Определение эмбриотоксического действия полиэлектролитной субстанции адьюванта – антиген – носителя

Министерство сельского хозяйства Российской Федерации
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего образования
«Саратовский государственный аграрный
университет им. Н.И. Вавилова»
	
Факультет ветеринарной медицины, пищевых и биотехнологий
Кафедра «Морфология, патология животных и биология»
Специальность 36.05.01 Ветеринария

Допустить  к защите
Зав. кафедрой  ______________Салаутин В.В.
«___»________________2018г.


     ДИПЛОМНАЯ РАБОТА
      На тему: «ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭМБРИОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНОЙ СУБСТАНЦИИ АДЬЮВАНТА – АНТИГЕН – НОСИТЕЛЯ»



     Студент:Кулагина Татьяна Андреевна
     
     Научный руководитель:
Доцент, кандидат ветеринарных наук          Савина С.В.
     

САРАТОВ, 2018



Министерство сельского хозяйства Российской Федерации
ФГБОУ ВО Саратовский ГАУ 
Кафедра _______________________________________________
Специальность 36.05.01 Ветеринария

                                                                                           УТВЕРЖДАЮ: 
                                                                                Зав. кафедрой 
_____________________ 
                                                                         «__» ________ 20___г. 

З А Д А Н И Е
НА ВЫПУСКНУЮ КВАЛИФИКАЦИОННУЮ РАБОТУ СТУДЕНТА

 __________________________________________________________________ 
(фамилия, имя, отчество)
1. Тема ВКР_______________________________________________________
__________________________________________________________________ 
__________________________________________________________________ 
утверждена приказом по университету от   «___» __________ 20___г. № ___ 
2. Срок сдачи студентом законченной ВКР_____________________________
3. Исходные данные к  ВКР__________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
4. Содержание  ВКР (перечень подлежащих разработке вопросов)__________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________ 
5. Дата выдачи задания на ВКР _____________________ 

Научный руководитель ВКР _________________             ______________
(подпись)                                 (фамилия и инициалы) 

Задание принял к исполнению ____________________     
(подпись студента)





КАЛЕНДАРНЫЙ ПЛАН

№ 
этапа
Краткое содержание работ по этапу
Сроки выполнения
Примечания


























































Студент-дипломник ________________________ 

 Руководитель ВКР  _________________________ 
















Оглавление
1.	Введение	5
2	Обзор литературы	8
2.1Адъюванты. Определение, типы, механизм действия и свойства	8
2.2 Эмбриотоксическое, гонадотоксическое, тератогенное и мутагенное действие, токсических веществ	11



























1. Введение

      На сегодняшний день в животноводстве самая главная задача— это обеспечение страны эффективными и безопасными ветеринарными препаратами. А актуальный вопрос в этой теме, изучение токсических свойств новых лекарственных средств.
      Актуальность этой проблемы состоит в том, что за последние годы ассортимент профилактических и лечебных препаратов, применяемыхв ветеринарии каждый год расширяется. Также увеличивается список предприятий, разрабатывающих новые препараты.
      Зачастую, создатели этих разработок не являются квалифицированными специалистами в области ветеринарии, вследствие чего предлагаемые препараты изучаются с большими погрешностями. Токсикологические исследования ограничиваются изучением острой токсичности, недостаточно исследуется токсикодинамика и токсикокинетика и возможные отдаленные последствия. У препаратов длительного применения (кокцидиостатики, стимуляторы продуктивности и другие) не изучаются сроки выделения из организма животных, устойчивость во внешней среде, кумулятивные, аллергенные, канцерогенные и другие побочные свойства.
      В связи с вышеизложенным, важным аспектом повышения качества препаратов является их оценка с точки зрения безопасности для животных на практике. Решение этой проблемы возможно лишь путем резкой интенсификации токсикологических исследований с использованием новых методов, позволяющих точно и быстро прогнозировать токсичность и опасность новых химических веществ и лекарственных средств. Особое внимание должно быть уделено токсикологической оценке с учетом иммунотоксической, эмбриотоксической, тератогенной, мутагенной и канцерогенной активности новых фармакологических средств различных групп (антибактериальных, антипаразитарных, стимуляторов продуктивности, кормовых добавок и других), что отражено в единых требованиях по испытанию и регистрации ветеринарных препаратов (протокол совещания руководителей ветеринарных служб стран-членов ООН, 1982).
      Разумеется, абсолютно безвредных веществ в природе не существует и даже при самом тщательном экспериментальном исследовании нового лекарственного препарата сохраняется элемент риска при введении его животному или человеку. Однако современный уровень развития лекарственной токсикологии позволяет прогнозировать появление нежелательного действия нового лекарственного средства в практике, если оно в должной степени охарактеризовано с точки зрения безопасности.
      Основой лекарственной токсикологии является оценка соотношения терапевтической ценности препарата и тех нежелательных эффектов, которые могут возникнуть при его применении. Это значит, что экспериментальное исследование безвредности нового лекарственного средства имеет в настоящее время не меньшее значение, чем оценка его фармакологической активности.
      В последние годы наметилась тенденция к созданию четкой регламентированной системы изучения новых лекарственных средств в отношении их токсичности, однако эта проблема требует не только организационного, но и чисто научного решения, особенно вопросы создания адекватных экспериментальных моделей, экстраполяции на сельскохозяйственных животных данных, полученных в опытах на лабораторных животных, выяснения отдаленных проявлений побочного действия лекарственных средств и др.
      Следовательно, успешное решение проблемы по обеспечению ветеринарии и животноводства высокоэффективными и безопасными лекарственными средствами во многом зависит от наличия единой методологии в проведении экспериментальных исследований на стадии изучения новых препаратов.
      Изучение токсикологических свойств лекарственных препаратов является сложной задачей, требующее применения фармакологических, токсикологических, биохимических, гематологических эмбриологических, онкологических, иммунологических и других методов исследований. Поэтому токсикологическая оценка новых препаратов проводится комплексно рядом с лабораторией или институтом.
      Таким образом, из большого количества препаратов, предлагаемых для испытания и последующего применения, необходимо отбирать наиболее качественные, эффективные и безвредные. Нельзя допускать к внедрению стойкие вещества, разлагающиеся в естественных условиях на нетоксичные компоненты позже чем через один год, а также образующие более токсичные и стойкие продукты превращения. Нельзя внедрять препараты с резко выраженной кумуляцией, длительное время задерживающихся в организме и выделяющиеся с молоком. Не должны внедряться лекарственные средства, которые могут привести к отрицательным отдаленным последствиям и обладающие резко выраженными аллергенными и другими побочными свойствами.






2 Обзор литературы
2.1Адъюванты. Определение, типы, механизм действия и свойства
     При разработке вакцин огромную роль уделяют как раз выбору адъювантов. Обращают внимание на результативность иммунологической памяти, избирательному транспорту иммуногенных антигенов в соответствующие ткани, отсутствие токсичности,которая может спровоцировать аллергические и аутоиммунные осложнения, способности к стимуляции иммунного ответа [40].
     В истории ветеринарии большое количество случаев с открытиями первых вакцин, но использование вакцин было усовершенствовано открытием адъювантов.
     Адъюванты применяют для увеличения иммуногенности высокоочищенных вирусныхибактериальных антигенов, рекомбинантных и синтетических антигенов,анатоксинов и др. [1].
     Адъюванты используются чаще всего в сильном, здоровом организме, а не как ни с целью нормализации измененной иммунной реактивности. Адъюванты применяются с целью увеличения формированияантител при иммунизации животных [46].
     Адъюва?нт(adjuvant) — это соединение или комплекс веществ, которое используется для усиления иммунного ответа при введении одновременно с иммуногеном. Адъюванты применяются в вакцинах уже на протяжении столетия.Слово «адъювант» от латинского «adjuvare», обозначает«помогать»,«усиливать».[40]
     В 1916 г. Моник и Пиной были опубликованыматериалы в которых говорилось о эмульсии минеральных масел способных повышать иммунный ответ на антигены [40].
Большой вклад в изучение адъювантов и иммуномодуляторов принадлежит Фрейнду, в 1936 г. был разработан полный адъювант Фрейнда, в структуру которого входили мертвые микобактерии в эмульсиииз минерального маслаиводы. Известный ученый Джонсонв 1950 г.выявил, чтоиз грамотрицательных бактерий липополисахариды или родственные соединения, такие как липид А, обладают иммуностимулирующим результатом[7]. Сегодня на стадии испытаний находится немало современных адъювантов, способных не только доставлять его в зонылокализации иммунокомпетентных клетокили усиливать поглощениеантигена, но и выступать в качестве непосредственных иммуноактиваторов.
      В статье Исаенко Е.Ю и его соавторов представлена классификация адъювантов, но она не является единой. Разделение происходит в зависимости от физико - химических свойств,механизмадействия и происхождения. Вот несколько групп выделенных авторами:
     1.Вещества, которые увеличивают иммунный ответ на иммуногенные белкикоторые вызывают Т-клеточный ответ;антиген, и адъюванты, которые считаются матрицей для антигенов. 
     2. Соли алюминия, минеральные добавки, бактериальные производные,транспортные препараты,поверхностно-активные веществаони высвобождают гормоноподобные пептиды или белки, секретирующиеся клетками иммунной системы–цитокины. 
     3. Белки или липопептиды,масляные эмульсии, адъюванты на основе геля, поверхностно-активные вещества. [14].
     
      
     
      
      Механизм действия адъювантов обсуждается в ряденаучных публикаций. Усиление иммунного ответа за счет действия адъювантов обусловлено воздействием указанных ниже факторов или их сочетанием:
- формированием ?депо? антигена, замедлением его всасывания;
- развитием воспалительной реакции в месте введениявакцины;
- защитой антигена от деградации и элиминации;
- изменением физико-химических свойств антигена (структуры, полимерности, растворимости и др.); 
- ускорением транспорта антигена к иммунокомпетентным клеткам;
- активацией компонентов системы врожденного иммунитета;
- усилением фагоцитоза и функции вспомогательных клеток;
- усилением процессинга и презентации антигена Т-клеткам;
- стимуляцией образования цитокинов, участвующих в развитии иммунного ответа;
- стимуляцией пролиферации, дифференцировки и функциональной активности Т-, В-клеток и их взаимодействия;
- активацией системы комплемента;
- усилением синтеза белков. [3]
      В зависимости от природы и свойств адъюванты могут стимулировать гуморальный или клеточный иммунитет, или одновременно оба вида иммунного ответа.[13] Наряду со стимуляцией гуморального и (или) клеточного иммунитета, адъюванты могут менять характер иммунного ответа. Например, низкомолекулярный антиген без адъюванта может вызвать толерантность или временную супрессию иммунного ответа, в то время как его введение в смеси с адъювантом вызывает, как правило, стимуляцию этого ответа. [11]
      С целью установления основного механизма действия адъюванта проводят исследования по оценке его иммунотропной активности, т.е. выявлению направленности и определению характера иммунного ответа при включении адъюванта в вакцинный препарат. Результаты проведенных исследований позволяют идентифицировать то звено иммунитета, на которое может воздействовать адъювант. Объем доклинических исследований по оценке иммунотропной активности и набор используемых методов определяются индивидуально в зависимости от природы и свойств адъюванта. [4]
      При изучении иммунотропной активности адъюванта используют комплекс апробированных методов для оценки влияния исследуемого препарата на гуморальный или клеточный иммунный ответ, компоненты системы врожденного иммунитета, фагоцитарную активность клеток, систему комплемента, функции антигенпрезентирующих клеток и систему цитокинов. [8]
      Как правило, изучение иммунотропной активности проводят в рамках исследования иммунологической безопасности препарата. Поскольку антигены, предполагаемые для включения в вакцины, различаются по физическим, биологическим и иммуногенным свойствам в каждом конкретном случае необходим подбор соответствующих адъювантов. Выбор адъюванта, включаемого в вакцину, должен быть обусловлен типом желаемого иммунного ответа. [9]
      Адъювант должен быть соединен с антигеном таким способом, чтобы обеспечить развитие оптимального типа иммунного ответа с минимальными побочными эффектами. Выбор адъюванта должен быть подтвержден соответствующими научными данными, обосновывающими включение адъюванта в состав вакцины. Результаты исследований позволяют установить оптимальное соотношение доз антигена и адъюванта. [10]























2.2 Эмбриотоксическое, гонадотоксическое, тератогенное и мутагенное действие, токсических веществ
      Отдельные токсические вещества при поступлении в организм животных вместе с кормом или в результате обработок могут отрицательно влиять на репродуктивную функцию животных, вызывая гонадотоксическое, тератогенное,эмбриотоксическое действие. По этой причине токсические вещества, которые могут поступать в организм животных с кормом постоянно или в течение определенного периода, должны подвергаться исследованию на эмбриотоксичность, тератогенность и гонадотоксичность. Также целесообразно исследовать на наличие этих действий некоторые лекарственные препараты и премиксы, если их используют многократно.Давайте рассмотрим подробнее каждое из действий. 
      Способность исследуемого вещества отрицательно действовать на развивающиеся эмбрионыэтоэмбриотоксическое действие. Методических подходов к определению эмбриотоксических свойств препаратов ветеринарного назначения нет.Нa первых этапах, по-видимому, целесообразно в качестве модели использовать белых мышей, так как опыты на сельскохозяйственных животных затруднительны из-за продолжительных сроков беременности и сравнительно небольшого числа особей в помете (за исключением свиней). Самкам белых мышей, в течение всей беременностидают с кормом или вводят внутрь, с помощью зондапрепарат. На 17—19-й день беременности, её устанавливают по результатам исследования вагинальных мазков, мышей убивают, подсчитывают число плодовместилищ, желтых тел в яичниках, мертвых и живыхплодов. Сравнивают результаты этих исследований в контрольной и опытной группах, устанавливают степень эмбриотоксической активности препарата. Часть беременных мышей из опытных групп оставляют для родов, при этом учитывают продолжительность беременности, число плодов, длину туловища новорожденных мышат, их массу, их развитие (увеличение длины и массы за определенный срок, покрытия шерстью, время открытия глаз, начала самостоятельного передвижения по клетке и поедания корма). Кроме того, учитывают выживаемость мышат, распределение их по полу. При этом отмечают: избирательную эмбриотоксичность — эффект проявляется в дозах, не токсичных для материнского организма; общую эмбриотоксичность — проявляется одновременно с развитием интоксикации организма матери; отсутствие эмбриотоксичности — эффект не отмечается при признаках интоксикации материнского организма. (Медведь, 1968).
      В том случае, если будет установлено, что исследуемые соединения обладают общей или избирательной эмбриотоксичностью, ставят опыты на животных, и прежде всего на свиньях. Препараты в зависимости от способа применения иих целевого назначения целесообразно давать с кормом, наносить накожно или вводить внутримышечно.
      А вот действие, при котором нарушается формирование плода в период его эмбрионального развитияэтотератогенное действие.Проявляется оно в виде уродств. Тератология как наука получила развитие после случаев с талидомидом — лекарственным препаратом, широко применявшимся беременными женщинами в Западной Европе в качестве снотворного и седативного средства. В результате было зафиксировано рождение детей с врожденными пороками развития.[3]
      Для того чтобы определить тератогенное действие пестицидов ,также проводят исследования на белых мышах. Для этого препарат животным вводят внутрь через 1 день в течение всей беременности. Часть животных опытных групп убивают на 17—20-й день беременности, часть оставляют до родов. При вскрытии убитых мышей определяют среднее число желтых тел на одну самку, нормально и ненормально развивающихся зародышей, а также резорбтированных плодов.
      При естественных родах учитывают число родивших самок, народившегося потомства, в том числе мертворожденных, устанавливают среднюю массу потомства, длину туловища, конечностей и другие морфологические особенности (Медведь, 1969).Тератогенное действие препаратов на сельскохозяйственных животных не изучают.
      При проявлении тератогенного эффекта возможны следующие уродства: отсутствие головного мозга (анэнцефалия); повышенное содержание цереброспинальной жидкости в желудочках головного мозга (гидроцефалия);расщепление первых дужек позвонков (спина бифида); мозговая грыжа (энцефалоцелия); недоразвитие головного мозга (микроцефалия).Кроме того, возможны аномальности в других органах: наличие одного глаза (циклопия); отсутствие конечностей (перамилия); отсутствие глаз (анофтальмия); волчья пасть; заячья губа; отсутствие хвоста; укорочение хвоста и др.
      Гонадотоксическое действие. 
       При исследовании изучили, чтогонадотоксическое действие химических веществ на организм может привести к нарушению оплодотворяющей способности и способности к зачатию, изменениям нормального внутриутробного развития плода, появлению мутаций в соматических и зародышевых клетках и т. д. 
В последние годы получены экспериментальные данные и эпидемиологические наблюдения, свидетельствующие о гонадотоксическом действии целого ряда компонентов полимерных материалов. 
И. В. Саноцкий и В. Н. Фоменко (1979) считают, что веществ, обладающих специфическим действием на половые железы (или непосредственный аппарат регуляции их функции), относительно мало.
      Также при изучении гонадотоксического действия устанавливают влияние исследуемого препарата отдельно на половую сферу самок и самцов. Опыты проводят на белых мышах. На самках исследуют действие препарата на астральныйцикл и овогенез, на самцах — на подвижность, морфологию, резистентность спермиев и сперматогенез.
      Эстральный цикл определяют, исследуя мазки из влагалища. Для этого глазной пипеткой вводят во влагалище подогретый физиологический раствор (2—3 капли), несколько раз пропускают его через пипетку, а затем вводят обратно во влагалище. После этой процедуры с помощью предметных стекол готовят мазки из влагалища, фиксируют их над пламенем и окрашивают в течение 1 мин 1%-ным водным раствором метиленовой сини. Мазок просматривают под микроскопом при малом увеличении.
      Различают следующие основные стадии эстрального цикла:
      фаза проэструса (предтечки) продолжается несколько часов и характеризуется преобладанием в мазках эпителиальных клеток; [5]
      фаза эструса (течки) продолжается 1—2 дня. В этой стадии в основном присутствуют ороговевшие полигональные клетки (чешуйки); [16]
      метэструс (послетечка) имеет длительность 1—2 дня и характеризуется присутствием наряду с чешуйками эпителиальных клеток и лейкоцитов; [5]
      фаза диэструса (фаза покоя между течками) характерна присутствием лейкоцитов и слизи. Продолжительность этой фазы равна половине всего цикла. [16]
      Изменение продолжительности стадий эстрального цикла или характера клеток на различных его стадиях является показателем действия исследуемого вещества.
      Для изучения действия химического вещества на овогенез готовят гистологические срезы из яичников и определяют стадии развития фолликулов в опытных и контрольных группах животных.
      При изучении гонадотоксического действия препаратов на самцов определяют соотношение подвижных и неподвижных форм спермиев, наличие патологических форм, их резистентность и фазы сперматогенеза.[5]
      Мутагенное действие. Некоторые химические вещества нарушают передачу генетической информации, вследствие чего возможно появление мутантов — особей с признаками, не свойственными данному виду. Поэтому изучение мутагенных свойств пестицидов и других химических веществ — один из необходимых этапов токсикологического исследования. В ряде стран с этой целью используется скрининговый тест — тест Эймса. В качестве тест-организма используются отдельные штаммы бактерий группы сальмонелл, высокочувствительных к химическим мутантам. При наличии потенциальной мутагенности у исследуемого химического вещества происходит расщепление генов и резко возрастает количество колоний на плотной питательной среде. Однако мутагенность химического вещества, выявленная с помощью этого теста, не может быть признана абсолютной, так как высшие животные имеют мощные защитные системы, которые предохраняютклетки, ответственные за передачу генетической информации, от воздействия внешних факторов, в том числе и химических веществ. Во многих случаях под действием ферментных систем химическое вещество может быть детоксицировано, прежде чем оно достигнет «мишени».

.......................