Общие сведения об использовании в промышленности

ВВЕДЕНИЕ

     Одним. из. направлений развития научно-технического прогресса является переход. от. химической технологии к биотехнологии, позволяющей получать известные. вещества и материалы, отличающиеся высоким качеством и низкой себестоимостью, а также синтезировать новые продукты. Одним из направлений биотехнологий является микробиологический синтез
     Роль микроорганизмов в микробиологической, пищевой промышленности, в сельском хозяйстве и других областях трудно переоценить. Особенно важно отметить то, что многие микроорганизмы для производства ценных продуктов используют отходы промышленного производства, нефтепродукты и тем самым производят их разрушение, предохраняя окружающую среду от загрязнения [1].
     В данной. работе будут рассмотрены биотехнологические процессы с использованием микроорганизмов рода Clostridium. Представители данного рода способны. синтезировать широкий спектр полезных человечеству продуктов. Их использование видится выгодным, так как будучи анаэробами, они не нуждаются в затратах на аэрацию.
     Цель данной курсовой работы: проанализировать процессы микробиологического синтеза с использованием клостридий.
     Задачи курсовой работы:
   1.	Исследовать морфологию представителей рода Clostridium.
   2.  Выявить наиболее подходящие условия для культивирования клостридий.
   3.	Проанализировать пути ферментации видов Clostridium, использующихся в промышленном синтезе. 
   4.	Сравнить характеристики химически синтезированного этанола и биобутанола. .
   5.	Выявить .эффективные методы повышения выхода продукта.
     














ГЛАВА 1
    ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КЛОСТРИДИЙ В ПРОМЫШЛЕННОСТИ

     1.1 Общие сведения об использовании в промышленности 
     представителей .  рода Clostridium

     В настоящее время в роду Clostridium, относящемся к семейству Bacillaceae, насчитывается более 60 видов бактерии. Бактерии рода Clostridium имеют палочковидные клетки. Они обычно подвижные, передвигаются с помощью .перитрихиальных. жгутиков. Образуют споры. Споры имеют овальную или сферическую форму; как правило, споры раздувают клетку Грамположительные. Облигатные анаэробы. Хемоорганогетеротрофы.
     Сбраживают сахара, многоатомные спирты, аминокислоты, органические кислоты, пурины и пиримидины, другие органические соединения. Ряд видов фиксирует молекулярный азот атмосферы. Места обитания – почва, водоемы, а также пищеварительный тракт животных и человека [2].
     Представители рода Clostridium способны синтезировать множество полезных продуктов, таких как бутанол, этанол, ацетон, уксусная, пропионовая и масляная кислоты. Патогенные виды также представляют промышленный интерес, так как выделяемые ими токсины можно использовать в медицинских и косметических целях [3].
     Использование клостридий в микробиологическом синтезе берет свое начало в 20-х годах 20 века. Тогда Вайцманном был выделен первый полезный вид – Cl. acetobutylicum. В 30-40 года были выделены ещё несколько видов клостридии, активно развивалась биотехнология, уже тогда были известны методы выделения бутанола и ацетона из кукурузы или патоки. Однако в 50-60 годах, в связи с бурным развитием нефтехимической промышленности, микробиологический синтез оказался финансово невыгоден и почти полностью исчез из промышленности [4].
     В настоящее время, в связи с истощением ископаемых ресурсов, биотехнология вновь становится актуальным направлением. 
     

     1.2  Производство. пропионовой. кислоты

     Пропионовая. кислота. является. карбоновой кислотой с химической формулой СН3СН2СООН.. Это. прозрачная жидкость с резким и неприятным запахом [5].
     Пропионовая кислота ингибирует рост плесени. и некоторых. бактерий. 
     Поэтому, большая часть полученной пропионовой кислоты., потребляется,  как консервант для кормов и продуктов питания. Для. консервации. кормов, используется. либо. непосредственно, либо в качестве аммонийных солей. 
     В выпечке. используют натриевые и кальциевые соли. пропионовой кислоты.  Также она является полезным  промежуточным продуктом в производстве других химических веществ, особенно полимеров. Целлюлоза-  ацетат-пропионат является полезным термопласком. Также находит практическое применение винилпропионат. Также используется для производства пестицидов и фармацевтических препаратов. Сложные эфиры пропионовой кислоты используются в качестве растворителей или искусственных ароматизаторов [6].
     В микробиологическом синтезе пропионовой кислоты используют вид Clostridium propionicum.
     Cl. propionicum – подвижные, грамотрицательные, облигатно-анаэробные, каталазоотрицательные микроорганизмы. Клетки имеют веретенообразную форму и существуют отдельно или парами (рис.1.). Средний размер клеток 0,8х3,0. В старых культурах клетки значительно отличаются друг от друга по размеру и форме. Оптимальная. температура развития от 28. до 37. °С. Спорообразование происходит с трудом. Споры. образует. не более трети всех клеток. Споры имеют овальную форму. Cl. propionicum – была выделена и исследована в 1942. году американскими микробиологами Б. П. Кардоном и Н. А. Баркером. [7].
     

      Рисунок 1 – Изображение Clostridium propionicum
     
     Cl. propionicum  способны сбраживать: аланин, треонин, серин, цистеин, а так же лактаты, пируваты и акрилаты. Сахара не сбраживают. Оптимальное pH 7,0 - 7,4. Обитают в  почве, морском и речном иле, гниющей траве и т.д. Так же Clostridium propionicum обитает в кишечнике человека и обнаруживается в фекалиях. При брожении образуется пропионовая и уксусная кислоты в соотношении 2:1 и CO2 [8].
     Пропионовокислые бактерии расщепляют углеводы по
гликолитическому пути до пировиноградной кислоты, которая подвергается дальнейшим превращениям с образованием пропионовой кислоты,
уксусной кислоты и СО2:
     1,5Глюкоза ? 2Пропионат + СО2 + Ацетат
     Поскольку пропионовокислые бактерии развиваются, как правило, в
тех же субстратах, что и молочнокислые (рубец и кишечник жвачных
животных), то предпочтительным субстратом для окисления является
молочная кислота, синтезирующаяся в результате молочнокислого брожения:
     3Лактат ? 2Пропионат + Ацетат + СО2
     Существуют два метаболических пути образования пропионовой кислоты у пропионовокислых бактерий:
     • сукцинат-пропионатный путь, в котором лактат превращается в
пропионат через стадии образования пирувата и сукцината.
     • акрилатный путь, в котором лактат в ходе ряда последовательных
реакций восстанавливается до пропионата.
     Пути образования пропионовой кислоты представлены на рисунке 2.
     
      
      Рисунок 2 – Схема  образования пропионовой кислоты из лактата:
      1 – лактат-рацемаза 2 – коэнзимА-трансфераза 3 – лактил-CoA- дегидратаза 4 – акрилил-CoA-редуктаза 5 – лактат-дегидрогеназа 6 – пируват:ферредоксин-оксиредуктаза 7 – трансгидрогеназа, 8 – фосфотрансацетилаза и ацетаткиназа. ETF - неизвестный переносчик электронов
     
     Субстратами для данного метаболического пути могут
служить L-, D-, или L D-формы лактата. В клетках  присутствует фермент рацемаза, катализирующий взаимопревращения стереоизомеров: L-лактат превращается в L-лактил-КоА, который в результате пока еще не изученных детально реакций превращается в акрилоил-КоА. В свою очередь акрилоил-КоА восстанавливается до пропионил-КоА с дальнейшим образованием пропионата [9].
     
     
     1.3 Производство масляной кислоты 

     Масляная кислота (С3Н7СООН) – четырех-углеродная монокарбоновая кислота, которая широко применяется в различных отраслях промышленности: для производства пластмасс, пластификаторов, ПАВ, лаков, духов, фармацевтических препаратов, кормовых добавок, дезинфицирующих средств, а также в качестве вкусового компонента в пищевых продуктах. В медицинской научной литературе сообщается о противоопухолевой активности масляной кислоты. Это соединение может быть использовано для производства этилбутирата и бутилбутирата, которые после химической конверсии могут служить в качестве топлива. Масляная кислота может также быть субстратом для получения бутанола. Общий объем мирового рынка масляной кислоты по разным оценкам составляет от 25 до 35 тыс.т в год. 
     Масляная кислота может быть получена путём окисления бутиральдегида, но в последнее время растёт интерес к биопродукции масляной кислоты с помощью ферментации. Несколько анаэробных бактерий могут производить масляную кислоту в качестве основного конечного продукта в процессе ферментации сахаров, однако наиболее используется вид Clostridium butyricum [10].
     Cl. butyricum – это крупная палочка (1-2x10 мкм), в молодом состоянии она подвижна. (рис. 3.). На более поздних стадиях развития теряет жгутики, приобретает веретенообразную форму и накапливает внутри клетки запасное питательное вещество – полисахарид гранулезу. Cl. butyricum образует веретенообразные споры. Эти бактерии имеют много преимуществ по сравнению с другими видами из-за их низких требований к питательной среде и сравнительно высокого выхода продукта. Кроме того, эти штаммы могут быть легко выделены из почвы, сточных вод, загрязнённых молочных продуктов. Реже в промышленности используются виды Cl. butyricum, Cl. felsineum, Cl. Tyrobutyricum [11].
     Оптимальные условия для культивирования: температура 35-37 °С, pH = 6,5 содержание N2 и CO2 в соотношении 1:9. В качестве источников углерода используют глюкозу, мелассу, крахмал или пшеничную муку [10].
     В 2014 году российскими учеными были использованы, в качестве субстрата гидролизаты свекловичного жома и березового опила для культивирования бактерий Cl. butyricum и Cl. tyrobutyricum, что значительно повысило выход масляной кислоты и процент утилизированных сахаров [12].
     
      
      Рисунок 3 – Изображение Clostridium butyricum
     
     Схема образования масляной кислоты представлена на рисунке 4. Как видно из схемы, в основе маслянокислого брожения лежит сбраживание углеводов по гликолитическому пути до пировиноградной кислоты, которая далее подвергается декарбоксилированию с образованием ацетил -КоА. Реакция катализируется ферментом пируват:ферредоксин - оксидоредуктазой и является ключевой в маслянокислом брожении.
     Основной продукт брожения – масляная кислота образуется в результате конденсации двух молекул ацетил -КоА. Превращения ацетил -КоА в масляную кислоту сопряжены с процессами восстановления, в которых в качестве доноров водорода используются молекулы НАДН, образующиеся ранее в процессе гликолиза. Кроме того, одна из молекул ацетил -КоА, присоединяя неорганический фосфат, может подвергаться фосфорилированию, превращаясь в ацетилфосфат и далее в ацетат, что сопровождается синтезом АТФ в процессе субстратного фосфорилирования [13].
     

Рисунок 4 – Схема образования масляной кислоты из глюкозы


     1.4 Ацетонобутиловое брожение

     Некоторые клостридии ( Сlostridium acetobutylicum , Сl. bejerinckii , Сl. cellobioparum и др.) при сбраживании сахаров наряду с кислотами накапливают в среде нейтральные продукты (бутиловый, изопропиловый, этиловый спирты, ацетон). Особенно много нейтральных продуктов образуется культурой С. acetobutylicum, поэтому её используют для промышленного получения бутанола [13].
     Cl. acetobutylicum является граммположительной бациллой с перехитриальными жгутиками, обитает в почве, воде, кишечнике моллюсков и крупного рогатого скота, оптимальная температура роста 37 °С. (рис. 5.). Способна образовывать субтерминальные эндоспоры. В качестве источника углерода может использовать гексозы, петозы, крахмал и другие полисахаридыс превращением их примерно на 30% в смесь растворителей, а остальное составляют газы Н2 и СО2 в соотношении 40:60. Смесь растворителей состоит из н-бутанола (60%), ацетона (30%) и около 5–10% приходится на этанол [14]. Данный вид способен к фиксации азота, что было проверено с использованием меченого изотопа 15N2. [15].   
        
      
      Рисунок 5 –  Изображение Clostridium acetobutylicum
     
     АБЭ брожение широко используют в промышленном производстве ацетона и бутилового спирта из кукурузной муки или другого крахмалистого сырья. Ацетон применяют для производства искусственного шелка и кожи, фотографических пленок, искусственного цемента и других продуктов. Бутиловый спирт  применяется в многих отраслях народного хозяйства. В качестве растворителей используются в лакокрасочной промышленности, в производстве синтетической резины, при экстрагировании фармацевтических препаратов и других отраслях. Используются также в качестве сырья для синтеза ряда органических продуктов, а также в виде жидкого топлива.. Газы, образующиеся при ацетонобутиловом брожении, идут на синтез метилового спирта [16].
     Используют три типа сырья как источников углерода и энергии: зерно (крахмал), паточную (неочищенную мелассу) и очищенную мелассу. В качестве субстратов будущего рассматривают различные отходы, гидролизованную древесину, гидролизаты отбросов, сыворотку, сульфитные жидкости.
     Среды из зернового крахмала готовят следующим образом. Мука вносится в количестве 60% к воде, туда же добавляют сброженным остаток ферментации после отгонки растворителей. Конечная концентрация должна составить 8,5% исходного зерна [17].
     Ацетонобутиловые бактерии очень требовательны. Они нуждаются в готовых аминокислотах и витаминах. Характер конечного продукта этого брожения обусловливается как видовой принадлежностью используемого микроорганизма, так и внешними условиями: составом питательной среды, pH и температурой.
     Ферментация в мелассных средах завершается за 40-45 ч, а в крахмальных (с питательными добавками) – за 50-60 ч, в крахмальной без питательных добавок за 70-80 ч [18].
     Ацетонобутиловое брожение имеет двухфазный характер. В течение первой фазы – кислотной, наблюдается активный рост бактерий, в среде идет накопление преимущественно органических кислот (масляной и уксусной). Во второй фазе брожения – ацетонобутиловой, снижается рН среды, рост бактерий замедляется, индуцируется синтез ферментов, приводящих к накоплению нейтральных продуктов – ацетона, бутанола и этанола. Выделение растворителей происходит при помощи дистилляции. 
     Рассмотрим процесс образования нейтральных продуктов при ацетонобутиловом брожении (рис. 6.). н-Бутанол образуется из бутирил-КоA, предшественника масляной кислоты, в результате двух последовательных ферментативных реакций. Первая из них заключается в отщеплении кофермента (A) и одновременном гидрировании, приводящем к образованию масляного альдегида. Последующее его восстановление с помощью НАД*Н2 приводит к появлению н-бутанола . Путь, ведущий к образованию ацетона, начинается с переноса от ацетоацетил-КоA кофермента (A) на ацетат. Декарбоксилирование ацетоуксусной кислоты приводит к образованию ацетона. Образование этанола происходит в результате двухступенчатого восстановления ацетил-КоA [19]. 


Рисунок 6 – Схема ацетонобутилового брожения

     Физиологический смысл дополнительных ферментативных этапов у С.acetobutylicum, ведущих к накоплению в среде н-бутанола, этанола и ацетона, заключается в образовании конечных продуктов нейтрального характера. Первоначально нейтральный рН среды вследствие накопления масляной и уксусной кислот быстро падает. Некоторые клостридии выработали механизм борьбы с нарастающей кислотностью, который начинает функционировать при низком рН среды и приводит к появлению перечисленных выше нейтральных продуктов. Одновременно происходит понижение общей кислотности среды, что также свидетельствует об активном противодействии этих бактерий неблагоприятным условиям [19].
     При периодическом выращивании следят за уровнем источника углерода и рН. Определенный исходный уровень источника углерода обусловлен токсичностью образуемых из него продуктов. Растворители, и в первую очередь бутанол, ингибируют процесс, поэтому при периодическом выращивании редко образуются более 20 кг растворителей в 1 м3. Типичные выходы для этого режима: 0,2-0,6 кг/м3  в зависимости от субстрата и условий культивирования. Для удаления конечных продуктов ферментации в качестве экстрактантов в ферментер добавляют несмещивающиеся органические растворители. Наилучшие результаты получены при добавлении олеилового спирта и смеси олеилового спирта (50%) в бензилбензоате. В обычной ферментации в периодических условиях поглощения глюкозы приблизительно 80 кг/м3. Удаление бутанола в процессе в процессе экстракции увеличило скорость его образования, и максимальная объемная производительность по бутанолу увеличилась более чем на 60% по сравнению с обычной периодической ферментацией [20].
     Наиболее ценным продуктом АБЭ ферментации является бутанол. Бутанол рассматривается как альтернативное биотопливо будущего. Биобутанол может добавляться к обычному бензину или бензину, содержащему этанол, он может быть использован в современных автомобильных двигателях, и потенциально его поставка может быть налажена при использовании существующей инфраструктуры поставки топлива [21].
     Сторонники биобутанола отмечают значимые преимущества над другими биотопливами для использования в двигателях внутреннего сгорания и других использующих жидкое топливо:
     1. Для производства. биобутанола. могут быть использованы обычные типы сырья, такие. как сахарный тростник, сахарная свекла, кукуруза, пшеница, кассава и сорго, что поддержит. их глобальной. распространение. В будущем появятся способы получения биотоплива из лигноцеллюлозного сырья быстрорастущих энергоемких зерновых культур (например, трав) или сельскохозяйственных отходов (например, стержни кукурузы).
     2. Бутанол имеет более высокое октановое число, чем бензин с повышенным низкоуровневым вращающим моментом. Двигатель V-8 был протестирован на бутаноле в 10,000 мильном путешествии по США при поддержке Американского Департамента Энергии в 2005. Результаты демонстрации автомобильного топлива из бутанола были представлены в докладе Американского. Департамента. Энергии. Национальной. лаборатории возобновляемой Энергии. в Сан. Франциско. 7 Ноябре, 2.0.0.5.
     3. Энергетическая. ценность. биобутанола. по. уровню. ближе к таковой для бензина, чем для этанола, т.е. при использовании биобутанола потребители сталкиваются с меньшими компромиссами по экономике топлива – это особенно важно, поскольку сегодня доля использования биотоплива в топливных смесях постоянно увеличивается.
     4. Биобутанол. может добавляться в более высоких концентрациях, чем биоэтанол, при использовании в стандартных автомобильных двигателях. В настоящее время биобутанол может добавляться в бензин в концентрации до 10.%. v/v в Европе и до 11,5%. v/v в США. без переделки. двигателя.
     5. Производство. и использование бутанола в качестве топлива может уменьшить использование ископаемого топлива.
     6. Бутанол. уменьшает атмосферные. эмиссии. вредные выбросы в атмосферу.
     7. Бутанол. не адсорбирует влагу из воздуха. (он – не гидроскопичен), так что он менее подвержен изменениям в погодных условиях, в отличие от чистого этанола, который требует модификации двигателя и топливных систем автомобиля. Биодизель образует гель при низких температурах, что требует модификации топлива в холодном климате, или смешивания с другим ископаемым топливом как например, керосин или дизель.
     8. Бутанол не разрушает материалы, обычно использующиеся в атмосферных двигателях внутреннего сгорания.
     9. Биобутанол может также использоваться в промышленных красках и промышленных растворителях, для замены ископаемого бутанола [4].
     
     
     1.5 Производство. этанола.
     
     Устойчивое будущее, вероятно, будет зависеть от крупномасштабного производства топлива, химических веществ и продуктов из возобновляемых ресурсов. Одним из наиболее перспективных подходов к этой целью в микробиологически является конверсия биомассы лигноцеллюлозы в альтернативное топливо. Доступн.о. большое количество биомассы, имеющей потенциал, для использования в качестве сырья. [22].
      Микробы  играют главную роль в превращении биомассы в топливо и химикаты. Современные технологии для брожения биомассы, как правило, полагаются на добавление ферментов для растворения гемицеллюлозы и целлюлозы, однако производство фермента представляет собой значительные расходы и препятствует экономическому производство биотоплива [22]. 
     Альтернативный подход заключается в использовании одного или нескольких микроорганизмов, способных преобразовывать клеточную стенку растений в топливо за один шаг без добавления ферментов; этот процесс называется консолидированной биопереработкой (КБП). Одним из таких представителей является Clostridium thermocellum.
     Cl. thermocellum является грамположительной термофильной бактерией. Способна к образованию спор (рис. 7.). Обитает в почве, на дне водоёмов и в кишечном тракте животных. Деградация целлюлозы осуществляется внеклеточно. с. помощью большой целлюлазной системы, которая содержит около 20. каталитических. субъединиц [23]. 
     
      
      Рисунок 7 – Изображение Clostridium thermocellum
     
     Недостатком. является. наличие разветвленных ферментационных путей, в результате чего образуются побочные продукты: ацетат, формиат и лактат.
     В качестве. субстрата микроорганизм используется просо, целлобиозу, целлюлоза. Бактерии. довольно быстро ферментируют примерно 30% биомассы, а с каждого моля глюкозы получается 1,7 моля этилового спирта. Это близко к теоретическому максимуму (два моля этанола с одного моля глюкозы). Процесс идёт при температуре 65.-75. °C [24]. 
     Другим потенциальным. производителем этанола является бактерия Clostridium ljungdahlii. Она была впервые выделена из куриных экскрементов в 1988 году. Cl. ljungdahlii является палочковидной, подвижной грамположительной бактерией. Длина – от 2 до 3 мкм, ширина – 0,6 мкм. При неблагоприятных условиях образует эндоспоры, которые способны к выживанию в течение нескольких лет.
     Данный микроорганизм имеет потенциальное значение для промышленной биотехнологии, однако производство, пока, осуществляется только в экспериментальных масштабах [25].
     Cl. ljungdahlii культивируется в анаэробных  условиях, то есть в среде без кислорода. pH-оптимум для роста бактерий составляет  6,0 с допустимым отклонением между 4,0 и 7,0, Оптимальная температура роста –  около 37 ° С с допустимым отклонением 30 до 40 °С. В качестве субстрата используют, пируват , арабинозы , ксилозы , фруктозы, глюкозы, а также окиси углерода или двуокиси углерода, вместе с водородом (синтез-газ). Для роста также необходимы аминокислоты, витамины, микроэлементы [26].
     Поглощение окиси углерода и двуокиси углерода в присутствии водорода и его превращения в конечные продукты происходит посредством восстановительного ацетил.-СоА. пути (рис 8). Далее, из образовавшегося ацетил.-СоА. образуется этанол или уксусная кислота.
      
      Рисунок 8 – Схема  Ацетил-CoA-пути Clostridium ljungdahlii
     
      Смесь, состоящую. из 4 ммоль. водорода. и 2 ммоль диоксида  углерода  Cl. ljungdahlii  преобразует в 1 ммоль этанола. [27].
     

     1.6 Производство бактериальных токсинов
     
     Одним. из перспективных направлений использования бактерий рода Clostridium, является микробиологический синтез токсинов. Токсины используются в медицинских, косметических и исследовательских целях. В настоящее время наиболее практически значимым является ботулинический токсин, производимый Cl. botulinum.
     Clostridium botulinum – анаэробная грамположительная бактерия. Представляет собой крупные подвижные палочки с округленными концами.  Является возбудителем ботулизма – тяжёлой пищевой интоксикации, вызываемой ботулиническим токсином и характеризуемой поражением нервной системы (рис. 9.).
     Cl. botulinum обитает в почве. Заболеваемость ботулизмом повсеместна. Наиболее распространены бактерии типа A и B. В природных условиях бактерии колонизируют ил на дне водоёмов, инфицируют рыб. При пересыхании водоёмов стимулируется рост Cl. botulinum. Таким образом, естественный резервуар для этих бактерий – почва и различные животные. Тёплый климат создаёт условия для длительного сохранения спор в почве, а также для прорастания и размножения вегетативных форм [28]. 
     
      
      Рисунок 9 –  Clostridium botulinum  
     
     Cl. botulinum  культивируется на мясо-пептонном бульоне,кровяном мясо-пептонном агаре или других средах. Срок культивирования 48-72 ч. Оптимальная pH для роста: 7,3-7,6 [29].
     Известны 7 антигенных вариантов ботулотоксина: A, B, C (подтипы C1 и C2), D, E, F, G. 
     Токсин представляет собой полипептидную цепь с одной или несколькими внутримолекулярными связями, его молекулярная масса равна 150 000, он относится к бинарным токсинам [30].
     Наиболее эффективный способ экстракции был предложен российскими учёными в 2007 году. 
     Штамм-продуцент Cl. botulinum типа А выращивают в анаэробных условиях на среде, содержащей кислотный гидролизат рыбокостной муки с добавлением кукурузного экстракта. После окончания культивирования микробные клетки отделяют центрифугированием. Фугат культуральной жидкости охлаждают, подкисляют соляной кислотой, добавляют сухой сульфат аммония до конечной степени насыщения 60% и инкубируют для формирования осадка белка, который собирают центрифугированием. Для экстракции токсина одну часть полученного кислотно-солевого осадка растворяют в десяти частях по весу 0,05М фосфатного буферного раствора (ФБР) рН 7,9. К полученному экстракту приливают насыщенный раствор сульфата аммония до конечной степени насыщения 20% и осветляют центифугированием. К надосадочной жидкости приливают насыщенный раствор сульфата аммония до конечной степени насыщения 40%. Полученную смесь центрифугируют, надосадочную жидкость декантируют, осадок ресуспендируют в ФБР рН 7,9. Белки растворяют при постоянном перемешивании на магнитной мешалке и осветляют центрифугированием. Осветленный препарат токсина наносят на гель сефакрила S-300 уравновешенный 0,025М ФБР с 0,3М КС1 рН 7,9 заполняющий хроматографическую колонку. Гель-фильтрацию проводят при условиях подачи в качестве элюата 0,025М ФБР с 0,3М КС1 посредством перистальтического насоса. Элюат собирают фракциями. Полученные фракции второго и третьего пиков анализируют в реакции диффузной преципитации (РДП) по Оухтерлони с моно- и полиспецифическими гипериммунными сыворотками к токсину типа А. Фракции, обладающие активностью не ниже 4 ЕА/мл, объединяют. Объединенные фракции наносят на уравновешенный 0,025М ФБР рН 7,9 гидроксиапатит (ГАП), заполняют хроматографическую колонку. Гель промывают 0,05М ФБР до экстинкции 0,01 ед. Токсин элюируют с ГАП 0,2М ФБР рН 7,9. Полученный раствор токсина разводят в четыре раза дистиллированной водой, наносят на уравновешенную 0,025М ФБР, рН 7,9, целлюлозу ДЕАЕ-Sephacel, заполняющую хроматографическую колонку. Белок элюируют с ионообменника 0,11М ФБР, рН 7,9. С момента начала элюирования выходящую из колонки жидкость собирают фракциями [31].
     Ботулотоксины всех типов продуцируются в виде токсичных белковых комплексов, состоящих из нейротоксина и нетоксичного белка. Белок является стабилизатором токсина, защищает его от разрушающего действия протеолитических ферментов и HCl.
     Ботулотоксин в виде высокомолекулярного комплекса малотоксичен и является прототоксином. В результате мягкого протеолиза, осуществляемого у большинства типов токсина собственными эндогенными протеазами, а у типа E экзогенными протеазами (например трипсином), прототоксин распадается на 2 субкомпонента: L-лёгкий и H-тяжёлый. Между ними сохраняется дисульфидная связь. L-суб-компонент соответствует фрагменту A (активатор) и оказывает токсическое действие на клетку-мишень (мотонейрон). H-субкомпонент соответствует фрагменту В (акцептор) и осуществляет прикрепление к рецептору клетки-мишени [32].
     Ботулинический токсин широко применяется в медицине:
* используется при лечении судорог и дистонии
* лечение нервно-мышечной расстройств головы и шеи
* лечение блефароспазма, (неконтролируемого сокращения мышц или подергивание век)
* лечение подмышечного гипергидроза 
* лечение хронические мигрени
* лечение косоглазия 
     Ботулинический нейротоксин типа A  используется в современной косметологии под торговыми названиями «Ботокс», «Диспорт» и «Лантокс» [33].
     
     
     
     



ГЛАВА 2
КОНТРОЛЬ СИНТЕЗА И МЕТОДЫ ПОВЫШЕНИЯ ВЫХОДА ПРОДУКТА
     
     Получение повышенного выхода н-бутилового спирта при наименьших затратах было предметом многочисленных исследований и в настоящее время является одной из важных задач ацетоно-бутилового производства.
Существующее промышленное производство микробиологического синтеза н-бутилового спирта и ацетона основано на использовании ацетоно-бутиловых бактерий, относящихся к роду Cloctridium.
     На протяжении многих лет основным направлением исследований в мире по интенсификации и удешевлению производства н-бутилового спирта была замена пищевого сырья непищевым с одновременной адаптацией культуры C.acetobutylicum, выделенной еще в 30-е годы. Однако и в настоящее время на отечественных предприятиях при получении растворителей микробиологическим способом используют в основном муку злаковых культур.
За рубежом в последние годы, появляется большой интерес к получению растворителей методом брожения (США, Канада, АРЕ, ФРГ, Япония, Франция и др.). По имеющимся сведениям, н-бутанол и ацетон во многих странах получают синтетическим путем, бродильные производства становятся выгодными, благодаря использованию возобновляемых источников энергии и побочных продуктов (газов брожения) [34].
     Основными направлениями исследований являются: 
     1. Разработка новых технологических приемов по выделению конечных целевых продуктов.
     2. Иммобилизация бактериальных клеток [35].
     3. Регуляций таких показателей синтеза, как pH и количество микроэлементов.
     При повышенном содержании микроэлементов, нитратов и фосфатов, идёт преимущественно синтез бутанола, ацетона и этанола.
     С помощью регулирования значения кислотности, при которой происходит культивирование можно добиться сдвигов в сторону образования кислот или бутанола и ацетона. График зависимости концентраций полученных продуктов от pH представлена на рисунке 10.
     Как видно из графика, при pH = 4,3-4,8 идёт преимущественно синтез бутанола и ацетона. При pH?5 происходит образование ацетата и бутирата [36].
     
     
      Рисунок 10 – График зависимости концентраций продуктов АБЭ брожения от кислотности среды
     
     3. Конструирование новых штаммов ацетонобутиловых бактерий методами генетической инженерии.
     Одним из методов является инактивация формирования ацетона. Так как ацетон не может быть использован в качестве биотоплива, его производство планировалось свести к минимуму. В разное время делались попытки инактивировать ген, кодирующий фермент для образования ацетона. Однако данная инактивация практически полностью подавляла синтез бутанола. В настоящее время с помощью метаболической инженерии удалось преобразовать ацетон в изопропанол, который может использоваться в качестве добавки к топливу. Смесь изопроанола, бутанола и этанола (ИБЭ) получают благодаря использованию штамма Cl. acetobutylicum со встроенным геном, кодирующим ферменты, преобразующие ацетон в изопропанол [37].
     Обнаружено, что промышленныt штаммs в конце экспоненциальной фазы роста выделяет вещество аутобактериомицин, обладающий антибиотическим действием по отношению к продуценту, а также к четырем штаммам сем. Baciallaceae. Бактериологический эффект аутобактериомицина возрастает с возрастом клеток и концентрации бутанола. Это аутолизин. 
     Аутобактериомицин оказывает влияние на концентрацию биомассы и образование растворителей. Причем установлено, что если аутолизин прикреплен к клеточной стенке, то он играет положительную роль для роста. Если он освобождается и выделяется в среду в конце экспоненциальной фазы, то он вызывает лизис клеток. Освобождение аутолизина происходит в связи с отсутствием дивалентных катионов в среде. Если в среду добавить Mg2+, то увеличивается устойчивость культуры к бутанолу. Тот же результат получают с помощью ультрафильтрации, которая позволяет термально денатурировать аутолизин в течение всей ферментации.
     Методом химического мутаногенеза нитрозогуанидином в присутствии бутанола получен мутант Сl. acetobutylicum штамм 77. У мутанта более высокая удельная скорость, в два раза больше накопление биомассы по сравнению с исходным типом. В процессе ферментации дикий штамм потребляет 65г глюкозы, образуя при этом 20 г·л -1 растворителей в течении 53 ч. Рост мутантного штамма менее подвержен ингибирующему действию бутанола [38].
      5. Поиск сырья, заменяющего полностью или частично пищевое сырье, муку.
     Так в 1997 году в России был выведен штамм C.acetobutylicum S-3716, который использовал в качестве субстрата свеклосахарную мелассу. Данная технология позволяла за 36-40 ч получить до 15,5 г/л н-бутанола и до 6,5 г/л ацетона на средах с мелассой и минеральными солями, при этом конверсия углеводов в целевые продукты достигает 40%. Новый штамм был получен путем индуцированного мутагенеза и последующего отбора мутантных клонов на селективных средах. Отбор мутантов проводился по следующим признакам: устойчивость к повышенным концентрациям бутанола, недостаточность по образованию жирных кислот, устойчивость аллиловому спирту. Все эти признаки прямо или косвенно связаны с биосинтезом бутанола и ацетона [39].
     Также ведутся разработки по культивированию штаммов Cl. acetobutylicum на ксиланах [40], древесной стружке [41].
     Наибольшего прогресса добилась американская компания Environmental Energy. Предъявив ряд инженерных решений, компания заявила о создании полноценной технологии получения биобутанола. Компании был выдан патент США №5 753 474 «Непрерывный двухступенчатый анаэробный ферментационный процесс получения бутанола и других органических растворителей с использованием двух различных штаммов бактерий». Патент описывает технологию, которая позволяет надеяться на получение эффективного и экономически рентабельного бутанола.
     Оптимизация процесса АБЭ ферментации и получение бутанола посредством масляной кислоты, преобразованной из углеводов, позволило существенно увеличить выход, объемную производительность и концентрацию бутанола. Использование компанией Environmental Energy иммобилизированных культур Clostridium tyrobutyricum и Clostridium acetobutylicum позволяет получить оптимальную производительность бутанола 4,64 г/л/ч и выход 42% от веса глюкозы, или 2,5 галлонов на бушель зерна (35 фунтов крахмала/лактозы/ сахара).
     По сравнению с обычным АБЭ процессом, технология компании Environmental Energy устраняет производство нежелательных продуктов, включая уксусную, молочную, пропионовую кислоты, ацетон, изо-пропанол и этанол, таким образом, сохраняя углерод и производя только углекислый газ, водород, масляную кислоту и бутанол. Этот процесс удваивает выход бутанола с 1,3 галлонов до 2,5 галлонов на бушель зерна.
     Кроме того, .......................