты и в некоторой степени диаминопимелиновой кислоты. Эти вещества являются определяющими и в резистентности спор к действию радиации. Полагают, что споры содержат комплекс особых веществ, подобных хелатным соединениям, которые предохраняют жизненно важные структурные элементы от губительного воздействия физико-химических факторов [6].
     Свободные споры для прорастания должны быть активированы. Во время активации происходит потеря одного из белком оболочки, дипиколиновой кислоты, цинка, а также происходит увеличение текучести мембран. Прорастанием называется переход споры из покоящегося состояния и формирование вегетативной клетки. В качестве веществ, инициирующих прорастание эндоспор, наиболее эффективны считаются углеводы, некоторые аминокислоты и неорганические ионы. При прорастании у спор наблюдается потеря устойчивости к высоким температурам, химическим веществам и излучению. Начинается он с интенсивного поглощения спорой воды и набухания. На начальном этапе прорастания происходит активация ферментов, резко возрастает дыхание, т.е. мобилизуется энергия, происходят изменения в химическом составе (из спор удаляется  дипиколиновая кислота, идет активный синтез белка и РНК, но репликация ДНК начинается не сразу, а через 1,5 часа после начала прорастания споры. Прежде всего происходят процессы репарации повреждений ДНК, произошедших в период покоя споры. За время прорастания споры теряют до одной трети первоначальной массы. Последующие этапы состоят в разрушении  кортекса, разрыве споровых покровов, выходе сформировавшейся к этому времени структуры, называемой ростовой трубочкой, достраивании ею клеточной стенки и последующем делении сформированной вегетативной клетки [48].
     1.4 Бактерицидная и фунгицидная активность
     B. subtilis - первый микроорганизм, у которого обнаружена способность лизировать не только собственные клетки, но и клетки других бактерий и грибов [7].
     В настоящее время в сельском хозяйстве все более популярными становятся биопестициды на основе бактерии Bacillus subtilis. Клетки сенной палочки обладают активностью в отношении ряда фитопатогенных грибов, в том числе Rhizoctonia solani и Botrytis cinerea, однако природа этой активности не вполне ясна [2]. Также сенная палочка активна в отношении фитопатогенных бактерий, в том числе Pseudomonas corrugata, Erwinia carotovora, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Xantomonas campestris pv. vesicatora и грибов Fusarium, Verticullium, Ascochyta и др. [8].
     Почвенные бактерии образуют различные низкомолекулярные соединения, в том числе потенциальные биопестициды, подавляющие развитие грибов, бактерий или насекомых. Эти вещества рассматриваются как вторичные метаболиты, накапливаемые в конце фазы роста. 
     Так например, из штамма-продуцента биопрепарата для защиты растений от болезней разной этиологии Bacillus subtilis М-22 выделен метаболитный комплекс Гамаир, обладающий широким спектром действия в отношении фитоптогенных бактерий. Его широкий спектр антагонистической активности обусловлен сложным компонентным составом активного комплекса, включающим соединения различного состава: близкий к бациллину полипептид, а также различные гексаеновые антибиотики [8].
     Также проводился анализ антифунгальной активности сенной палочки на примере штамма B. subtilis Ч-13. Он показал, что наибольшую ингибирующую активность проявляет живая бактериальная культура. Антифунгальная активность культуральной жидкости после отделения бактериальных клеток и суммарной фракции экстрагированных метаболитов была соответственно в 1,9 и 2,5 раза ниже, чем у живой культуры. Следовательно, значительный вклад в антагонистическую активность вносят экзоферменты, продуцируемые живыми бактериями B. subtilis и/или их антифунгальные метаболиты [9].
     1.5 Таксономия
     Понадобилось много лет и усилий ученых, чтобы определить и классифицировать бактерии рода Bacillus. Только две характеристики – аэробный рост и формирование эндоспор в результате объединили вместе много бактерий различной физиологии и занимающих различные среды обитания. Эта неоднородность в физиологии, экологии и генетике делает трудной классификацию рода [2].
     Согласно таксономической схеме прокариот, род Bacillus принадлежит отделу Firmicutes, классу Bacilli, порядку Bacillales, семейству Bacillaceae. Кроме порядка Bacillaceae, в этот класс входит еще порядок Lactobacillales. 
     До 1991 года в данный род входило множество весьма несхожих видов, как на генотипическом уровне, так и на уровне фенотипа. Например, в 1989 году ряд штаммов B. subtilis var. niger, образующих черный пигмент, был выделен в вид B. atrophaeus. Это говорит о том, что систематика рода Bacillus претерпела большие изменения [10]. В свое время, в род Bacillus входили 145 видов [2].  На данный момент он насчитывает 77 видов [11].
     В связи с этим огромное значение приобретает разграничение близкородственных организмов и выделение новых видов/подвидов. Работа в этом направлении проводится давно. За последние 20 лет описано несколько видов, входящих в группу B.subtilis. На данный момент группа включает следующие виды B.subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. vallismortis, B. atrophaeus, B. sonorensis и B. mojavensis.
     Сравнительный анализ генов 16S рРНК штаммов группы B. subtilis мало информативен, так как процент сходства последовательности нуклеотидов у штаммов различных видов достигает 100% [13]. С учетом тенденции развития систематики бактерий в направлении «дробления» гетерогенных родов и видов и описания таксонов с более однородным составом, можно полагать, что изучение структур полимеров у фенотипически близких штаммов рода Bacillus имеет вполне определенные таксономические перспективы.
     Современный подход к систематике прокариот геномно ориентирован, однако фенотипические характеристики остаются необходимым элементом. Особое значение приобретают химические характеристики клеток: полимеры клеточной стенки и цитоплазматической мембраны. Поэтому только сочетание фенотипических и филогенетических методов может обеспечить подход к естественной классификации микроорганизмов [12].

     Рис. 1. Филогенетическое дерево типовых штаммов бацилл группы B. subtilis по гену 16S рРНК. После видового названия приведен номер ГенБанка, под которым находится использованная нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК для типового штамма данного вида. Использованный для построения древа масштаб (1 нуклеотидная замена на 100 позиций) указан в нижней части рисунка.
     
     2 Роль в природе и хозяйственной деятельности человека
     2.1 Экология и распространение бактерий группы сенной палочки
     Бактерии рода Bacillus являются важнейшими компонентами экзогенной флоры человека и животных. Род Bacillus привлекает внимание исследователей с давних времен. Накопленные знания в области микробиологии, биохими, физиологии, генетики бактерий свидетельствуют о преимуществах бацилл как продуцентов биологически активных веществ: ферментов, антибиотиков, инсектицидов. Высокая приспособляемость к различным условиям существования способствует распространению бацилл в воздухе, почве, воде, пищевых продуктах и других объектах внешней среды, а также в организме человека и животных [14].
     Спорообразующие бактерии, как часть зимогенной флоры почвы, рассматриваются как оппортунисты. Поступление спор к субстратам для дальнейшего прорастания будет содействовать их активному распространению в различные места обитания. Воздушное распространение покоящихся спор может объяснить появление бацилл в большинстве мест обитания [2].
     Эти бактерии могут вызывать порчу продуктов питания, таких как хлеб, картофель, молочная продукция. Терморезистентные споры бацилл проблематичны в производстве сухого молока, которые не погибают во время обезвоживания и попадают в готовые продукты. В отношении желудочно-кишечного тракта человека виды Bacillus являются аллохтонными микроорганизмами, которые попадают туда в результате либо случайного поедания, либо осознанного употребления в пищу ферментированных продуктов питания [15].
     2.2 Использование в сельском хозяйстве
     Мировая направленность сокращения доз внесения агрохимикатов и химпестицидов определяет возрастание  определенного интереса к применению в агротехнологиях дополнительных источников биологических средств защиты растений. В заметной степени это может быть достигнуто в результате внедрения в растениеводство высокоэффективных микробиологических препаратов, изготовленных на основе активных штаммов микроорганизмов [16]. Приоритетным в выборе средств защиты растений от болезней и вредителей должно быть здоровье человека и, следовательно, выбор должен быть сделан в пользу биопрепаратов [30].
     При выборе биоагентов для разработки микробных препаратов чаще используются представители ризосферных микроорганизмов родов Pseudomonas, Arthrobacter, Flavobacterium, Bacillus, Achromobacter. 
     Они способны продуцировать широкий спектр вторичных метаболитов и хорошо приспосабливаться к условиям ризосферы [17]. Особенный интерес для разработки комплексных МБП по сумме полезных свойств представляют бациллы, которые занимают, в зависимости от группы природных и хозяйственных факторов до 36% всей микробной популяции [18].
     Первый микроорганизм, у которого обнаружено свойство лизировать не только свои клетки, но и клетки других бактерий и грибов – B. subtilis. Литические ферменты бацилл этого вида имеют различную субстратную специфичностью. При лизисе может высвобождаться содержимое гиф, которое служит дополнительным источником питания и энергии для бацилл [19].  
     Практический и теоретический интерес представляет использование штаммов B. subtilis в роли пробиотика для сельскохозяйственных животных. Также они могут входить в состав пробиотических кормовых добавок, субстратом при этом могут служить растительные отходы – различные типы шротов, жомы, жмыхи и др. [20].  
     Важно их применение с целью профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний и повышения продуктивности молодняка [50]. Испытания этих пробиотиков из штаммов бактерий B. subtilis, как «Хонгуринобакт», «Сахабактисубтил» и культуральной жидкости из штаммов бактерий B. subtilis «ТНП-3», «ТНП-5» дали указанные результаты. Обработка супороносных свиноматок пробиотиками существенно снижает риск заболеваемости новорожденных поросят, а также позволяет получать более жизнеспособное потомство. В итоге поэтапного применения пробиотических препаратов укрепляется иммунная система организма, повышается сохранность и интенсовность роста свиней в различных возрастных группах, улучшается качество мяса [21].  
     2.3 Использование в медицине
     Пробиотики в современном представлении - бактериальные препараты из живых микробных культур, которые предназначены для коррекции микрофлоры хозяина и лечения ряда заболеваний. Главной особенностью пробиотиков является их способность повышать противоинфекционную устойчивость организма, оказывать в числе случаев противоаллергенное действие, регулировать и стимулировать пищеварение [22].  
     На рынке бывшего СССР, включая РФ, был представлен ряд препаратов на основе данного вида микроорганизмов, известных под коммерческим названием «Споробактерин», «Бактиспорин», «Бактисубтил» и др. Они готовились на основе различных штаммах сенной палочки, и до настоящего времени эти препараты используются в гастроэнтерологической практике. По данным, назначение 26 больным в возрасте 20-55 лет, страдающим острыми кишечными инфекциями (сальмонеллез, дизентерия, пищевая токсикоинфекция неустановленной этиологии, кампилобактериоз), «Спорбактерина», приготовленного на штамме Bacillus subtilis, выявило хорошую его эффективность при этих инфекциях, которая у «Споробактерина» была даже более выражена, чем у «Бифидумбактерина», в отношении сокращения длительности болевого синдрома. Исследованиями, проведенными в ряде клинических и научных учреждений России, было показано, что назначение «Бактиспорина» больным, страдающим различными заболеваниями, одним из проявлений которых является дисбаланс нормальной микрофлоры толстой кишки, сопровождалась стойкой нормализацией стула, исчезновением аллергических проявлений и  интоксикации. 
     Положительная динамика действия пробиотических препаратов на основе B. subtilis на организм связывают с явной антогонистической активностью этих бактерий в отношении многих потенциальных возбудителей кишечных инфекций, а также продукцией ими большого количества разнообразных (прежде всего протеолитических) ферментов [23].
     Терапевтическая эффективность пробиотика определяется комплексным действием широкого набора метаболитов, которые способны продуцировать живые микробные клетки штаммов бактерий, входящих в состав препаратов [40].
     Изучение принципа лечебно-профилактического действия препаратов-пробиотиков на организмы человека и животных показывает, что бациллы обладают способностью проникать из желудочно-кишечного тракта (жкт) в кровь, а оттуда в очаг поражения, сохранять жизнеспособность, продуцировать антибиотики, протеолитические ферменты и иммуномодуляторы. Установлено, что после перорального приема, уже в первые минуты через слизистые ротоглотки, пищевода и желудка примерно 0,1% от общего числа бактерий проникают в паренхиматозные органы - бессимптомная транслокация микроорганизмов, она длится 6-8 часов после однократного приема препарата до элиминации микробных клеток из органов, во время которой и осуществляется воздействие препарата на организм.
     Сенная палочка для человека является чужеродным микроорганизмом. Более того, имеются результаты наблюдений о способности представителей этого вида вызывать пищевые токсикоинфекции. Полагая, что B. subtilis является облигатно-аэробным микроорганизмом, считают, что при назначении препаратов, содержащих сенную палочку, вводимые микроорганизмы не размножаются в кишечном тракте, и наблюдаемый клинический эффект, вероятно, наиболее обусловлен присутствующими в концентрате антибиотическими веществами и ферментами, образовавшимися в момент наращивания биомассы в питательной среде. В связи с этим, для исключения риска возникновения каких-либо осложнений у больных наиболее целесообразно готовить очищенные лекарственные препараты из культуральной жидкости сенной палочки, которые не содержали бы живых бактерий и спор этого микроорганизма.
     Разнообразие метаболических процессов, генетическая и биохимическая вариабельность, устойчивость к литическим и пищеварительным ферментам обусловили использование бацилл в медицине. 
     В итоге спорообразующие бактерии все чаще используются в качестве пробиотиков.  Таким образом, на сегодняшний день в мире создано более полусотни таких препаратов, которые полностью или частично составлены на основе спороформирующих бактерий [23]. 
     2.4 Бактерии группы сенной палочки – объект промышленного культивирования
     Из всего разнообразия известных видов бактерий в промышленности используется относительно малое их количество. Все важнейшие бактерии-продуценты относятся к хемоорганотрофам. Среди них широко представлены грамположительные организмы, в том числе в их состав входят аэробные спорообразующие бактерии рода Bacillus. Так как данные микроорганизмы выделяют ферменты в культуральную жидкость, получение их препаратов не представляет особых трудностей. 
     Как правило, выход фермента в процессе культивирования бактерий рода Bacillus с использованием дешевых источников углерода и азота составляет примерно 20 грамм вещества на 1 литр среды за короткое время. Это говорит о способности штаммов Bacillus продуцировать значительное количество ферментов при доступной стоимости производства [2].  
     Объем мирового производства только препаратов альфа-амилазы, синтезируемых штаммами Bacillus amyloliquefaciens, в 2004 г достиг 800 тыс. тонн. Рыночная стоимость этого продукта составляет около 20 млрд. долл. Этот фермент, несомненно, играет ключевую роль в решении проблемы разработки экономически оправданного способа синтеза топливного этанола, что в свою очередь, способно снизить зависимость экономически развитых стран от импорта нефти, решить множество глобальных социально-экономических, политических и экологических проблем [44].  
     Протеазы получают промышленным способом из Bacillus licheniformis, также данный микроорганизм вместе с B. amyloliquefaciens выступает продуцентом ? -амилаз. ?-Амилаза – один из наиболее важных ферментов, участвующих в осахаривании крахмала. Термостабильные ?-амилазы используются при высокотемпературных условиях. Фермент из B. amyloliquefaciens имеет температурный оптимум 70 оС, фермент из B. licheniformis – 90 оС. Последний может кратковременно использоваться при температурах до 115 оС, а ионы кальция и высокие концентрации субстрата стабилизируют его активность. 
     Среди наиболее важных в промышленном отношении ферментов второе место после амилаз занимают на современном этапе протеазы. Ежегодно в мире производится ориентировочно 500 т этих ферментов, которые используются прежде всего в производстве моющих средств. Большим достижением для промышленности стало введение способа получения протеаз из Bacillus licheniformis, в первоочередность субтилизина. К концу 1960-х гг. протеазы включали в состав 50 % всех детергентов, производимых в Европе и США. Постоянно продолжаются исследования, ориентированные на повышение ферментативной активности протеаз, их способности к удалению пятен и стабилизацию активности в мыльном растворе. 
     Клонированы гены нескольких протеаз и с помощью методов генетической инженерии получены штаммы бацилл, продуцирующие модифицированные сериновые протеазы [2].  
     B. subtilis – один из продуцентов ?-маннаназы, фермента, который расщепляет гликозидные связи в маннанах. Спектр микроорганизмов – природных продуцентов ?-маннаназ довольно широк, однако уровень их активности не достаточен для их использования в качестве промышленных продуцентов. Но достижения в области молекулярного клонирования позволили повысить выход и активность целе вого фермента по сравнении с его выходом у нативного продуцента. Установлено, что образующиеся врезультате ферментативного гидролиза манноолигосахариды и моносахарид манноза обладают пробиотическим и имммунотропным действием [24].  
     Предлагается метод получения пуриновых нуклеозидов, таких как ксантозин, инозин и гуанозин с использованием бактерии, принадлежащей к роду Bacillus и несущей мутацию, которая придает ей устойчивость квысокому осмотическому давлению. При выращивании в питательной среде такая бактерия продуцирует и накапливает большее количество пуриновых нуклеотидов [25].  
     По мере развития технологии рекомбинантных продуцентов различных белков высокая способность бацилл к секреции белка стимулировала попытки конструирования на их основе продуцентов ценных биоактивных белков и пептидов: интерферонов, проинсулина, соматотропина, вакцинирующих вирусных антигенов, сывороточного альбумина и других, но все эти попытки закончились неудачно. Также было установлено, что бациллярные клетки неспособны к секреции даже собственных секреторных белков, которые подвергнутся более или менее значительным модификациям. А именно, не удалось заставить бациллы секретировать экзогидролазы, неспособные к естественному фолдингу, или лишенные ферментативной активности. В итоге, можно сделать вывод о способности секреторного аппарата бацилл, в сравнении с секреторным аппаратом дрожжей, мицелиальных грибов и клеток высших эукариот, избирательно распознавать дефектные неактивные молекулы и не допускать их транспорта во внешнюю среду [44]. 
     2.5 Использование B.subtilis в генной инженерии
     Начиная с самых первых генно-инженерных исследований на сенной палочке, было обнаружено, что гены разнообразных грамположительных бактерий, в большинстве случаев экспрессируются в клетках данной бактерии. 
     Многочисленными экспериментами установлено, что жесткое лимитирование на экспрессию чужеродных генов в клетках грамположительных бактерий налагает организация их белоксинтезирующего аппарата.
     Создание набора клонирующих молекулярных векторов и достигнутое понимание организации генов бацилл дали ход исследованиям по экспрессии чужеродных генов в B.subtilis. Особую важность для биотехнологии имеет секреция целевых белков в окружающую среду, так как бактерии группы сенной палочки используют в качестве промышленных продуцентов различных секретируемых ферментов. Поэтому они становятся объектами исследований по повышению продуктивности. Например, М. Сибаков поместил структурный ген термостабильной альфа-амилазы из B. licheniformis в вектор экспрессии-секреции на основе элементов генов ? -амилазы B. amyloliquefaciens. Это дало начало к тому, что плазмидсодержащие клетки сенной палочки стали производить термостабильную ?-амилазу в количестве, значительно превышающем уровень синтеза этого фермента в штамме-доноре в несколько сотен раз.
     Из этого следует, что в клетках B.subtilis на данный момент клонирован широкий спектр хромосомных генов бацилл, в том числе гены пенициллиназ, протеаз, амилаз. При этом в клетках, которые содержат гибридные плазмиды, как правило наблюдается сверхсинтез соответствующих продуктов [53].
     3 Культивирование бактерий группы сенной палочки
     Бактерии группы B. subtilis применяют в качестве промышленных продуцентов различных секретируемых ферментов – амилаз, протеаз, ксиланаз, хитиназ, липаз и др. [26].
     3.1 Основные среды для культивирования
  .......................