Потенциометрическое определение антиоксидантной активности экстрактов растительного сырья с использованием гексацианоферрата калия

Министерство образования и науки  Российской Федерации

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение 

высшего профессионального образования

«Уральский  федеральный университет имени первого Президента России Б.Н.Ельцина»



Химико-технологический институт

Кафедра аналитической химии

	



ДОПУСТИТЬ К ЗАЩИТЕ  В ГЭК



Зав. кафедрой  Матерн А.И.



______________       _________________

	                                                                                                    ( подпись)                       (Ф.И.О.)

«______»__________________201__ г.



ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ЭКСТРАКТОВ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕКСАЦИАНОФЕРРАТА КАЛИЯ

Пояснительная записка

___________________________





Руководитель  Герасимова Е.Л.				_____________

Консультант _______________				_____________

Консультант_______________				_____________

Нормоконтролер Алямовская И.С.				_____________

Студент гр. ХМ – 250201 Попова К.Г.			_____________









Екатеринбург

 2017



 Министерство образования и науки  Российской Федерации

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение 

высшего профессионального образования

«Уральский  федеральный университет имени первого Президента России Б.Н.Ельцина»



Факультет Химико-технологический____________________________________________

Кафедра _Аналитической химии_______________________________________________

Направление (специальность) _Инструментальные методы исследования в фармацевтике________________________________________________________________



УТВЕРЖДАЮ

Зав. кафедрой _Матерн А.И._____________



______________       _________________

	       ( подпись)                                                (Ф.И.О.)

«______»____________________201__ г.



ЗАДАНИЕ

на выполнение выпускной квалификационной работы



студента Поповой Ксении Геннадьевны____________ группы _ХМ-250201___________

(фамилия, имя, отчество)



1 Тема ВКР _Потенциометрическое определение антиоксидантной активности экстрактов растительного сырья с использованием гексацианоферрата калия___________________

Утверждена распоряжением по факультету от «____» ____________ 201__ г. № _______

2 Руководитель Герасимова Елена Леонидовна, должность, доцент каф. АХ, к.х.н.______

(Ф.И.О., должность, ученое звание, ученая степень)

3 Исходные данные к работе___________________________________________________

_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

4 Содержание пояснительной записки (перечень подлежащих разработке вопросов)  ___________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

5 Перечень демонстрационных материалов ______________________________________

_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________



6 Консультанты по проекту (работе) с указанием относящихся к ним разделов проекта

Раздел

Консультант

Подпись, дата





задание выдал

задание принял

























































7 Календарный план

Наименование этапов выполнения работы

Срок выполнения этапов работы

Отметка 
о выполнении

























































Руководитель _________________________                  ____________________________

(подпись)						Ф.И.О.

Задание принял к исполнению _______________________________________

(подпись)

8 Выпускная работа закончена «____» ___________________ 201     г.



Пояснительная записка и все материалы просмотрены

Оценка консультантов:* а) _______________________    б) ________________________

в) _______________________    г) ________________________

Считаю возможным допустить ________________________________________________

к защите его выпускной квалификационной работы в экзаменационной комиссии.

Руководитель _______________________



9 Допустить ____________________________________________ к защите выпускной квалификационной работы в экзаменационной комиссии (протокол заседания кафедры № ______ от «_____» ___________ 200   г.)





Зав. кафедрой ______________________







* - раздел, необходимый только для выполнения дипломной работы (проекта) специалиста





 Министерство образования и науки Российской Федерации

ФГАОУ ВПО «УрФУ имени первого Президента России Б.Н.Ельцина»



ОТЗЫВ

руководителя выпускной квалификационной работы

Тема ВКР __________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 

Студент __________________________________________ при работе над ВКР проявил себя следующим образом:

1 Степень творчества __________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ 

_____________________________________________________________________________

2 Степень самостоятельности ___________________________________________________ _____________________________________________________________________________ 

_____________________________________________________________________________

3 Работоспособность, прилежание, ритмичность ___________________________________ _____________________________________________________________________________ 

_____________________________________________________________________________

4 Уровень специальной подготовки студента ______________________________________ _____________________________________________________________________________ 

__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5 Возможность использования результатов в народном хозяйстве_____________________ _____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________



ОБЩЕЕ  ЗАКЛЮЧЕНИЕ

_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________



Ф.И.О. руководителя ВКР ______________________________________________________ 

Должность _________________________________ Кафедра __________________________ 

_____________________________________________________________________________

Уч. звание __________________________ Уч. степень ______________________________ 



Подпись ___________________ 				Дата ___________________




Реферат

Магистерская диссертация 64с., 18 рис., 10 табл., 3 части, 54 источника.

АНТИОКСИДАНТ, АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ, ЭКСТРАКТЫ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ, 

Объектами исследования являются низкомолекулярные антиоксиданты, их смеси и экстракты растительного сырья.

	Цель работы: определение антиоксидантной активности чая и экстрактов растительного сырья потенциометрическим методом с использованием гексацианоферрата калия (III) калия в качестве модели окислителя.

	В работе представлены причины возникновения окислительного стресса, экзогенные антиоксиданты природного происхождения, описаны методы определения интегрального показателя антиоксидантной активности.

	В процессе работы определена антиоксидантная активность низкомолекулярных антиоксидантов потенциометрическим методом с использованием гексацианоферрата калия (III) калия в качестве модели окислителя, потенциометрическим титрованием, фотометрическим титрованием. 

	В результате исследования определена антиоксидантная активность экстрактов различных сортов чая и лекарственного растительного сырья потенциометрическим методом с использованием гексацианоферрата калия (III) калия в качестве модели окислителя.

	 




Список принятых сокращений

АКМ – активированные кислородные метаболиты

АО – антиоксиданты 

	АОА – антиоксидантная активность	

АФК – активные (реактивные) формы кислорода

ГЦФ - гексацианоферрат калия (III) калия

БАД – биологически активные добавки

БАВ – биологически активные вещества

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота

ЦВА – циклическая вольтамперометрия

FRAP – железовосстанавливающая/антиоксидантная способность (ferric reducing/antioxidant power)

ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография

ОФ – обращенно-фазовая хроматография

ТСХ – тонкослойная хроматография






Оглавление

	Введение	9

	Литературный обзор	12

	1 Исследование природных экзогенных антиоксидантов и существующих методов определения АОА	12

	1.1 Экзогенные антиоксиданты	13

	1.1.1 Антиоксиданты, имеющие в составе фурановый цикл	14

	1.1.2 Серосодержащие антиоксиданты	15

	1.1.3 Полифенольные антиоксиданты	16

	1.1.4 Провитаминные антиоксиданты	19

	1.2 Методы определения антиоксидантной активности	22

	Химически методы	22

	Физико-химические методы	23

	Хроматографические методы	27

	3 Экспериментальная часть	31

	3.1 Реактивы и оборудование	31

	3.2 Объекты исследования	32

	3.3. Определения антиоксидантной активности индивидуальных антиоксидантов и их модельных смесей	34

	3.3.1. Потенциометрический метод определения антиоксидантной активности с использованием окисленной формы металла в составе комплексного соединения	34

	3.3.2 Определение стехиометрического соотношения в реакции антиоксидант-окислитель с помощью метода потенциометрического титрования	40

	3.3.3 Фотометрическое титрование	44

	3.4 Определение антиоксидантной активности экстрактов растительного сырья	50

	3.4.1 Определение АОА экстрактов лекарственного растительного сырья потенциометрическим методом с использованием гексацианоферрата (III) калия	50

	3.4.2 Метод определения общего содержания полифенолов	51

	3.4.3 Определение антиоксидантной активности чая потенциометрическим методом с использованием гексацианоферрата (III) калия	54

	Заключение	57

	Список использованных источников	58






Введение

	В процессе дыхания около 95 % вдыхаемого кислорода расходуется на выработку энергии и окислительный метаболизм субстратов, однако 2-5% кислорода переходит в активные формы кислорода (АФК). АФК играют двойственную роль в организме человека, с одной стороны,  являясь сигнальными молекулами, они служат для построения и обновления структурных элементов клеточных мембран, с другой стороны, избыточное количество АФК может привести к окислению важных органических молекул организма, например, ДНК.

	Регулирование процессов окисления и уровня, накапливающихся при этом в клетках организма АФК, осуществляется защитной антиоксидантной системой – одним из звеньев сложной системы адаптации организма. Под влиянием на организм человека неблагоприятных экологических факторов, повышенных физических и эмоциональных нагрузок, а также при длительных заболеваниях и в процессе старения образование активных форм кислорода в организме активизируется. Защитная антиоксидантная система перестает справляться со своей функцией регулятора содержания окислителей, вследствие этого, накапливается избыточное количество активных форм кислорода - развивается окислительный стресс, при котором требует применения веществ, обладающих антиоксидантными свойствами. 

	В условиях окислительного стресса антиоксидантная система организма не может полностью подавлять избыточные реакции окисления, следовательно, существует необходимость во введении в организм человека дополнительного количества антиоксидантов. Для этого необходимо владеть информацией как о состоянии антиоксидантной системы организма, так и об антиоксидантной активности (АОА) потребляемых препаратов, биодобавок, продуктов питания, напитков. Поэтому исследование чая и экстрактов растительного сырья как природных источников антиоксидантов  является современной актуальной задачей. 

	Существует ряд методов определения антиоксидантной активности. На сегодняшний день наиболее широко используют оптические, электрохимические и хроматографические методы исследования для определения антиоксидантной активности.

	Среди существующих методов исследования АОА следует отметить электрохимические методы, как наиболее простые и информативные. В данной группе методов одним из перспективных является потенциометрический метод определения АОА.

	Растительные травы и чаи в настоящее время представляют особый интерес, так как являются одними из наиболее часто употребляемых напитков. Поскольку в розничной сети представлен широкий ассортимент данной продукции, необходим экспрессный и достоверный метод для определения их полезных свойств. Одним из свойств может выступить интегральный показатель АОА. 

	Цель данной работы заключается в определении антиоксидантной активности чая и экстрактов растительного сырья потенциометрическим методом с использованием гексацианоферрата калия (III) калия (ГЦФ) в качестве модели окислителя.

	Для достижения данной цели необходимо решить следующие задачи:

	Определить АОА индивидуальных низкомолекулярных антиоксидантов и их модельных смесей потенциометрическим методом с использованием в качестве модели окислителя гексацианоферрата (III) калия, определить стехиометрические коэффициенты реакции взаимодействия антиоксидантов с K3[Fe(CN)6];

	Определить  стехиометрические коэффициенты реакции взаимодействия антиоксидантов с K3[Fe(CN)6] методами потенциометрического и фотометрического титрования;

	Исследовать антиоксидантную активность экстрактов чая и экстрактов растительного лекарственного сырья с использованием предложенного подхода.

	Провести корреляционные исследования результатов определения антиоксидантной активности экстрактов лекарственного растительного сырья и общего содержания полифенолов.




Литературный обзор

1 Исследование природных экзогенных антиоксидантов и существующих методов определения АОА 

	Во всех живых организмах постоянно протекают реакции с образованием химических соединений, которые получили название  «активные (реактивные) формы кислорода» (АФК):   (супероксидный анион-радикал),   (синглетный кислород), Н2О2 (перекись водорода),  (гидроксильный радикал), OCl?, RO2? и др. Многие из них имеют неспаренный электрон и являются свободными радикалами. Избыток именно этих соединений считают ответственным за развитие окислительного стресса. 

	Применительно к биологическим системам понятия «свободные радикалы» и «активные (реактивные) формы кислорода» не всегда совпадают. Неспаренный электрон может быть локализован на атомах углерода, серы, азота. С другой стороны, многие содержащие кислород молекулы, такие, как перекись водорода, синглетный кислород, гипогаллоиды, не будучи радикалами, взаимодействуют с органическими молекулами через радикальные механизмы. Для обозначения таких химических соединений используют понятие «активированные кислородные метаболиты» (АКМ) (Рисунок 1), под которыми подразумевают широкий класс кислородсодержащих соединений радикальной и нерадикальной природы [1]. 

	

	

	

	Рисунок 1 - Свободные радикалы и активные кислородные соединения 

	Таким образом, АКМ – это высокореакционноспособные кислородсодержащие соединения, образующиеся в живых организмах в результате неполного восстановления молекулярного кислорода [2].

1.1 Экзогенные антиоксиданты

	Антиоксидант – любое вещество, которое, присутствуя в низких по сравнению с окисляемым субстратом концентрациях, существенно задерживает или ингибирует его окисление.

	По химической природе антиоксиданты представляют собой широкий класс соединений: фенолы и полифенолы (токоферолы, эвгенол, пирокатехин, производные галловой кислоты), флавоноиды (рутин, кверцетин), стероидные гормоны (лецитин, кефалин) и многие другие соединения. 

	В зависимости от растворимости различают жирорастворимые (витамины Е, А, К, стерины, убихинон) и водорастворимые (витамины С, В6, РР, серотонин, SH-содержащие соединения) антиоксиданты. 

	По молекулярной массе выделяют группу низкомолекулярных антиоксидантов (глутатион, аскорбат, ?-каротин, ?-токоферол, мочевая кислота) и высокомолекулярных, не способных проникать через биологические барьеры (ферритин, каталаза, пероксидазы и др.)

	Другим критерием для классификации антиоксидантов является место их образования и путь проникновения в организм. С этой позиции их можно классифицировать на: экзогенные антиоксиданты - поступающие в организм с пищей; эндогенные антиоксиданты - синтезированные в организме и переносимые в место действия гуморальной системой [3].

На сегодняшний день в литературе описано огромное количество природных и синтетических антиоксидантов. Следует отметить, что вследствие значительного разнообразия структур и свойств антиоксидантов до настоящего времени не было предложено универсального варианта их классификации. Даже деление АО на природные и синтетические является достаточно условным, так как многие природные соединения в процессе экстрагирования и получения товарной формы подвергаются различной химической модификации. Например, для фармакологического применения витамин Е выпускается в виде токоферола ацетата, который в модельных экспериментальных системах не проявляет антиоксидантных свойств, однако, попадая в живой организм, быстро гидролизуется и переходит в биологически активную фенольную форму        ?-токоферола . 

Природные антиоксиданты являются ключевым звеном в функционировании ферментативных систем, регулирующие как скорость образования перекисей, так и скорость их утилизации. Кроме того, их стационарная концентрация в мембране контролируется собственной физико-химической регуляторной системой. Именно участием антиоксидантов в работе этих двух важнейших регуляторных систем объясняется их особая роль в протекании большого комплекса метаболических процессов как в норме, так в патологии [4].

	Приведем классификацию природных низкомолекулярных антиоксидантов по их химической структуре.

1.1.1 Антиоксиданты, имеющие в составе фурановый цикл

Аскорбиновая кислота (витамин С) – ?-лактон 2,3-дегидрогулоновой кислоты (рисунок 2). Аскорбиновая кислота является важным антиоксидантом плазмы человека. В молекуле аскорбиновой кислоты присутствуют две енольные группы, которые определяют его донорно-акцепторные свойства.



Рисунок 2 - Структурная формула аскорбиновой кислоты

	Как антиоксидант она вступает во взаимодействие со многими АКМ: гипохлоритом, синглетным кислородом, супероксидным анион-радикалом, гидроксильным и перекисными радикалами [5].

1.1.2 Серосодержащие антиоксиданты

Цистеин (?-амино-?-тиопропионовая кислота; 2-амино-3-меркаптопропановая кислота) — алифатическая серосодержащая аминокислота (рисунок 3). Цистеин — заменимая аминокислота. Он может синтезироваться в организме млекопитающих из серина с участием метионина как источника серы, а также АТФ и витамина В6. Содержится в продуктах питания с высоким уровнем белка. Один из самых мощных антиоксидантов, при этом его антиоксидантное действие усиливается при одновременном приеме витамина С и селена.



Рисунок 3 – Структурная формула цистеина

	Важную роль в антиоксидантной защите организма играют легкоокисляющиеся пептиды, в состав которых входят SH-содержащие аминокислоты: цистеин, цистин, метионин, глутатион [6].

	Глутатион (2-амино-5-{[2-[(карбоксиметил)амино]-1-(меркаптометил)-2-оксоэтил]амино}-5-оксопентаноевая кислота) — это трипептид ?-глутамилцистеинилглицин. Значение глутатиона в клетке определяется его антиоксидантными свойствами (рисунок 4). 

	

	Рисунок 4 – структурная формула глутатиона

	Фактически глутатион не только защищает клетку от токсичных свободных радикалов, но и в целом определяет окислительно-восстановительные характеристики внутриклеточной среды. Глутатиoн в восстановленной форме может функционировать как антиоксидант несколькими способами химически взаимодействовать с синглетным кислородом, супероксидом и радикалами гидроксила или на прямую разрушать свободные радикалы; стабилизировать мембранную структуру перемещением ацилпероксидов, образующихся путем перекисного окисления липидов [7].

1.1.3 Полифенольные антиоксиданты

	Спектр фармакологической активности полифенольных соединений включает антиоксидантное, антигипоксическое, противоопухолевое, дезинтоксикационное, биостимулирующее, регенераторное, противовоспалительное и адаптогенное действие, а также влияние на иммунную, эндокринную и другие системы организма [8]. 

	Простые фенольные соединения (одно-, двух-, трехатомные фенолы) в свободном виде практически не встречаются в растениях, хотя выявляются в следовых количествах (рисунок 5). В гораздо большей степени представлены их производные [9]. 

	

	Пирокатехин    	Резорцин 	Пирогаллол

	Рисунок 5 – некоторые фенольные антиоксиданты

	Оксибензойные кислоты широко встречаются в разных органах растений [10]. Эти фенольные соединения – одни из типичных вторичных метаболитов растений. Наиболее известными представителями являются: оксибензойная, протокатеховая, ванилиновая, галловая, гентизиновая, салициловая, сиреневая кислоты (рисунок 6). Кроме того, оксибензойные кислоты входят в структуру эфиров. Некоторые кислоты, как, например, галловая, встречаются в виде димеров [11].   

		

	Галловая кислота	 Парагидроксибензойная кислота

	Рисунок 6 – Наиболее известные представители оксибензойных кислот

	Оксикоричные кислоты играют важную роль в обмене веществ и служат биогенетическими предшественниками подавляющего большинства других фенольных соединений. Наиболее известными представителями являются оксикоричная, кофейная, феруловая и синаповая кислоты (рисунок 7). У растений оксикоричные кислоты также представлены в виде эфиров или полимеров. Наиболее известным примером является куркумин, состоящий из двух молекул феруловой кислоты. В тканях ряда животных оксикоричные кислоты могут также возникать в процессе метаболизма полифенолов [12].

	

	Рисунок 7 – Кофейная кислота

	Кумарины отличаются от оксикоричных кислот тем, что боковая трехуглеродная группировка замыкается через атом кислорода в дополнительный шестичленный гетероцикл [13]. Кумарин – летучий компонент многих растений, обладающий приятным запахом свежескошенного сена (рисунок 8).

	

	Рисунок 8 – кумарин

	Стильбены не являются в полном смысле вторичными метаболитами. Основными представителями служат: ресвератрол, птеростильбен, пиносильвин, рапонтицин [14].

	Флавоноиды  – самый многочисленный класс природных фенольных соединений. Они представляют собой полифенолы, структурной основой которых служит флавоновое ядро, содержащее два ароматических кольца, соединенных С3 -мостиком. Флавоноиды можно также рассматривать как производные хромана [15]. 

	В зависимости от структуры ядра выделяют катехины, лейкоантоцианы, антоцианы, флавононы, флавоны, флавонолы, халконы (рисунок 9). Флавоноиды придают розовый, красный, лиловый, фиолетовый, голубой цвет фруктам, овощам, цветам [16].

	 Флавоноиды взаимодействуют с гидроксильным радикалом, супероксид-радикалом, перекисными радикалами. Образующиеся при этом радикалы флавоноидов активно вступают в реакции диспропорционирования. Флавоноиды широко представлены в овощах, фруктах, цветах, семенах растений, орехах, коре деревьев, и поэтому являются важной составной частью рациона питания животных и человека [17]. 









Флавоны

Катехины

Изофлавоны







Флавонолы

Антоцианидины

Халконы

Рисунок 9 - Структурные формулы некоторых классов флавоноидов

1.1.4 Провитаминные антиоксиданты

Токоферолы. Так же, как и флавоноиды, токоферолы являются производными хромана (6-гидроксихроманами с изопреновыми заместителями). Витамин Е имеет четыре формы, проявляющие антиоксидантную активность: токоферолы ?, ?, ? и ? [18]. В чистом виде ? –  и ? – токоферолы были выделены из зародышей пшеницы в 1936 г. [19]. Токоферолы эффективно элиминируют супероксидный анион-радикал, синглетный кислород, пероксирадикалы, ОН-радикал, индуцированные ROO- и ОН-радикалами процессы ПОЛ и окисление липидов низкой плотности. В клетках животных в наибольших концентрациях присутствует ?-токоферол (рисунок 10) [20].



Рисунок 10 - Структурная формула ?-токоферола (5,7,8-триметилтокола).

Каротионоиды относятся к группе жирорастворимых растительных пигментов, которые придают характерную окраску овощам и фруктам, они синтезируются растениями, морскими водорослями и некоторыми микроорганизмами. Обширная группа каротиноидов подразделяется на 2 подкласса: каротины, имеющие в составе исключительно углерод и водород, и ксантофиллы, в состав которых также входят молекулы кислорода (рисунок 11). Каротиноиды обладают антиканцерогенным действием, что делает их важным элементов защиты генома клеток от окислительных повреждений [21].



Рисунок 11 – структурная формула ?-каротина 

	Большой интерес при изучении антиоксидантной активности вызывают лекарственные травы, так как большое количество фенольных АО обуславливают их антиоксидантное, противовоспалительное, антимикробное и спазмолитическое действия. Содержание флавоноидов в растительном сырье является важнейшим показателем их биологической ценности. Другой важнейшей характеристикой сырья является присутствие аскорбиновой кислоты, так как к прочим ее свойствам, она проявляет синергизм действия с флавоноидами в регуляции окислительно-восстановительных процессов. Присутствующие в сырье аминокислоты, оказывают расслабляющее и успокаивающее действие [22].

	Эффективность действия лекарств из дикорастущих растений зависит от качества сырья и соблюдения основных правил их приготовления. При нарушении технологических приемов часть полезных веществ — витамины, фитонциды, окислительные ферменты, эфирные масла и др. — разрушается, и лекарство окажется недейственным [23]. 

	Одним из широко распространенных напитков является чай. В состав чая входят следующие вещества: катехины (эпикатехин, эпигаллокатехин, эпикатехингаллат, эпигаллокатехингаллат), теарубины, флаванолы, гликозиды флавонолов, гликозиды кверцетина, теафлавины. Зеленый чай содержит также некоторое количество окисленных катехинов. Общее относительное содержание катехинов составляет от 60 до 80% всех флавоноидов в зеленом и от 6 до 24% – в черном чае, что обеспечивает несколько более высокие антиоксидантные свойства зеленого чая [24].

	Известно, что антиоксиданты чая способны стимулировать активность ряда ферментов антиоксидантной защиты организма, а так же ингибировать процессы перекисного окисления липидов, индуцированные металлами переходной валентности [25].




 1.2 Методы определения антиоксидантной активности

	Оксидант/антиоксидантный баланс организма определяют окислительно-восстановительные реакции, поэтому общие принципы определения интегральной антиоксидантной активности базируются именно на окислительно-восстановительных реакциях и могут быть реализованы разными способами: химическими и физико-химическими. 

	Классификация методов определения АОА:

	Химические;

	окислительно-восстановительно титрование, 

	Спектроскопические

	Электрохимические; 

	кулонометрические, 

	вольтамперометрические,

	 потенциометрические.

	хроматографические

Химически методы

	Известен метод окислительно-восстановительного титрования с использованием перманганата калия в качестве окислителя для определения антиоксидантной активности. Метод оценки АОА заключается в том, что 0,05 Н раствор перманганата калия в 0,024 М растворе серной кислоты титруют при комнатной температуре раствором анализируемой пробы до обесцвечивания и расчет концентрации биологически активных веществ (БАВ) проводят по формуле в пересчете на кверцетин.

	Если биологически активное вещество находится в твердом или сыпучем состоянии, то берут точную навеску 1 г., настои и отвары лекарственных трав готовят по ГФ XI,
Показателем относительной АОА служит объем препарата (объекта) в миллилитрах, израсходованный на титрование 1 мл 0,05 Н раствора перманганата калия. Чем меньше объем препарата, израсходованный на титрование, тем выше антиокислительная активность препарата.
Для количественной оценки АОА препаратов (объектов) вводится показатель активности - В. Эта величина представляет собой сумму БАВ восстанавливающего характера и выражается количеством миллиграммов кверцетина в 1 мл или 1 г препарата (объекта). Чем выше величина В, тем более высокой АОА обладает объект.  Расчет показателя АОА, которому соответствует концентрация БАВ восстанавливающего характера в пересчете на кверцетин (в мг/г), проводят по формуле 1:

	

	 					(1)


	где B - концентрация биологически активных веществ восстанавливающего характера исследуемого объекта, израсходованного на титрование 1 мл 0,05 Н раствора перманганата калия, мг/г

	Ck - концентрация кверцетина в растворе, израсходованном на титрование 1 мл 0,05 Н раствора перманганата калия, мг/мл;

	Vk - объем раствора кверцетина, израсходованный на титрование 1 мл 0,05 Н раствора перманганата калия, мл;

	Vо - объем исследуемого раствора, мл;

	Vx - объем раствора исследуемого объекта, израсходованный на титрование 1 мл 0,05 Н раствора перманганата калия, мл;
m - масса навески исследуемого объекта, г. [26].

	Недостатком данного метода является визуальная фиксация точки эквивалентности, что увеличивает погрешность анализа.

	Также известен идентичный метод фотометрического титрования по Леветалю с оптической детекцией. 

Физико-химические методы

	Спектроскопические методы

	Спектроскопические методы наиболее широко используются для определения суммарной антиоксидантной активности сложных объектов. 

	Метод FRAP

	 Часто АОА находят методом FRAP (ferric reducing/antioxidant power), основанным на способности антиоксидантов восстанавливать ион железа(III). При фотометрическом определении железовосстанавливающей способности антиоксидантов используют индикаторные системы, в состав которых входит Fe(III) и органический реагент, который образует окрашенный комплекс с восстановленной формой железа (Fe(II)). В качестве таких соединений применяют трипиридилтриазин [27], гексацианоферрат калия [28], 2,2?-дипиридил, о-фенантролин [29]. Индикаторные системы с двумя последними реагентами характеризуются более высокими значениями редокс-потенциалов (0.97 и 1.19 В соответственно), что позволяет расширить круг определяемых веществ. Выбор длины волны, при которой проводится определение АОА, зависит от индикаторной системы.

	 Методика FRAP для оценки АОА пищевых продуктов с использованием этих систем имеет удовлетворительную чувствительность. Методика метрологически обоснована, однако, в круг определяемых этим методом соединений не входят сульфгидрильные SH-содержащие антиоксиданты, такие как глутатион и цистеин, поэтому получаемая этим методом информация не дает полное представление о состоянии антиоксидантной системы [30]. 

	Помимо восстановления Fe3+ может быть использовано восстановление антиоксидантами Ce4+ (?=320 нм) - CRAC (Сeric Reducing Antioxidant Capacity) и Cu2+ (?=450 нм) - CUPRAC (Сupric ion Reducting Antioxidant Capacity) [31]. 

	Недостаточная изученность природных связей АО и трудоемкость получения многомерных градуировок препятствуют широкому применению спектроскопических методик.

	Электрохимические методы

	Поскольку окислительно-восстановительные реакции, определяющие антиоксидант/оксидантный баланс организма, имеют электрохимическую природу,  именно эти методы оценки указанного параметра возможно рассматривать, как максимально полно отвечающие природе явления.

	 Электрохимические методы характеризуются высокой чувствительностью и экспрессностью, предел обнаружения полифенолов и флавоноидов находится на уровне 10–9–10–12 г.

	Амперометрический метод

	Амперометрический метод позволяет непосредственно измерять содержание всех АО в пробе. Другие методы – непрямые, в них измеряется ингибирование реакционных смесей (свободных радикалов), генерированных определенными реакциями. 

	Определение суммарного содержания антиоксидантов в продуктах растительного происхождения проводится с амперометрическим детектированием. Амперометрическое детектирование заключается в измерении электрического тока в ячейке, возникающего при окислении (восстановлении) анализируемого вещества на поверхности рабочего электрода при подаче на него потенциала +1,3 В. Таким образом, при применении амперометрического детектирования регистрируется ток, электрохимического окисления АО, протекающего через ячейку. Чувствительность амперометрического детектора очень высокая из-за малых величин шумов, порядка 10-12 А. В качестве материала рабочего электрода используется стеклоуглерод, который наиболее универсален при определении полифенольных соединений [32].

	Кулонометрический метод

	Разработан ряд методов оценки антиоксидантных свойств, основанных на кулонометрическом титрования электрогенерированными титрантами. В качестве электрогенерированных титрантов используются галогены (Cl2, I2, Br2), генерацию которых осуществляют из растворов (KCl и KBr). Конечную точку титрования фиксируют амперометрически с двумя поляризованными платиновыми электродами. Антиоксидантную емкость рассчитывают, как количество электричества, затраченное на титрование, в пересчете на 100 г сухого вещества (или 100 мл) по формуле 2:

	, 						(2)

	где I — сила тока, А; 

	t — время достижения конечной точки титрования, с; 

	V1 — антиоксиданта, мл;

	V2 — объем аликвоты, мл [33].

	Вольтамперометрический метод

Возможно применение .......................