Обзор информационных источников

РОССИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ 



ФАКУЛЬТЕТАграрно- Технологический Институт

КАФЕДРА Департамент Ветеринарной Медицины




«К защите допускается»: Заведующий кафедрой

                       ______________________ «___»____________20__ г.



ДИПЛОМНАЯ РАБОТА

«Лимфома собак»
(название)











Выполнил Студент                                                                                                           Ф.И,О.

                                                                                                                                         (подпись) 


Научный руководитель                                                               Ф.И.О. Ученая степень, звание
                                                                                                                              (подпись) 




Москва, 2016



Оглавление
Введение	3
1.	Обзор информационных источников	4
2.	Собственные исследования	22




Введение
     
     Актуальность. В современном мире лимфосаркома (в общепринятом обозначении и далее- лимфома) одно израспротраненных и серьезных онкологических заболеваний. В среднем количество случаев лимфомы у собак составляет 30 особей на 100 000 собак. [Marconato L. etal., 2013]В основном случаи лимфомы зарегистрированы у собак среднего и старшего возраста. Но не все породы собак одинаково предрасположены к этому заболеванию. Например, высокая предрасположенность к этому заболеванию выявлена у Боксеров, Бульмастифов, Бернских горных пастушьих собак, Гордон сеттеров и Золотистых ретриверов. Низкая предрасположенность к заболеванию лимфомой была выявлена у Пикинесов, Той-пуделей, Такс, Йоркширских терьеров и Мопсов. [Teske E., 1994]
     Так же за последнее время было разработано много методик разной эффективности по лечению лимфомы. 
     Цели. Целью данной работы является дать характеристику понятию «Лимфома», определить, какие бывают виды лимфом, как их распознать, а так же на примерах собак с диагнозом «Лимфома» понять, как эффективнее лечить это заболевание.
     Задачи.
     1. Раскрыть понятие «Лимфома»;
     2. Дать характеристику понятию «Лимфома» и классификацию ее видов;
     3. Дать сравнительную характеристику методов лечения лимфомы;
     4. Разобраться, какая методика наиболее эффективна при лечении лимфомы.

1. Обзор информационных источников



     
     Лимфомы — это собирательное понятие, обозначающее все злокачественные опухоли из лимфоидной ткани, вызванные нарушениями в одном из лимфоцитов. Этот аномальный лимфоцит перестает подчиняться сигналам, регулирующим поведение нормальных клеток, и начинает безудержно делиться. Его дочерние клетки продолжают активно размножаться и накапливаться, образуя опухоль, заметную при осмотре или рентгенологическом исследовании.
     Для постановки окончательного диагноза лимфомы проводят биопсию, когда аномальные клетки будут изучены под микроскопом. Чаще всего неконтролируемое размножение лимфоцитов происходит в лимфатических узлах, которые при этом сильно увеличиваются. Аномальные лимфоциты могут скапливаться в костном мозге, селезенке и других органах: кишечнике, легких, головном мозге, коже, — а могут наводнять кровь.Лимфомы можно разделить на две основные группы: лимфомуХоджина и неходжинскуюлимфомы. Для краткости обычно говорят: лимфогранулематоз и лимфомы. Для лимфогранулематоза характерно стойкое увеличение какой-то группы лимфоузлов, чаще надключичной. Лимфоузлы безболезненны, плотные, не спаяны с кожей. У некоторых больных появляются боли в лимфоузлах после принятия алкоголя. В 20% случаев заболевание начинается с поражения лимфоузлов переднего средостения (область сразу за грудиной). [onkol.ru]
     Лимфома, или лимфосаркома, – это злокачественное новообразование, возникающее в отдельных органах из лимфоидной ткани (лимфатических узлах, печени, селезенке, коже и других органах). Лимфому необходимо отличать от лимфоидного лейкоза (лимфоидной лейкемии), заболевания, первично возникающего в костном мозге. В некоторых случаях их крайне сложно дифференцировать.
     Лимфосаркома - одна из самых распространенных онкологических болезней собак и кошек. У собак данный тип неоплазии составляет от 7 до 24% всех опухолевых процессов. Лимфосаркома у кошек встречается почти в 2 раза чаще, чем у собак, составляя около 1/3 всех опухолей.
     Этиология
     Молодые кошки с лимфомой, как правило, оказываются FeLV-позитивными, то есть имеют вирус лейкоза кошек, в то время как другие обычно FeLV-негативны. Вирус иммунодефицита (FIV) также в шесть раз повышает риск развития лимфомы.
     У собак не было отмечено какого-либо специфического этиологического агента. Однако отмечают некоторую породную предрасположенность. Например, боксёры, бассетхаунды, ротвейлеры, кокер-спаниели, сентбернары, эрдель- терьеры, золотистые ретриверы и некоторые другие.
     В зависимости от времени обращения в клинику, можно выделить два пика заболевания. Первый наблюдается у котов в возрасте около 2 лет, второй – у котов в возрасте 10-12 лет. Первые обычно оказываются FeLV-положительными, вторые – преимущественно отрицательными. Лимфома у собак характерна преимущественно для особей в возрасте от 6 до 12 лет
     Клиническая картина
     У собак наблюдаются следующие симптомы: общее недомогание, слабость, анорексия (отказ от еды), повышение температуры, симметричное и безболезненное увеличение лимфоузлов (чаще всего в первую очередь подчелюстных, а также предлопаточных, подколенных, средостенных и брыжеечных), которые в ряде случаев достигают значительных размеров. В дальнейшем возникает кахексия (исхудание) и ослабление иммунной защиты (присоединение инфекции). При ультразвуковой диагностике обычно обнаруживают увеличение селезенки и печени (гепатоспленомегалия), выпоты в брюшную полость (асцит), утолщение стенки кишечника, что клинически может проявляется рвотой и диареей. По R-диагностике грудной полости, часто выявляют увеличение средостенных лимфоузлов, возможен плевральный выпот.
     Лимфома у кошек сопровождается примерно теми же симптомами, что и у собак: апатия, анорексия, нежелание двигаться, кахексия.
     В зависимости от локализации выделяют четыре анатомические формы лимфомы:
     1. Мультицентрическая – характеризуется генерализованнойлимфаденопатией; могут быть вовлечены печень, селезенка, костный мозг. У собак лимфосаркома данной формы встречается чаще. Часто владельцы приводят животное, у которого в процессе стрижки были обнаружены подкожные новообразования, при это животное может чувствовать себя нормально.
     2. Медиастинальная – характеризуется медиастинальной лимфаденопатией; может быть вовлечен костный мозг. Частой причиной обращения в клинику становится недавно начавшийся кашель, нарушение дыхания, у кошек рвота. У собак могут отмечать полиурию и полидипсию.
     3. Алиментарная – характеризуется единичной, диффузной или мультифокусной инфильтрацией желудочно-кишечного тракта; могут быть вовлечены внтуриабдоминальные лимфатические узлы. Признаки: рвота, диарея, истощение. Часто образование можно пропальпировать. В основном поражается тонкая, слепая и ободочная кишка. Преобладает у кошек. ВЛК-тест положительный у 30% кошек. Встречается довольно часто. Средний возраст 7-8 лет.
      
       [vetclub.ru]
     4. Экстранодальная (то есть вне лимфатических узлов) – при поражении любого органа или ткани. Могут быть поражены почки, нервная ткань, кожа, глаза и другие органы. Клинические симптомы сильно варьируются в зависимости от поражённой ткани. У собак одной из наиболее распространённых форм экстранодальнойлимфомы является кожная.
       [biocontrol.ru]
     
     
     
     
     
     
     
       [УЗИ правой почки у собаки]
     
     
     
     
     

     Лабораторная диагностика
     Включает в себя анализы крови (общий и биохимический), аспирационную биопсию (тонкоигольная пункция – цитология) и гистологию (забор полнослойного тканевого биоптата проводится хирургическим путем).
     В общем (клиническом) анализе крови часто обнаруживают признаки анемии (снижение количества эритроцитов), тромбоцитопении (понижение тромбоцитов), лейкоцитоза (увеличение лейкоцитов) или лейкопении (снижение лейкоцитов). В биохимическом - увеличение трансаменаз печени, гаммаглобулинов, щелочной фосфотазы, ионизированного кальция.
     Анализы крови, как правило, показывают общие изменения. И только в некоторых случаях (на последней стадии процесса) могут обнаруживаться бластные (незрелые) клетки с признаками атипии даже в общем анализе крови. Прогноз для таких животных неблагоприятный.
     Цитология - это анализ отдельных клеток или небольших групп клеток, взятых с поверхности опухоли (методом отпечатка) из различных выпотов или путем пункции новообразования.
     Проводят цитологию довольно часто, так как это просто, быстро и из анализа отдельных клеток можно получить достаточно значимую информацию. Она позволяет определить доброкачественна или злокачественна опухоль, в некоторых случаях ее видовую принадлежность. Также, это исследование позволяет разделять опухоли на гистогруппы (например, отличать карциномы от сарком).
     Цитология – достаточно простой (для клинициста и владельца) и быстрый метод диагностики. Результат может быть готов за 1 день, в отличие от гистологии, время проведения которой составляет около 10 – 14 дней.
     Техника выполнения проста: проводится тонкоигольная пункция образования обыкновенным шприцем, в котором создается разряженное пространство путем оттягивания поршня. В дальнейшем содержимое иглы выдувается на предметное стекло. Это и есть аспирационная биопсия. Выполняется она на приеме, без седирования животного. Положительного результата по цитологии достаточно для назначения лечения, например, венерической саркомы или лимфомы.
     Но надо помнить, что клетки в цитологических препаратах могут не иметь никакого отношения к своему окружению внутри опухоли ее архитектонике. Поэтому в сомнительных случаях и случаях, когда необходимо знать полную информацию о новообразовании, выполняют гистологию.
     Гистология выполняется при невозможности выполнить пункцию (труднодоступные места) или в связи со сложностью интерпретации результатов. Также она осуществляется при необходимости определить тип лимфосаркомы (Т или В) и степень злокачественности (дифференцировка клеток). В зависимости от места взятия материала процедура проводится под седацией или наркозом.
     В некоторых случаях проводят пункцию костного мозга (под наркозом).
     Диагноз лимфомы у собак подтверждается морфологическим исследованием: цитологическим или гистологическим анализом. Несмотря на то, что у человека золотым стандартом диагностики лимфомы является гистологическое исследование, у собак оно проводится редко в связи с инвазивностью процедуры взятия биопсии.
     Цитологический анализ материала, полученного при тонкоигольной аспирационной или неаспирационной биопсии, позволяет в большинстве случаев получить репрезентативную популяцию опухолевых клеток и поставить диагноз лимфомы. Для цитологической оценки и классификации лимфомы удобно использовать модифицированную классификацию по Kiel [Fournel-Fleury C. etal., 1997].
     Лимфомы, которые при микроскопии содержат преобладающую популяцию из лимфоидных клеток средних и крупных размеров со средним или высоким митотическим уровнем, категоризируют как крупноклеточные низко дифференцированные. С другой стороны, если в препаратах преобладают мелкие лимфоидные клетки и содержится малое или среднее количество митозов, то лимфому классифицируют как мелкоклеточную высоко дифференцированную.
     Согласно проведенным исследованием, случаи низко дифференцированных лимфом у собак преобладают, составляя около 75 % всех лимфом у данного вида животных [Ponce F. etal., 2010]. Диагноз крупноклеточной низко дифференцированной лимфомы может быть аккуратно поставлен при цитологическом исследовании, тогда как высоко дифференцированные мелкоклеточные лимфомы редко могут быть диагностированы только с помощью цитологического анализа без дополнительного иммунофенотипирования, например, с помощью проточной цитометрии, или при использовании генетических методов (таких, как PARR).
     Гистологическое исследование незаменимо в том случае, когда цитологический анализ не позволил поставить диагноза или в случае, когда для постановки окончательного диагноза необходима оценка архитектоники лимфатического узла или другой ткани, в особенности, для случаев мелкоклеточных высоко дифференцированных лимфом. Кроме того, необходимо отметить, что, несмотря на важную информацию о клеточном составе и дифференцировки лимфомы, которую дает цитологическое исследование, окончательный морфологический тип лимфомы может быть поставлен только на основании гистологического исследования с иммунофенотипированием.
     Полноценное стадирование также включает проведение визуальной диагностики, клинический и биохимический анализы крови и биопсию костного мозга для оценки степени инфильтрации. Биопсия костного мозга рутинно не проводится у собак, однако она может быть показана животным с гематологическими нарушениями и в случае выявления в мазках венозной крови атипичных лимфоидных клеток, поскольку известно, что их циркуляция не всегда говорит об инфильтрации лимфомой костного мозга.
     Морфологическая классификация ВОЗ лимфомы собак включает более 30 различных подтипов лимфом, которые разделяются на В-клеточные и Т-клеточные лимфомы и включают целый спектр новообразований от опухолей с неагрессивным биологическим поведением (индолентныелимфомы) до резко агрессивных лимфом с низким уровнем выживаемости. Преобладающим типом лимфомы у собак является диффузная В-крупноклеточная лимфома (по классификации Kiel соответствует центробластной полиморфной или иммунобластнойлимфомам). В целом, количество В-клеточных лимфом составляет более 65 %, тогда как Т-клеточные лимфомы встречаются примерно в 35 % случаев [Ponce F. etal., 2010]. Среди Т-клеточных лимфом преобладают низко дифференцированные лимфомы, тогда как на высоко дифференцированные формы приходится небольшой процент, который включает также лимфомы кожи (так называемый «грибовидный микоз кожи»).
     Уже около десятилетия назад при сравнении выживаемости собак с Т- и В-клеточными лимфомами было показано, что Т-иммунофенотип является независимым фактором неблагоприятного прогноза [Kiupel M. etal., 1999]. В дальнейшем при изучение ответа различных типов лимфом на стандартный протокол полихимиотерапии, включающий винкристин, циклофосфамид, доксорубицин, L-аспрагиназу и преднизолон, было показало, что и различные типы В- и Т-клеточных лимфом по-разному отвечают на лечение с различиями не только в сроках выживаемости, но и в проценте полных и частичных ремиссий [Ponce F. etal., 2004]. Несмотря на то, что стандартные протоколы СНОР дают хороший процент ответов при В-клеточных лимфомах, опухоли с Т-клеточным иммунофенотипом, как правило, плохо отвечают на лечение, что проявляется в малом количестве полных ремиссий. Таким образом, применение СНОР протокола у собак с Т-клеточными лимфомами может быть не показано, и необходимо исследовать другие протоколы для повышения выживаемости и процента ремиссий у данных животных [Marconato L. etal., 2013].
     В целом, последнее десятилетие охарактеризовалось резкой интенсификацией исследований в области диагностики и лечения собак с лимфомами, что подтверждается многочисленными публикациями в данной области. Несмотря на то, что вклад каждого отдельного типа лимфом из более чем 30 еще предстоит выяснить, вопрос том, что один режим химиотерапии подходит всем собакам с диагнозом «лимфома» уже давно устарел.
     
     Диагноз
     Устанавливается комплексно: на основании анамнеза (рассказ владельца), клинической картины, данных визуальной диагностики (рентген, узи) и лабораторного исследования (общий, биохимический анализ крови, цитология из новообразования или лимфоузла).
     Лечение
     Болезнь неизлечима. Цель лечения – достижение ремиссии и ее продление на максимальный срок, а при рецидиве – достижение новой ремиссии с использованием новой схемы лечения (химиотерапия). Эффективность лечения и длительность ремиссии зависит от возраста пациента (чем моложе животное, тем лучше прогноз) и общего состояния на момент обращения (стадия процесса).
     В большинстве случаев лечение имеет смысл. Его проведение на данный момент довольно хорошо отработано и изучено, а животное при этом выглядит и чувствует себя обычно т.е. оно социально.
     Например, без лечения пациент (собака) проживает до 2х месяцев (с момента обращения и постановки диагноза), а с лечением в среднем 7- 10 месяцев. Около четверти больных живут до 1,5 – 2-х лет. Ремиссия достигается у 60 – 90%..
     Что касается кошек, то ремиссия достигается у 80%, средняя продолжительность жизни составляет 5-6 месяцев (без лечения до 1- го месяца). 25 – 30 % кошек могут иметь долговременную ремиссию (около 1 года). [Португейс А. А. БиоВет]
     Основным методом лечения болезни является химиотерапия. Необходимо помнить, что лимфома относится к числу неизлечимых патологий, и весь комплекс лечебных мероприятий в большей степени направлен на улучшение качества жизни и увеличение ее продолжительности. Химиотерапия может быть использована в качестве основного способа лечения или может быть дополнена другими методами, такими, как оперативное лечение или лучевая терапия, в зависимости от локализации процесса и максимального объема опухолевой массы, степени распространенности опухоли (стадия процесса), морфологического варианта и агрессивности течения, наличия или отсутствия интоксикации (А и В подтип); индивидуального прогноза, первичной резистентности (нечувствительности) к химиотерапии.
     
     Для лечения злокачественных лимфом собак и кошек в настоящее время введено в практику достаточно большое количество химиотерапевтических препаратов, которые вводятся как в монорежиме, так и в комбинированных схемах. Наиболее эффективными в лечении лимфомы являются такие препараты, как доксорубицин, циклофосфан, винкристин, L – аспарегеназа.[к.б.н. Якунина М.Н. — президент ИРСО (Институт Развития Сравнительной Онкологии), БиоКонтроль]
      
      
      Представитель FLT-ПЭТ / КТ собаки с неходжкинскойлимфомой до и после GS-9219 лечения. FLT-ПЭТ / КТ до (А) и 5 ??дней после однократного 0,66 мг / кг дозы GS-9219 (В) в собаке с этапа V, В-клеточной неходжкинскойлимфомы. Третье сканирование было сделано 3 недели после завершения пяти циклов GS-9219 (С). Внизу, всего тела FLT-ПЭТ / КТ в трех временных точках; сверху, поперечное сечение FLT-ПЭТ / КТ. Всего тела ПЭТ до начала терапии (A) показывает значительный пролиферативный ответ в пораженных лимфоидных тканей (подколенные, мезентериальных, средостения, prescapular, подчелюстных лимфатических узлов и селезенки). Обратите внимание, что сигнал в мочевом пузыре и почечных чашечек является нормальным и представляет собой выделение с мочой трейсера. Сигнал низкого уровня присутствует в позвоночном костного мозга и желудочно-кишечного тракта и отражает фоновое поглощение трассера в пролиферирующих популяциях клеток в этих тканях. Сканы повторяется 5 D после начальной терапии (B) и 3 недели после завершения всех циклов обработки (C) четко указывают на биологическую реакцию, как измерено существенно уменьшенную поглощение трассера; обратите внимание, что биологические предшествует полной анатомической реакции при сравнении 5-d сканирование после лечения (В) с, что при завершении химиотерапии (C).
      
      
      

2. Собственные исследования

     История: Т-клеточную лимфому собак (ТКЛ) считают очень опасным заболеванием, но некоторые формы гистологически и клинически проявляют себя очень слабо. Как известно, CD4+ ТКЛ является наиболее распространенным подтипом Т-клеточных лимфом. Ученые оценили потоковые цитометрические и гистологические особенности, и, по возможности, исходы CD4+ ТКЛ чтобы понять, сможет ли такая потоковая цитометрия использоваться для дальнейшей классификации этой группы лимфом.
     Цель: проверить гипотезу о том, что CD4+ Т-клеточная лимфома собак (ТКЛ) представляет собой однородную группу лимфом с агрессивным клиническим течением.
     
Животные: шестьдесят семь собак с диагностированным СД4+ ТКЛ при помощи метода проточной цитометрии, прошедшие лечение в одной из трех клиник. 
     Методы: ретроспективный многофакторный анализ результатов СД4+ Т-клеточной лимфомы собак,включая характеристики пациента, лечение, показатели проточной цитометрии.
     Результаты: большинство клеток CD4+ ТКЛ были СД45+, выраженны низким II МНС, и проявили себя агрессивным клиническим течением, независимо от схемы лечения (средняя продолжительность жизни- 159 дней). Гистологически, СД4+ ТКЛ была классифицирована по лимфобластным или периферическим Т-клеткам. Размер опухолевых лимфоцитов имел небольшое влияние и на ПНН и выживаемость в данной группе. Небольшое количество клеток CD4+ ТКЛ были СD45! и высоким II класса МНС, и отличились более плавным течением (средняя продолжительность жизни не выявлена).
     Выводы и клиническое значение: хотя большинство СD4+ ТКЛ собак были схожи клинически и по характеристикам проточной цитометрии, а так же в агрессивном клиническом течении, у небольшой части выявили уникальный иммунофенотип, что предсказывает значительно большую продолжительность жизни. Этот вывод указывает на большую пользу проточной цитометрии для идентификации лимфом собак. 
     Ключевые слова: дисплазия; иммунофенотипирование; лимфолейкоз; периферические Т-клетки; прогноз.
     Лимфома является наиболее распространенным гематологическим заболеванием собак и подразделяются на Т – и В-клеточный фенотип. Т-клеточный подтип характеризуется более агрессивным клиническим течением. При дальнейшем разделении в пределах Т-клеточного фенотипа определяются важные подтипы, связанные с агрессивным течением (полиморфная, смешанная/периферическая Т-клеточная, плазмоцитарная, Т-клеточная лимфобластная) и вялотекущим течением (малые неизмененные летки/ лимфома Т- зоны). Такое различие, сделанное на основе гистологического исследования образцов тканей, очень важно в прогнозе течения болезни, и в рациональном выборе протокола химиотерапии.  
     Сокращения:
ЛБТ- лимфобластная Т-клеточная лимфома
МИФ- средняя  интенсивность флуоресценции
ОВ- общая выживаемость
ИП- интервал прогрессирования 
НПТК- неспецифические переферические Т-клетки
ТКЛ- Т-клеточная лимфома
     Проточная цитометрия является важнейшим инструментом в медицине человека для диагностики и классификации случаев лимфомы. Несмотря на расширение роли диагностики в ветеринарной медицине, существует несколько случаев описаний проточной цитометрии для характеристики лимфомы собак.
     По опыту авторов, CD4+ Т-клеточная лимфома (ТКЛ) является наиболее распространенным Т-клеточным иммунофенотипом, увиденным в аспирате из периферических лимфатических узлов собак, и это согласуется с двумя небольшими циклами исследований случаев TCL собак. В очень небольшом ряде случаев в цитологической классификации по Килю СД4+ ТКЛ были описаны как небольшие прозрачные клетки/Т-зона, лимфобластные, и смешанные полиморфные клетки/периферические Т-клеточные подтипы. При исследовании лимфом у собак породы боксер в >80% случаев они были Т-клеточного происхождения и большинство из них было CD4+ фенотипа. Эти исследования и более широкое исследование лимфомы собак показало, что появление CD4+ фенотипа ассоциировано с агрессивным клиническим течением, но по мнению авторов, нет исследований описывающих большое число случаев ТКЛ собак на основе СD4+ иммунофенотипа. Цель настоящего исследования заключалась в дальнейшей классификации СD4+ ТКЛ собак с поражением периферических лимфатических узлов путем изучения клинических характеристик, параметров проточной цитометрии, связанные с клиническим исходом, и по возможности гистологическая классификация.
     Материалы и методы
Отбор
     
Дела, представленные в лабораторию клинической иммунологии Университета штата Колорадо в срок с 1 января 2008 по 1 февраля 2012 года составили группу больных для данного исследования. Из них 168 соответствовали критериям включения, которые были следующими: (1) цитологический или гистологический диагноз лимфома; и (2)  >65% крупных клеток или >80% всей популяции клеток, выделяющих СД4. Сорок процентов этих случаев (67) были получены из 3 специализированных клиник, остальные 57 из других клиник. Из-за сложности в последовательном клиническом наблюдении в нескольких клиниках, 67 случаев из 3 специализированных центров были выбраны для дальнейшего анализа. Выбранные 67 случаев для последующей работы практически не отличались от оставшихся 101 случаев с учетом возраста, породы, пола, и наличия отдельных клинических характеристик (табл. 1). Данные, извлеченные из медицинских записей, включают возраст пациента, пол, породу, дату постановки диагноза, дату начала лечения, промежуточные тесты, наличие гиперкальциемии при диагностике, клиническую стадию, протокол лечения, время до начала прогрессирования заболевания, и дату смерти.
     
     Проточная Цитометрия
     
Образцы были представлены на основе пальпируемой периферической лимфаденопатии. Несколько тонкоигольных аспираций из лимфатических узлов помещали в изотонический солевой раствор с 10% сывороткой крови собак и были сразу обработаны или транспортированы на льду. Образцы лимфоузлов готовили, как описано ранее. Суспензию из лимфатического узла центрифугировали и ресуспендировали в 1 мл литического буфера (0,15 М раствором nh4cl, 1 м KHO3, 0,1 мм растворов na2 ЭДТА, 1 Н HCl при рН 7.2-7.4) в течение 5 минут при комнатной температуре. Затем образцы центрифугировали, лизировали второй раз, и ресуспендировали в 200 лл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) 2% эмбриональной бычьей сыворотки (ЭБС). Использовался 96-луночный планшет, в котором 25 лл суспензию клеток распределяли по индивидуальным лункам, затем добавляли 25 лл одной из комбинаций антител. Комбинации антител были (1) Нет (none), (2) м IgG1-FITC/СД45-ЧП, (3) CD18-FITC/М IgG1PE, (4) Количество CD4-FITC/СД8-пе, (5) СD5-FITC/CD21-ПЭ, (6) CD3FITC/СД45-ПЭ, (7) Количество CD4-FITC/CD14-PE, и (8) МНС класса II-FITC/СD34-ПЭ. Образцы инкубировали 15 минут при комнатной температуре и затем дважды промывали. Затем образцы ресуспендировали в pbs-2% FBS с 10 в LG/мл пропидия йодида (ПИ) для удаления мертвых клеток и были проанализировали в течение 1 часа. Образцы с >50% ПИ-позитивных клеток были исключены из дальнейшего анализа. Образцы были помещены в проточный цитометрCoulterXL. Все данные анализа была проведены с помощью програмного обеспечения Kaluza.

     Иммуногистохимия и Гистологическая Классификация
Для иммунофенотипирования образцы тканей из 5-лм секции формалин-фиксированных и залитых в парафин были вырезаны и иммунизированы с использованием антител, направленных против антигена CD3 Т-клеток (клон LN10c ) или либо Pax5 или антиген CD79a  в-клеток (клон ДЭК-Pax5 и HM57d). Депарфинизация, поиск антигена, иммуногистохимическое (ИГХ) окрашивание, были выполнены на BondmaXAutomatedStainingSystem с помощью BondPolymerDetectionSystem. Извлечение антигена было проведено на линии с помощью BondEpitope.
     Биопсии были доступны в 15 случаях. H&E, также как и IHC из этих 15 случаев, и еще дополнительно 13 случаев Т-клеточной лимфомы с другим иммунофенотипом (сопутствующее исследование, Seeligetale) были рассмотрены двумя сертифицированными ветеринарными патологоанатомоми (D.M.S. и E.J.E.) и классифицированны в соответствии с критериями ВОЗ. На момент исследования, патологоанатомы не знали результатов проточной цитометрии и клинические данные. Для постановки диагноза патологоанатомы использовали ранее описанные гистологические и иммуногистологические критерии.
     
     Анализ Данных
     
Интервал не прогрессирования (ПФИ) и общего выживания (ОВ) были рассчитаны в днях с момента начала лечения до тех пор, пока болезнь прогрессировала или наступала смерть, соответственно. Собаки, выжившие на момент анализа данных или потерянные для последующего наблюдения, были исключены из анализа в последний день. Собак, которые умерли или были усыплены считали вторично погибшими в результате лечения или болезни. Собак, которых лечили только преднизолоном, были исключены из анализа, поскольку лечение не давало результатов в снятии клинических признаков. Клинические данные на момент проявления, в том числе реакция на раздражители, вес, наличие гиперкальциемии, визуализация и оценка медиастинальных масс и клинической стадии в дальнейшем были использованы для анализа их влияния на ИНП и выживаемость. Если такая информация отсутствовала, то пациент не был включен в общий поиск и был исключен из анализа. Кроме того, демографические данные пациентов, включая возраст собаки, пол, породу, и лечащую клинику рассматривали в качестве возможных дополнительных факторов.
Описательные статистики были подсчитаны для всех переменных, собранных на основном этапе. Возраст на момент постановки диагноза был усреднен для всех одно - и многофакторных анализов. Лонгранговый критерий и график Каплан-Мейера использовались, чтобы оценить, является ли любая базовая переменная связанна с ИНП или выживаемостью. Многофакторные анализы пропорциональных рисков выполнялись в обратной последовательности своеобразной лесенкой. Первоначальная модель была построена во всех потенциальных прогностических переменных значения с p <20 на унивариабельности анализа, а также возможных дополнительных факторов: порода, клинические проявления и лечение. Выбор проводился до тех пор, пока все оставшиеся переменные имели значения Р <0.5. Наконец, повторный анализ был проведен с последовательным добавлением прогностических показателей по одному, чтобы определить, являются ли они значимыми был проведен многофакторный анализ; только существенные переменные остались в окончательной модели. За исключением случаев, когда указано иное, все статистические анализы были выполнены с помощью SAS 9.2 и значения F и p <0.5 считали статистически значимыми.
     Результаты
Цитометрическая характеристика
Шестьдесят один из 67 СD4-позитивных случаев характеризовались равномерной экспрессей cd3, СД45, низким уровенемmhc класса II (средняя интенсивность флуоресценции [МФО] 1.2), и отсутствуем выделения CD21 (далее именуется СД4+/СД45+). Выделение СD5 менялось в этой группе: в 26 случаях определена нехватка выделения СD5, в то время как в 34 СD5 были равномерно положительные. Средний процент СD5+ клеток в тех случаях классифицировался как нехватка СD5, это значение составило 2,1% (в диапазоне 0-20%). В оставшихся 6 случаях имели место уникальные фенотипические особенности, характеризующиеся высокой mhc класса II (22 МФО), коэкспрессией CD21 и снижением выделения СД45 (далее именуется СД4+/СД45!; Рис. 1). Средний процент клеток отрицательных для cd45 составил 96 % (в диапазоне 93-98%), в то время как средний процент клеток, положительных для CD21 составила 94% (диапазон 60-97%). Все 6 из этих случаев равномерно экспрессировали как cd3 так и СD5.
     Гистологическая характеристика
     Биопсии 15 случаев СД4+/СД45+ были доступны для исследования. Результатом гистологической классификации в 10 случаях стали периферические неспецифические Т-клетки (PTCL), тогда как оставшиеся 5 случаев были классифицированы как лимфобластные Т-клетки (ЛБТ; Рис. 4). Все пораженные лимфатические узлы характеризовались разлитым распространением опухолевых клеток. Периферических неспецифические Т-клетки и ЛБТ были дискриминированы в первую очередь на основе размеров клеток (среднего размера клетки в lbt и от среднего до крупного размера клетки в PTCL), степень полиморфизма (минимальная в lbt и высокая в PTCL), и количество митотических фигур (распространенный в lbt и редкие в PTCL). Не было никаких различий в презентации или в клинических результатах между 2 группами, но малый размер выборки может иметь исключения при обнаружении разницы. Все собаки с доступной тканью имели агрессивное клиническое течением (средняя ИНП = 85 дней, средняя выживаемость = 155 дней). Биопсии были не доступны ни для одной из 6 собак с СD4+/СД45! при цитометрическом окрашивании рисунка.
     Собачьи лимфом представляют собой разнородную группу раковых заболеваний, и являются одними из наиболее распространенных видов рака, диагностированных у собак. Они в совокупности составляют примерно 7-14% всех случаев заболевания раком, диагностированных у собак. Есть более 30 описанных видов собачьих лимфомы, и эти виды рака сильно различаются в своем поведении. Определенный прогресс быстро и остро опасным для жизни без лечения, в то время как другие прогрессировать очень медленно и управляются как хронических, праздного заболеваний. Лимфома может повлиять на любой орган в организме, но чаще всего возникают в лимфатических узлах, прежде, чем распространиться на другие органы, такие как селезенка, печень и костный мозг.
     Собачьи лимфом похожи во многом лимфом в неходжкинской (НХЛ), которые происходят в организме человека. Canineлимфомы и НХЛ почти неразличимы при микроскопическом исследовании, и оба типа опухоли демонстрируют сходные ответы на химиотерапию. В 2010 году был поставлен диагноз НХЛ примерно 65 000 человек в Соединенных Штатах, и утверждал, около 20 000 жизней, что делает его 7-го наиболее распространенной формой рака в целом, а также 6-й наиболее частой причиной связанной с раком смерти. Это одна из немногих злокачественных опухолей человека, для которых частота вновь выявленных случаев все еще находится на подъеме. Мы надеемся на то, что исследования в собачьих лимфом, проводимых по программе Purdue сравнительной онкологии обнаружат новые способы лечения НХЛ как у собак и людей. Наша цель состоит в том, чтобы улучшить прогноз для собак и людей, страдающих этим все слишком распространенным раком.
     Термин «лимфома» описывает различные группы раковых заболеваний у собак, которые получены из белых кровяных клеток, называемых лимфоцитами. Лимфоциты обычно функционируют как часть иммунной системы, чтобы защитить организм от инфекции. Хотя лимфома может повлиять на практически любой орган в организме, это наиболее часто возникает в органах, которые функционируют как часть иммунной системы, таких как лимфатические узлы, селезенка и костный мозг. До сих пор наиболее распространенный тип лимфомы у собак является многоцентровое лимфома, в которых рак впервые становится очевидным, в лимфатических узлах. На фото справа показывает собаку с многоцентровое лимфомы. Обратите внимание на опухшие нижнечелюстной лимфоузел (белая стрелка) под челюстью.
     Другие распространенные лимфомы у собак включают кожную лимфому (лимфома кожи), алиментарный или желудочно-лимфома (лимфома желудка и / или кишечника) и средостения лимфома (лимфома с участием органов внутри грудной клетки, такие как лимфатические узлы или вилочковой железы).
     Что вызывает лимфомы у собак?
     К сожалению, причиной лимфомы у собак не известна. Хотя несколько возможных причин, таких как.......................