Технология получения газовых скф-экстрактов, обладающих антибиотической активностью, растений флоры

Министерство образования и науки Российской Федерации
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего образования
«Алтайский государственный университет»
Биологический факультет
Кафедра экологии, биохимии и биотехнологии


ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГАЗОВЫХ СКФ-ЭКСТРАКТОВ, ОБЛАДАЮЩИХ АНТИБИОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ, РАСТЕНИЙ ФЛОРЫ АЛТАЙСКОГО КРАЯ
Выпускная квалификационная работа
(бакалаврская работа)



Выполнила: студентка 4 курса 742 группы БФ Колоскова А. А.
__________________

Научный руководитель 
к.б.н., доц. Иванова М. С.
____________________
Допустить к защите:
зав. каф. экологии биохимии и биотехнологии, 
д.б.н., проф. Соколова Г. Г.
______________________   
“____” _____________ 2018 г.
Выпускная квалификационная работа защищена
“____” _____________ 2018 г.
Оценка ________________


Председатель ГЭК
д.б.н. Мочалова О.В. 
________________________                   

Барнаул – 2018

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………………
ГЛАВА 1. ПРИМЕНЕНИЕ СКФ-ТЕХНОЛОГИЙ И ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЭФИРОМАСЛИЧНЫХ РАСТЕНИЙ…
     1.1. Развитие СКФ-технологий в мире и их использование в фармацевтической промышленности…………………………………………….
     1.2. Характеристика биологически активных веществ эфирных масел…
     1.3. Механизм антибактериальной активности эфирных масел…………
         1.3.1. Эффективность эфирных масел в качестве сырья для лекарственных препаратов………………………………………………………...
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ……………………
     2.1. Материалы исследований………………………………………………
         2.1.1. Общая характеристика исследуемых микроорганизмов……...
     2.2. Методы исследования………………………………………………….
         2.2.1. Методы сбора и сушки растительного материала…………….
         2.2.2. Метод сверхкритической флюидной экстракции……………...
         2.2.3. Микорометод серийных разведений……………………………
         2.2.4. Калориметрический микропланшетный резазуриновый анализ……………………………………………………………………………….
ГЛАВА 3. ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГАЗОВЫХ СКФ-ЭКСТРАКТОВ ОБЛАДАЮЩИХ АНТИБИОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ………………….
     3.1. Выявление биологической активности СКФ-экстрактов на штаммах исследуемых микроорганизмов………………………………………………………
         3.1.1. Антибиотическая активность A. asiatica в зависимости от условий экстрагирования…………………………………………………………..
         3.1.2. Влияние температуры и давления на выход экстракта……….
ВЫВОДЫ…………………………………………………………………………..
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК…………………………………………….

ВВЕДЕНИЕ

     Устойчивость к противомикробным препаратам представляет собой большую угрозу для современной медицины, затрудняя контроль над инфекционными болезнями, увеличивая заболеваемость и смертность. Широкое внедрение антибиотиков в ветеринарную и медицинскую практику привело к тому, что резистентность к антибактериальным препаратам формируется практически у всех патогенных и условно патогенных бактерий. Ежегодно от инфекций, вызванных резистентными бактериями, гибнет десятки тысяч пациентов. Антибиотикорезистентность определена Всемирной организацией здравоохранения как глобальная проблема, требующая незамедлительного решения (Leung et all., 2011). Возникает необходимость поиска новых эффективных лекарственных средств, представляющих перспективную альтернативу существующим антимикробным средствам для преодоления дальнейшего развития резистентности бактерий.
     При применении антибиотиков в течение продолжительного времени снижаются механизмы защиты, что чревато развитием самых различных патологий. Они подавляют полезную микрофлору организма, оказывают неблагоприятное влияние на гомеостаз и соматические клетки, при этом часто развивается лекарственная аллергия и кандидозная инфекция. При нарушении правил применения антибиотиков или их длительном применении, у микроорганизмов формируется устойчивость к антибиотическим препаратам, что заставляет применять еще более сильные лекарственные средства (Сидоренко, 1998; Галка, Миськевич, 2014). 
     В связи с этим весьма актуальным и необходимым направлением исследований является разработка антибиотических препаратов на основе биологически активных веществ из экстрактов растений. Так как препараты растительного происхождения реже вызывают формирование резистентных штаммов бактерий, а также обладают малой токсичностью, мягкостью действия и редким проявлением аллергических реакций (Водолазова, и др., 2011).
     На сегодняшний день из всего биоразнообразия высших растений в РФ в медицинской практике разрешено использовать всего 320 видов лекарственных растений (Регистр, 1998). В процессе поиска альтернативных химических противомикробных веществ большой интерес представляют эфиромасличные растения, т.к. они не вызывают у бактерий резистентности и не оказывают негативного влияния на собственную микрофлору организма. Благодаря своим свойствам они могут эффективно влиять на патогенные микроорганизмы и обусловливать лечебный эффект усиливая иммунные реакции. Эфирные масла разрушительно действуют на цитоплазматические мембраны микроорганизмов, что приводит к уменьшению активности аэробного дыхания и снижению проницаемости мембран (Галка, Миськевич, 2014).
     Развивающимся направлением скрининга новых веществ с антибиотической активностью служит применение сверхкритических флюидных экстрактов, получаемых, в частности, из эфиромасличных растений. Сверхкритическая флюидная экстракция (СКФ) – это технология, заключающаяся в переводе газа до сверхкритической точки, в результате чего газ переходит в сжиженное состояние. СКФ-технологии отличаются высоким диффузионным свойством  флюида, имеющего высокую селективность извлечения, большим выходом извлекаемых компонентов, а так же отсутствием следов растворителя в готовом продукте. Вследствие этого экстракция эфирномасличного растительного сырья сжиженными газами является одним из эффективных методов выделения биологически активных веществ из природных растительных материалов (Холодкова, 2013). 
     Целью данной работы является оптимизация технологии получения газовых СКФ-экстрактов обладающих антибиотической активностью растений флоры Алтайского края. 
     Для достижения заданной цели были поставлены следующие задачи:
     1. Определить преимущества использования газовой СКФ-экстракции для создания лекарственных материалов и охарактеризовать биологически активные вещества, входящие в состав эфирных масел.
     2. Произвести сбор эфиромасличных видов флоры Алтайского края из сем. Asteraceae, и провести их экстрагирование методом СКФ-экстракции.
     3. Подобрать оптимальные условия экстрагирования для получения экстрактов с наиболее высокой антибиотической активностью.


ГЛАВА 1. ПРИМЕНЕНИЕ СКФ-ТЕХНОЛОГИЙ И ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЭФИРНОМАСЛИЧНЫХ РАСТЕНИЙ

1.1. Развитие СКФ-технологий в мире и их использование в фармацевтической промышленности

     Еще в XVII веке ученые выяснили, что охлаждение газа приводит к замедлению движения молекул и их сближению, что уменьшает его объем. Путём понижения температуры и увеличения давления объем газа может быть уменьшен настолько, что его молекулы преодолевают силы взаимного отталкивания и вступают в межмолекулярное взаимодействие, образуя жидкую фазу. Первым ученым, сумевшим перевести в жидкое состояние вещество, которое при нормальных условиях существует в виде газа, был Гаспар Монж, который в 1784 г. получил жидкую двуокись серы из ее газовой фазы. Затем в 1823 г. Майкл Фарадей получил жидкий хлор, нагнетая давление внутри изогнутой стеклянной трубки, наполненной газообразным хлором и одним концом погруженной в стакан с измельченным льдом. Под давлением газ превращался в жидкий хлор при охлаждении льдом в конце трубки. Только в 40-х годах XIX века ирландский ученый в области физической химии Томас Эндрюс предположил, что каждый газ имеет точную температуру, он назвал ее критической температурой, выше которой газ не может быть переведен в жидкое состояние даже под большим давлением. Эта концепция вскоре привела к научно-техническому прорыву в сжижении постоянных газов. Для достижения низких температур, достаточных, чтобы перевести эти газы в жидкое состояние, двое ученых – Луи Поль Кайете и Рауль-Пьер Пикте в 1877 г. независимо друг от друга пришли к идее использования «каскадного» процесса, который снижает температуру шаг за шагом. В опытах по изотермическому сжатию смеси воздуха с углекислым газом Кайете заметил, что смесь легко сжижалась. При увеличении же давления до 140-200 атм. мениск, разделяющий фазы, исчезал, и образовывалась одна газовая фаза. Он пришел к заключению, что жидкость растворялась в газе. В 1895 г. Карла фон Линде изобрел непрерывный процесс сжижения газов для производства большого количества жидкого воздуха, который до сих пор является основой всего современного производства сжиженных газов (Шигапов, Кемалов, 2016).
     Интерес к сжиженным газам связан в первую очередь с широкими возможностями варьирования термодинамическими параметрами экстрагирования, влияющими на состав извлекаемых веществ. Это приводит к возможности разделения смесей с использованием газа как экстрагирующего растворителя. Определяющим фактором для процесса экстрагирования является критическая точка, при которой происходит фазовый переход. Наиболее популярным и изученным в качестве растворителя в настоящее время является углекислый газ (СО2). 
     Продолжением развития сжиженногазовых технологий явилось совсем новое и малоизученное направление, связанное с использованием сверхкритического флюида. Флюид – состояние вещества, при котором исчезают различия между жидкой и газовой формой (Зилфикаров, Челомбитько, Алиев, 2007). Настоящим прорывом в области сверхкритической флюидной экстракции явились работы К. Цозеля в 70-е г., который занялся изучением свойств СО2 в сверхкритическом состоянии (Леонова, Климочкин, 2012).
     Технологии сверхкритических флюидов в настоящее время успешно и активно используется во многих отраслях промышленного производства. В ряде случаев она незаменима и является основным технологическим процессом производства. В России на сегодняшний день имеется несколько исследовательских групп, работающих в области сверхкритических газов. Однако широкого промышленного применения сверхкритической экстракции пока не наблюдается в отличие от высокоразвитых стран, таких как Германия, Франция, США, Япония, Китай (Леонова, Климочкин, 2012). Продвижение СКФ технологий координируется ассоциацией JAAST, включающей в свой состав три ключевые для национальной безопасности лаборатории (США). Анализ тем исследований и разработок в сфере СКФ-технологий, проводимых этими корпорациями, насчитывает несколько сотен позиций. Быстро развиваются СКФ-технологии производства высокодисперсных порошков, аэрозолей и аэрогелей, которые применяются в фармацевтической и лакокрасочной промышленности, для получения функциональных композитных полимерных покрытий, красящих порошков для копировальных машин и многое другое (Лунин, 2006).
     В нашей стране СКФ-технологии также являются предметом научных исследований. Большая роль в них принадлежит изучению процессов экстрагирования и фракционирования природного сырья и полупродуктов. 
     Еще в 30-е годы А.И. Шатенштейном, а позднее в 40–60-е гг. И.Р. Кричевским были выполнены исследования растворимости различных органических и неорганических веществ в сверхкритических газах и свойств ряда веществ в состоянии сверхкритических флюидов (C2H4 и СО2). Результаты некоторых из исследований до сих пор считаются образцовыми и служат стандартом при калибровке измерительных СКФ-установок. 
     Из всех областей применения углекислого газа наиболее проработана и готова к широкому внедрению технология производства СО2-экстрактов из растительного эфирномасличного и пряно-ароматического сырья. Научные исследования в этом направлении в нашей стране начались в 1953 г. 
     На экспериментальном заводе Краснодарского НИИ пищевой промышленности, было организовано опытно-промышленное производство СО2-экстрактов, где впервые была теоретически обоснована и экспериментально доказана практическая возможность применения сжиженных газов, разработана методика и аппаратура для исследования экстракции в лабораторных условиях, а также аппаратурное оформление процесса экстракции в промышленных условиях, разработаны новые способы подготовки растительного сырья. Исследованы кинетика экстракции различных видов растительного сырья, влияние технологических факторов процесса экстракции: вида растворителя, температуры, степени и характера измельчения сырья, продолжительности процесса, соотношение сырья и растворителя, перемешивания сырья – на выход и качество СО2-экстрактов (Лунин, 2006).
     По сравнению с традиционными методами, процессы экстракции с использованием диоксида углерода в сверхкритическом состоянии имеют целый ряд преимуществ: энергосберегающий характер процесса; высокая массообменная характеристика процесса благодаря низкой вязкости и высокой проникающей способности растворителя; высокая степень извлечения соответствующих компонентов и высокое качество получаемого продукта; практическое отсутствие СО2 в готовой продукции; процесс не дает сточных вод и отработанных растворителей, после декомпрессии СО2 может быть собран и повторно использован; обеспечивается уникальная микробиологическая чистота получаемой продукции; отсутствие сложного оборудования и многостадийного процесса; кроме того диоксид углерода дешёвый, нетоксичный и негорючий растворитель.
     Экстракционные свойства СО2 могут меняться в широких пределах при изменении температуры и давления, что обуславливает возможность извлечения при низкой температуре из растительного сырья большей части спектра биологически активных соединений. Экстракт практически копирует исходное растительное сырье. Данные хроматографического анализа показывают, что содержание ценных веществ превосходит классические экстракты в десятки раз (Касъянов, Герасимова, 1994; Богданов, Усков, 2005).
     Первая промышленная экстракционная установка была построена в Германии в 1978 г. для декофеинизации кофе. Диоксид углерода при давлениях от 160 до 220 атм. и температурах от 60 до 90?С обладает низкой растворяющей способностью, но высокой селективностью по кофеину. После экстракции содержание кофеина снижается с 0,7>3% до 0,02%. В настоящее время объем производства кофе, декофеинизированного в сверхкритическом СО2, составляет более 100 тысяч тонн ежегодно. Другим крупномасштабным пищевым производством является получение экстрактов хмеля. В этом процессе сверхкритическом СО2 в значительной мере вытеснил дихлорметан, экстракты которого всегда содержали остаточные количества токсичного растворителя. Кроме того, сверхкритические СО2 экстракты не содержат пестицидов, применяемых при возделывании хмеля, а также продуктов изомеризации – кислот.
     В России крупным предприятием по производству сверхкритических флюидных СО2 экстрактов является ООО "Сибирский завод экстрактов и биотехнологий" г. Томск, где получают экстракты из растений сибирской флоры. А также Научно-исследовательский центр экологических ресурсов "ГОРО", г. Ростов-на-Дону, имеющий небольшие промышленные установки собственной разработки и уникальные СКФ-технологии производства экстрактов из природного сырья, используемые в парфюмерной и пищевой промышленности (Зилфикаров, Челомбитько, Алиев, 2007).
        В настоящее время в разных странах мира работают более 130 экстракционных заводов. Сверхкритической флюидной экстракцией производятся оливковое, подсолнечное, рапсовое, грейпфрутовое и другие масла, рыбий жир, получают экстракты лекарственных растений, чеснока, сои, рисовых зерен, зародышей пшеницы, бетеля, чабреца и множества других растений, осуществляют очистку пищевых продуктов от холестерина, пестицидов и других вредных или нежелательных компонентов. Полученные продукты используются в пищевой, фармацевтической, парфюмерной промышленности и медицине. Уже построены и работают заводы по экстракции ценных компонентов природного сырья, по синтезу ряда важных соединений в биохимических производствах. Темпы роста промышленной экстракционной СКФ-технологии в мире составляют не менее 10% в год. Особенно интенсивно этот процесс идет в Китае и Индии. По оценке компании Business Communications Co, рынок лекарств растительного происхождения, которые практически полностью производятся с помощью СКФ-технологий, к 2005 году достигает около 37 млрд. долларов (Куцев, Холодкова, Иванова, 2013).
     Разработка и создание высокоэффективных лекарственных форм адресного и пролонгированного действия на основе принципов современных СКФ-технологий микронизации и инкапсуляции биоактивных субстанций с использованием биодеградируемых полимеров являются сегодня одним из перспективных направлений развития современной фармакологии. Этот подход позволяет решить целый комплекс важнейших задач, таких как повышени  биодоступности гидрофобных фармацевтических субстанций; защита биоактивных молекул в организме от быстрого расщепления ферментами и пептидами; адресная доставка активных молекул в определенные клетки, ткани и органы; пролонгирование терапевтического воздействия фармсубстанций; повышение эффективности и безопасности использования высокотоксичных лекарственных препаратов за счет локального и постепенного высвобождения малых количеств элиминирующих агентов, воздействующих на опухолевые клетки (Попов, 2011).


     1.3. Характеристика биологически активных веществ эфирных масел

     Общее число эфирномасличных растений мировой флоры оценивается в 2500-3000 видов. За период существования СССР во флоре страны было определено порядка 1100-1300 видов эфирномасличных растений, которые представляют 77 семейств (Ткаченко, 2011). 
     Эфирные масла (ЭМ) – это сложные по химическому составу смеси различных низко- и высокомолекулярных соединений, основную группу которых составляют вещества с изопреновой структурой. В выделяемом растительными сообществами комплексе летучих веществ эфирное масло составляет 80-90% с преобладанием более высокого содержания в нем монотерпеновых углеводородов. Для ЭМ характерна значительная летучесть. Они практически нерастворимы в воде, но хорошо растворимы в жирах, растительных маслах, эфире, спирте высокой концентрации, смешиваются во всех соотношениях с жирами и жирными маслами. Наиболее биологически активные компоненты эфирных масел – спирты, альдегиды, кетоны, фенолы; наименее активные – углеводороды (Кустова, 1978). 
     Итак, каждый вид ЭМ имеет свой, характерный только для него компонентный состав. Он весьма сложен и постоянно увеличивается в связи с усовершенствованием методов исследования. Некоторые эфирные масла содержат до 800 компонентов, при этом обычно преобладает один из них. На долю многих компонентов приходится одна десятая, сотая и даже тысячная процента, но некоторые из них играют определенную роль в формировании запаха и биологической активности (Николаевский, 2000).
     Большинство компонентов эфирных масел – это различные степени окисления углеводородов. Терпены являются наиболее распространенными и главными компонентами эфирных масел. Все они отвечают по составу формуле C10H16, являясь изомерными соединениями (Вульф, 1933). В зависимости от количества входящих в соединение углеродных атомов и частиц изопрена, терпеноиды классифицируются на следующие группы: 
     *Изопрены или полутерпены (полутерпеноиды) 
     *Монотерпены или терпены (терпеноиды) (С10Н16) 
     *Сесквитерпены (С15Н24) или полуторные терпеноиды 
     *Дитерпеноиды(С20Н32)
     *Тритерпеноиды (С30Н48) 
     *Тетратерпеноиды (С40Н64). 
     *Политерпеноиды [(С10Н16)n]. 
     В каждой группе выделяют ациклические и циклические соединения. Циклические классифицируют по числу циклов моно-, би-, трициклические и т.д. Выделяют две группы терпенов: моноциклические – одно кольцо углеродных атомов (лимонен, терпинолен) и бициклические – образованные двумя кольцами углеродных атомов (сильвестрен). По характеру соединений в эфирных маслах, чаще встречаются терпены, сесквитерпены и их кислородные производные. В меньших количествах – более сложные соединения: спирты, фенолы, альдегиды, кетоны, окиси, эфиры, лактоны, кислоты (Николаевский, Еременко, Иванов, 1987; Зыкова, Ефремов, 2014). 
     Терпены – химические соединения, углеводороды, молекулы которых состоят из атомов двух элементов – углерода и водорода. Терпены быстро испаряются, легко окисляются и распадаются, поэтому эфирные масла с большим содержанием терпенов не подлежат хранению более одного года. Названия веществ из группы терпенов оканчиваются на - ен. 
     Монотерпены – высоколетучие, легко испаряющиеся и разрушающиеся вещества. Некоторые монотерпены могут усиливать чувствительность к ультрафиолету. Свойства монотерпенов: антисептическое, фунгицидное, противовирусное, мочегонное, раздражающее. 
     Дитерпены – органические соединения группы терпенов, состоящие из изопреновых звеньев C20H32. Входят в состав смол хвойных растений, t кипения >300°С, отогнать водяным паром очень тяжело, растворимы в органических соединениях. Свойства дитерпенов: фунгицидные, инсектицидные, бактериостатические. Иногда достаточно токсичны для человека и животных (Блинова, Вандышев, Комарова, 1996).
     Сесквитерпены – группа органических соединений класса терпены, в которую входят углеводороды С15Н24. По физическим свойствам – вязкие жидкости или легкоплавкие кристаллические вещества, обуславливающие и закрепляющие запах растения, быстро окисляются на воздухе особенно при нагревании. Типичными представителями сесквитерпенов являются азулен (тысячелистник, полынь), хамазулен (ромашка), кариофиллен (гвоздика). Свойства сесквитерпенов: антигельминтные (девясил), противоопухолевые, противосудорожное, бактериостатическое, инсектицидные, тормозное воздействие на центральную нервную систему.
     Терпеноиды – это химические соединения, содержащие, кроме углерода и водорода, кислород. К таким соединениям относятся спирты, альдегиды, эфиры (простые и сложные), кетоны, фенолы, кислоты и окислы.
     Спирты – наиболее часто встречаемое соединение в эфирных маслах. В зависимости от пространственного строения молекулы (стереометрии) они делятся на монотерпенолы, сескви- и дитерпенолы. Спирты диффузны, легко испаряются, часто их аромат является ведущей нотой в характеристике запаха эфирного масла. Названия спиртов имеют окончание -ол. Биологическое действие спиртов: антисептическое, обезболивающее, анестезирующее, диуретическое и тонизирующее действие, способствуют стимуляции иммунной системы, регулируют гормональную деятельность.
     Альдегиды – это химические соединения, содержащие карбонильную группу в конце углеводородной цепочки, легко окисляются, чем объясняются их активные свойства, например антисептические. Высокая антисептическая активность альдегидов направлена на бактерии, вирусы, патогенные грибки, паразитов. 
     Эфиры – это химические соединения, содержащие кислотные радикалы, которые обеспечивают их биологическую активность. Эфиры содержатся в большинстве эфирных масел, их присутствие придает аромату масел фруктовую ноту и оттенки сладостей. Эфиры малотоксичны и относительно безопасны. В международной классификации названия эфиров имеют окончание -aт. Биологическое действие эфиров разносторонне,
 но ведущими являются расслабляющее, спазмолитическое, противовоспалительное, согревающее и успокаивающее. За счет тесной связи с органическими кислотами эфиры обладают ранозаживляющим, противогрибковым эффектом и проявляют антипаразитарные свойства. 
     Кетоны – химические соединения, содержащие карбонильную группу в середине углеводородной цепи. Существуют кетоны ароматические, ненасыщенные, оксикетоны и насыщенные (гексан). Биологическое действие кетонов разнообразно: антисептическое, ранозаживляющее, обезболивающее, противовоспалительное, жаропонижающее (Дебу, Менделеев, 1907; Современная фитотерапия, 1988).
     Окислы. Изучение свойств окислов, в частности 1,8-цинеола (эвкалиптол) в эвкалиптовом эфирном масле и во многих других, подтверждает, по мнению Г. Фенароли (Fenaroli, 1963), катализирующую активность, то есть усиление биологической активности других компонентов эфирных масел, особенно терпенов. Эфирные масла, содержащие эвкалиптол, обладают антисептической активностью (антибактериальной, антивирусной) и являются прекрасными средствами профилактики воздушно-капельных бактериальных и вирусных инфекций. 
     Лактоны представляют собой внутренние эфиры оксикарбоновых кислот. Биологическое действие лактонов объясняется свойствами кислот и эфиров; они оказывают противовирусное, противогрибковое, муколитическое, отхаркивающее, жаропонижающее, седативное действие.
     Кумарины и фурокумарины – природные соединения, в основе которых лежит соединение бензольного и пиронового колец (кумарины) и фуранового кольца (фурокумарины). Кумарины наиболее типичны для растений семейств зонтичных (корни и семена дягиля), рутовых (кожура цитрусовых), бобовых. Наиболее значима фотосенсибилизирующая активность фурокумаринов – повышение чувствительности к солнечному свету и ультрафиолетовым лучам. Ряд кумаринов и фурокумаринов оказывает бактериостатическое и противогрибковое действие (Георгиевский, Комиссаренко, Дмитрук, 1990). 
     Эфирные масла в живой ткани растения, в одних случаях, диффузно рассеяны по всем клеткам в растворенном состоянии или в виде капель подвешены в протоплазме, или в клеточном соке. Они имеют тогда характер фенолов, растворимых в воде, или же представлены также растворимыми в воде гликозидами. В других случаях они скапливаются в особых вместилищах, представляющих собой отдельные клетки или особые выделительные органы. Количественное распределение эфирного масла по растению, большей частью, является не одинаковым. В основном одно растение имеет примерно одинаковый состав и запах эфирного масла в разных частях, но бывают и исключения, такие, например, как цейлонская корица, в коре коричный альдегид, в листьях в основном евгенол, а в корнях камфора (Вульф, 1933). 
     Природно-климатические факторы оказывают определяющие влияния на химический состав растений. Так, тепло является одним из важнейших факторов в жизни растения, так как главным образом от тепловой и световой энергии зависят продолжительность вегетации, накопление действующих веществ и масса самого растения. Количество осадков и влажность окружающей среды также накладывают определенный отпечаток на количество и состав действующих веществ растений.
     На образование, накопление и состав эфирных масел в растениях заметное влияние оказывают природные факторы. Обычно растение положительно отзывается на те условия, которые преобладают на его родине. Эфироносы умеренной зоны (мята, душица, мелисса) накапливают повышенное количество эфирного масла при умеренной температуре воздуха и высокой влажности, а растения южных зон – при жаркой погоде. От погодных условий зависит не только количество, но и качество масла. Так, например, у мяты при повышении температуры воздуха снижается содержание ментола (Методические показания по оценке…, 1982). 
     Различные эфирномасличные растения по-разному реагируют на увеличение высоты над уровнем моря: у лаванды, например, наблюдается понижение, а у розы, наоборот, повышение содержания эфирного масла на плантациях, заложенных более высоко в горах. Удобрения, содержащие калий, кальций и фосфор, оказывают положительное влияние на накопление и концентрацию в тканях растения гликозидов и эфирных масел. Высокие дозы азотных удобрений оказывают отрицательное влияние на накопление этих соединений.
     Помимо природно-климатических факторов на химический состав растений оказывают влияние экологические факторы антропогенного характера. К ним относятся различного рода загрязнители окружающей среды, имеющиеся в атмосфере, гидросфере и литосфере и непосредственно попадающие в растение. Реакция растений на загрязнения окружающей среды сложна и неоднозначна. Накопление загрязнителей в тканях растениях – нежелательный процесс. Лекарственное растительное сырье, содержащее тяжелые металлы или другие загрязнители, представляет реальную угрозу процессу жизнедеятельности организма человека (Загуменников, Дмитрук, Загуменникова, 2001; Шаин, 2005; Терехин, Вандышев, 2008). 
     
     
     1.4. Механизм антибактериальной активности эфирных масел
     
     В процессе поиска альтернативных химических противомикробных веществ большой интерес представляют эфиромасличные растения, которые благодаря своим свойствам могут эффективно влиять на патогенные микроорганизмы и обусловливать лечебный эффект. Микробы при длительном контакте с эфирными маслами практически не вырабатывают к ним устойчивости. Если рассматривать этот вопрос на клеточном уровне, то можно констатировать, что эфирные масла создают для микробов такую среду обитания, в которой они не могут нормально развиваться и гибнут, не приспособившись к новым условиям (Галка, Миськевич, 2014). Агрессивность эфирных масел по отношению к микробам сочетается с их практически полной безвредностью для организма человека. Тогда, как мы уже указывали, при длительном применении антибиотиков снижается иммунологическая реактивность, возникает лекарственная аллергия и кандидозы и, наконец, формируется резистентность к лекарственным препаратам самих микроорганизмов.
     Эфирные масла и природные антибиотики, содержащиеся, например, в зверобое (иманин), бессмертнике (аренанин), шалфее лекарственном (сальвин), чистотеле и других, действуют только против микробов, но не против высших организмов (Калинкина и др., 2000). Существенно, что антисептическая способность эфирных масел не уменьшаемся со временем, а у микроорганизмов к ним практически не развивается устойчивость. Это связано с тем, что антибиологическое действие эфирных масел на микробы обусловлено разрушением цитоплазматической (периферической) мембраны и уменьшением активности аэробного дыхания, что приводит к уменьшению выделения энергии, необходимой для синтеза различных органических соединений, т.е. они проявляют антибиотическое воздействие через модификацию внутренней среды организма (Hayes, 1947; Okazaki, Hiroshi, Wakatabe, 1951).
     Для летучих фракций эфирных масел антимикробная активность нарастает в следующей последовательности входящих в них компонентов: углеводороды, окиси, фенолы, альдегиды, кетоны, спирты, сложные эфиры. Эфирные масла угнетают жизнедеятельность патогенных микроорганизмов, а также способствуют проникновению антибиотиков в живую клетку организма, что позволяет снизить дозы антибиотиков при тяжелых заболеваниях (Гертнер, Юрьев, Панова, 2015).
     Модифицируя, изменяя экологические соглашения, которые допускали эволюционирование микробов, их патогенное становление, эфирные масла противодействуют их выживанию, не давая допустимости создать защиту или адаптироваться к агрессивному агенту. Более того, они препятствуют возрождению микробов – как немедленному, так и спустя длительное время. Таким образом, не происходит изменений в генетическом агрегате микробных клеток, т. е. эфирные масла не обладают мутагенным действием (Вичканова, 1983). 
     Экспериментально доказано, что антимикробное действие эфирных масел распространяется практически на все группы микроорганизмов. Отмечено, что на кокковидные микроорганизмы эфирные масла влияют активнее, чем на палочковидные бактерии (Акимов, Остапчук, 1985; Струкова и др., 2009).


     1.3.1. Эффективность эфирных масел в качестве сырья для лекарственных препаратов
     
     Известно, что белки сыворотки крови человека блокируют действие антибиотиков, в то же время установлено, что среда с повышенным содержанием белка не приводит к снижению бактерицидной активности эфирных масел. Это одно из главных преимуществ природных биологически активных веществ перед антибиотиками.
     Установлено, что наибольший противомикробный эффект проявляют сочетания эфирных масел базилика, лимона, лаванды с антибиотиками, при этом действие последних повышается в 4-10 раз. Таким образом, не отрицая высокую эффективность антибиотиков для экстренной помощи человеку, но учитывая негативные последствия их длительного применения, целесообразно использовать антибиотики в совокупности с применением эфирных масел.
     Кроме бактериостатических и бактерицидных свойств, многие эфирные масла обладают антивирусными свойствами. Особую ценность представляют эфирные масла для ароматерапии в период вспышек вирусного гриппа, а также для санации воздуха в больницах, детских учреждениях, местах скопления большого количества людей. Известно, что люди, живущие в лесных районах, в два-четыре раза меньше болеют, особенно ОРВИ, гриппом, ангиной, бронхитом, по сравнению с горожанами, так как воздух в лесу постоянно наполняется фитонцидами, эфирными маслами.
     При туберкулезе легких лечение эфирными маслами способствует снижению температуры, уменьшению кашля, возвращаются вес и аппетит, нормализуется состав крови, исчезают туберкулезные палочки Коха. Лечебная практика показывает, что при включении в лечебный комплекс ароматерапии эфирными маслами уменьшается количество заболевания ОРВИ на 50-80%, значительно сокращается длительность течения болезнетворного процесса и возможные осложнения (Гертнер и др., 2015). 
     Чистые эфирные масла растений являются не очень удобными фитопрепаратами и используются, в основном, в составе лекарственных форм для наружного применения. Поэтому в настоящее время активно разрабатываются и исследуются различные фитоэкстракционные препараты, представляющие собой суммарные извлечения из лекарственного растительного сырья. Создание фитоэкстракционных препаратов выгодно с точки зрения экономичности и рациональности использования растительного сырья, позволяет обеспечить максимальный выход биологически активных веществ (Самылина и др., 2006).


ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

     Исследования проводились в лаборатории биоинженерии Алтайского государственного университета в Южно-Сибирском ботаническом саду.
     
     2.1. Материалы исследования
     
     В качестве материала для исследования были использованы эфиромасличные виды растений сем. Asteraceae. Сбор растений происходил с учетом правил сбора растительного сырья. Исследуемые растения собирали в степных и луговых фитоценозах на территории Зонального района в округе села Луговское.
     По результатам проведенного нами анализа литературных данных мы определили, что на территории Алтайского края лидирующим семейством по содержанию эфиромасличных является сем. Asteraceae, включающее 39 видов эфиромасличных растений, что составляет 25% от общего числа эфиромасличных видов, произрастающих в Алтайском крае (рис.1). Вследствие этого эфиромасличные виды данного семейства были выбраны объектом для дальнейших исследований на антибиотическую активность получаемых из них СКФ-экстрактов.
     
     
      Рис. 1. Лидирующие семейства Алтайского края по количеству
      эфиромасличных видов
     В качестве тест-микроорганизмов, для определения антибиотической активности СКФ-экстрактов, использовали условно-патогенные штаммы следующих видов бактер.......................