Деминерализованный костный матрикс

    ВВЕДЕНИЕ
    В современных условиях актуальной задачей является разработка технологий производства новых и эффективных лекарственных форм. Одно из направления решений этих задач является обеспечение пролонгированного воздействия активных лекарственных компонентов внедрением их в резорбируемые пористые матрицы. При этом получаемый продукт должен иметь натуральную основу, должен обладать высокой чистотой и не содержать органических растворителей даже в малых количествах. 
     Поставленную данную задачу предполагается решить с применением сверхкритического СО2 в качестве растворителя и в качестве транспортирующей среды для биоактивных компонентов.
    Сверхкритические флюидные технологии на настоящий день, являются весьма перспективными технологиями, отвечающими всем условиями предъявляемым к современным производственным спец технологиям. СКФ технологии обладают  следующими  главными особенностями: 
    -высокая селективность извлечения; высокая чистота получаемых продуктов; 
    -легкость регенерации растворителя; 
    -экологичность (отсутствие остаточного растворителя). 
    В связи с этим сейчас разрабатываются и внедряются новые сверхкритические технологии с главной целью получения продуктов высокой чистоты. Среди них широко используемы и высокотехнологичные экстракты лекарственных растений; получение различных масел из растительного сырья, очистку медикаментов от технологических примесей; с последующей его пропиткой  данных препаратов добавками; формирование оболочек медикаментов на основе пищевых полимерных материалов и др.
    Способы сверхкритических флюидных  экстракций имеют ряд преимуществ по сравнению с традиционными технологиями, такими как экстракция, органическим растворителем и дистилляция. На настоящий день, практически все применяемые в современных промышленных процессах органические растворители весьма легко воспламеняются либо токсичны, основная часть из них обладают летучестью и ядовиты, что потребует дополнительных  расходов на их утилизацию или очистку. Выделение целевого продукта  требует высоких энергозатрат на выпаривание растворителя.
    Способ СКФ лишен практически всех вышеперечисленных недостатков, углекислый газ не токсичен, недорог и довольно легко регенерируется. Полученные с помощью сверхкритического CO2 экстракты не содержат остаточных количеств растворителя и не требуют дорогостоящей очистки.
    СКФ в качестве растворителя, обладает преимуществами как в газовой (высокий коэффициент диффузии, малая вязкость), так и жидких растворителях (высокой плотностью и растворяющей способностью). Изменением давления и температуры возможно изменять растворяющие способности флюида, что дает хорошую возможность получать фракции, которые обогащены различными компонентами. Это открывает новые методы разделения и очистки, что невозможно при применении обычных растворителей.
    Применение СКФ технологий в экстракционных процессах помогает решать проблемы с энергосбережением и удовлетворять постоянно возрастающие условия к экологичности продуктам питания, сырья и технологических процессов. На диаграмме (рис. 1) показаны области суб- и сверхкритического флюидного состояния.
     
    Рис. 1. P–T – фазовая диаграмма чистого диоксида углерода для различных изохор. Пунктирными линиями ограничена сверхкритическая область.
    В настоящий момент наблюдается тенденция ужесточения экологических условий, как к производимым продукциям, так и к условиям осуществлений  технологических процессов. Особенное внимание сейчас уделяется к пищевым, фармацевтическим и перерабатывающим отраслям индустрии, которые в последние годы занимаются одними из приоритетных направлений экономики России. На рис. 2 приведена схематичная технология получения ДКМ. Весь данный цикл получения ДКМ, включающего контроль биохимических и микробиологических параметров на любом этапе, занимает около 1,5 месяцев.
    
    Рис. 2. Обобщенная технологическая схема получения деминерализованного костного матрикса
     







ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.
    Одна из главных нынешних проблем современной травматологии и ортопедии – проблема изготовления костно-пластического материала, который эквивалентен по своим свойствам ауткости.
    Эффективные с клинической и биологической точек зрения пересадки свежей, полученной во время операции ауто-логичной спонгиозы чреваты некоторыми осложнениями. Например, как инфекция, тромбоэмболическая болезнь, повреждение кровеносных сосудов и нервов и др. Помимо того, количество этой ткани ограничено [3, 8]. Именно по этим причинам во всем мире ведутся постоянные поиски путей замены ауткости.
    Специалисты сформулировали главные условия к качествам трансплантатов-заменителей. Они обязаны заполнять весь костный дефект на определенный период времени, не должны вызывать реакции иммунологического отторжения и чтобы обладали способностями к биодеградации с поэтапным замещением костью [4, 6]. Помимо данных условий, высказывается желание о придании данным трансплантатам биологической активности.
    Существующие материалы, отвечающие указанным условиям, делятся на 3 группы [5]:
    – керамические (?-трикальцийфосфатная керамика, коралл, парижский пластырь и др.);
    – синтетические полимеры (поли-молочная кислота, полиактид-полигликолид сополимер, полиан-гидрид и полиортоэстер).
     – биоорганические (деминерализованный костный матрикс, коллаген, фибриновый клей, фибрин-коллагеновая паста); 
    Среди перечисленных материалов большой интерес вызывает деминерализованный костный матрикс (ДКМ), содержащий протеины, стимулирующие остео-генез [11, 40]. Правда деминерализованная кость не является такой эффективной в образованиях новых костей, как эндогенная губчатая кость, но она обладает преимущества перед консервированной аллогенной костью. Преимуществами матрикса являются его стерильность и сниженная антигенность [6, 8, 10].
    
    Деминерализованный костный матрикс
    Деминерализованный костный матрикс один из самых часто встречаемых материалов для костной пластики, вследствие его био-совместимости, лучшим остео-индуктивным и остео-кондуктивным качествами. Остео-индуктивные качества обеспечиваются наличием в ДКМ нативных костных морфогенетических белков. Остео-кондуктивные качества достигаются за счет того, что коллаген костных тканях имеет способности к адгезии остеогенных клеток. Для достижения хорошего клинического результата ДКМ должен быть освобожден полностью от минеральных компонентов и жиров, однако при этом в нем нужно также сохранить активность нативных костных морфогенетических белков (Iwata Н, Sakano S, Itoh T, Bauer TW). Demineralized bone matrix and native bone morphogenetic protein in orthopaedic surgery. // Clin Orthop Relat Res. 2002 Feb; (395): 99-109). Данные белковые факторы могут содержатся в костях в небольших количествах (по разным источникам от 2 до 180 мкг костных морфогенетических белков на 1 кг кости). 
    В зависимости от методов получения, ДКМ способен обладать любыми качествами. Но потеря костных морфогенетических белков сильно снижает его остео-индуктивные особенности получаемого сырья, степень деминерализации влияет на остео-кондуктивные качества сырья, а содержание белков крови и липидов влияет на способность материала вызывать иммунный ответ. Влажность и стерильность продукта влияют не только на время, но и на условия его хранения. 
    Таким образом, используемый в клинических практиках ДКМ обязан иметь несомненные стандартизуемые параметры. К таким параметрам относят: 
    -уровень рН,
    -размер частиц, 
    -содержание нативных костных морфогенетических белков, 
    -содержание кальция и липидов.
    Для разных клинических целей необходим ДКМ с разной степенью деминерализации (содержание кальция 1-50 мг/г продукта) и размерами частиц (от 0,5 до 2 мм). А для сохранения активности костных морфогенетических белков при хранении продукта его влажность не должна превышать 3-5%, а уровень рН должен быть в диапазоне от 4,5 до 7,5, общее содержание костных морфогенетических белков ВМР-2 и ВМР-7 250-350 нг/г продукта. Для уменьшения рисков иммунного ответа на введение сырья, а также для максимального высвобождения белковых факторов роста кости уровень липидов не должен превышать 2%.
    
    Получение ДКМ
    Деминерализованный костный матрикс изготавливают из губчатого слоя большеберцовой кости крупного рогатого скота. Сразу после механической фрагментации до нужного размера проводят биохимическую очистку от белковых и жировых компонентов. Для деминерализации могут применяться разные кислоты (соляная, азотная, ортофосфорная и др.) в разных концентрациях и с разной экспозицией, при различных соотношениях объема обрабатываемой массы (грамм трансплантата) и кислоты (мл) [3, 7, 12, 13, 43]. Опыты продемонстрировали, что наиболее всего для деминерализации подходит соляная кислота (0,6 N) при соотношении массы кости и объема кислоты 1 : 10.
    Материалом, который сочетает в себе остео-кондуктивные и остео-индуктивные качества, является ДКМ [3, 5, 8, 30, 38, 39, 43]. Он обладает высокой пористостью и лучше резорбируется при заполнении его в костный дефект, так как его волокнистая основа является натуральным для организма субстратом. Время резорбции имплантируемого ДКМ возможно изменят степенью деминерализации первичной нативной кости[8,9]. В процессе резорбции ДКМ, состоящей из коллагеновых волокон, служит необходимым строительным материалом для образования новой кости [18, 31]. 
    ДКM имеет преимущества по сравнению с альтернативными имплантатами:
    – матрикс имеет высокую пористость;
    – инертен по взаимоотношению к окружающим тканям;
    – содержит факторы роста (стимулирует остеогенез, ангиогенез, ускоряет созревание и кальцификацию костного матрикса);
    – волокнистая основа является натуральным субстратом для организма; 
    – способен адсорбировать и выделять в течение некоторого времени лекарственные средства, стимуляторы остеогенеза (например, гормоны).
    – деминерализованный трансплантат может являться матрицей для прорастания первичных сосудов;

    Получение ДКМ в виде различных по размеру фракций костной крошки
    Для получения ДКМ в формах фракций костные крошки разного диаметра, отмытая крошка подвергается измельчению на мельнице с дальнейшим фракционированием его на приборе Грохот ВП-30Т («Вибротехник», Россия) сквозь сита с диаметром отверстий 0,04–2,0 мм. В итоге разделения получается 5 фракций костной крошки: 40-125 мкм, 125-250 мкм, 250-500 мкм, 500-1000 мкм, 1-2 мм (рисунок 7).  
 
    Рисунок 7. Фотографии образцов различных фракций крошки из ДКМ разного диаметра. А – 40-125 мкм, Б – 125-250 мкм, В – 250-500 мкм, Г – 500-1000 мкм, Д – 1-2 мм.
    При применении в момент операции, возможно, комбинировать крошку с остео-пластическими сырьем в виде блоков для того чтобы улучшить их остео-индуктивности. Для большего удобства имплантации, возможно, заблаговременно пропитывать образцы крошек умеренным количеством стерильного физ-раствора либо собственной кровью пациента до момента получения однородной массы, однако при этом нужно ограничить миграцию крошек ДКМ из зоны имплантации.
    
    Получение малоинвазивных остео-пластических материалов
    Малоинвазивные формы остео-пластического сырья используются в случаях, когда возможно провести только низко-травматичные виды оперативного вмешательства, так например, в случае закрытого остеосинтеза. Препараты этого класса лучше использовать в инъекционном виде, в шприцах.  В качестве носителя rhBMP-2  может применяться ДКМ, который представляет собой фракцию костных крошек с размерами <125 мкм (рисунок 8).  

    Рисунок 8. Фракция ДКМ размерами <125 мкм, используыемые для приготовления образцов остео-пластических материалов для малоинвазивного применения: А. Макрофотограмма образца в чашке Петри; Б. Фото образца, которое полученно с помощью сканирующей электронной микроскопии, X25.  
    Маленький диаметр частиц крошек обеспечивается отличным прохождением сквозь иглы размеров от 18G до 23G. Помимо того, за счет повышения площади контакта частиц крошки, значительно увеличивается био-доступность остаточного нативного BMP-2 и внесенного рекомбинантного rhBMP-2, что намного улучшает остео-индуктивные качества сырья. Для повышения формообразующих свойств малоинвазивного остео-пластического сырья их ввели в смесь в качестве вспомогательного компонента гиалуроновую кислоту в количестве 10%.  
    
    Получение ДКМ в виде костных блоков
    Изготовления остео-пластического материала в виде блоков разного размера ДКМ подвергался распиливанию на ленточной пиле. Образцы представлены на рисунке 9.
    
    Рисунок 9. Образцы остео-пластических материалов в виде блоков различной формы (слева направо): призматической, параллелепипедной, кубической.
    Блоки из ДКМ используются для полного восполнения больших объемов утерянной костной ткани. Вследствие многообразной формы и размеров, они легко изменяемы для всякого конкретного случая использования,  возможностью заполнять дефекты фактически каждой сложности. Блоки из ДКМ возможно использовать в сочетаниях с костной крошкой для более полного заполнения пространства дефектов и усиления регенеративноых эффектов.  
    
    Требования к материалам для инженерии костной ткани
    В совершенстве, материалы и изделия из данных материалов, используемые в инженерии костной ткани, обязаны соответствовать ряду условий. Так, например, био-совместимость является незаменимым условием для всех без исключения материалов, применяемых в тканевой инженерии,  включая и для потенциальных продуктов их деградации. 
     
    Пористость, размер и открытость пор, микроструктура
    Хоть аутогенные трансплантаты кости давно считаются золотым стандартом, с которыми сравниваются другие альтернативные виды трансплантатов, полнейшая имитация структуры костей не является нужным условием для скаффолдов, применяемых в инженерии костной ткани. Хорошо знакомо, что высокая пористость, размер пор и  их связанность приводят к более активному прорастанию  кости в естественных условиях. Размер пор больше, чем 300 мкм, считается приемлемым для поддержания перемещения тканей, переноса питательных веществ и формирования капилляров, тогда как  соединяющие поры обязаны быть больше, чем 100 мкм. Микроструктура играет весомую роль в остео-генезе. 
       
    Управляемая деградация
    Регенерации кости и последующее ремоделирование происходит в течение нескольких месяцев, в связи с этим для скаффолдов весомым параметром является скорость деградации и возможность её контроля, для того, чтобы опять регенерированная костная ткань постепенно дополняла потери механической поддержки со стороны родной кости с нужной скоростью. Однако, большая часть нынешних экспериментов уделяет больше внимания микроструктуре и механическим качествам скаффолдов,  и намного меньше внимания скорости деградации.  
    
    Совместимость с другими технологиями и биоматериалами
    Поскольку ни одна индивидуальная спец технология не способна вызвать регенерацию костной ткани приемлемо, то сочетание разных технологических платформ является больше всего адекватной стратегией для инженерии костной ткани. Соотвественно, крайне весомо, чтобы разрабатываемые подложки бытли совместимы с альтернативными скаффолдами и биоматериалами. В частности, подложки обязаны обладать довольной гибкостью, чтобы также служить в качестве наполнителей либо носителей для роста клеток, доставки белка либо генной терапии.  
    
    Способы изготовления матриксов для тканевой инженерии
    За последние десятилетия было создано множество разных техник получения пористых подложек, полимеризация, порообразование с применением газов и т.д.  Преимуществами данных традиционных способов изготовления являются, как правило, простота процесса получения без потребности специализированного оборудования, а также возможность комбинации с альтернативными методами. Среди всеобщих недостатков возможно отметить: 
    -присутствие денатурирующих биоактивных молекул, введенных в полимер, 
    -вероятное сохранение токсичного растворителя в полимере,
    -неконтролируемое распределение добавляемой керамики 
    -ограничение в формах, которые возможно получить,
    -трудности в стандартизации размеров пор в заранее определенных формах.  
    
    Формование из раствора и послойное формование мембран
     Формование из раствора в большинстве случаев применяется для получения плоских листов и трубочек методом растворения полимера в благоприятном растворителе и заливания в определенную форму, с дальнейшим удалением растворителя. Пористость можно достигнут комбинацией с методом выщелачивания либо лиофилизацей . Плоские листы, изготавливаемые из литья растворителя и послойным формованием мембран, применяются для контролируемого высвобождения лекарственных средств и белков.  
  
    Порообразование с использованием газов
    Использование сверхкритического CO2  
    При получении и модификации полимерного сырья в свойстве сверхкритической жидкости в основном применяется СО2. Это экологически безопасное, нетоксичное и недорогое соединение, которое легко удаляется из сырья после завершения процесса. СО2 имеет способностью легко проникать в глубь и пластифицировать полимерные материалы. При нахождении полимера в среде CO2 при повышенном давлении совершается сорбция газа  полимером, которая приводит к существенному уменьшению температуры стеклования. Таким образом, такой полимер характеризуется увеличенной подвижностью сегментов и цепей и увеличенным расстоянием между ним. Преимуществами такого метода являются в отсутствии органических растворителей и больших температур, а также стабильность метода. Это позволяет применения биоактивных молекул и увеличения биосовместимости. 

    Компрессионное формование
    Материал загружается в заблаговременно нагретую форму так, для того чтобы все его части соприкасались с ней. Температура и давление поддерживаются в форме до момента затвердения формуемого сырья. Особенностями компрессионного формования представляется в изготовление сложных форм, простота метода и  возможность комбинации с прочими методами, а также приспособленность к крупномасштабному производству. К недостаткам, возможно, отнести сравнительно высокие изначальные расходы на пресс- форму и утомительную оптимизацию протокола. 

    
    3D – принтирование
    3D печать все чаще применяется в тканевой инженерии с тех пор как она была впервые создана в Массачусетском технологическом институте. Существуют всяческие модификации, однако главное – это  печать на основе порошка  и на основе расплава. В момент обработки, скорость потока и угол подачи полимерного сырья, возможно, управляться с помощью автоматизированного проектирования (CAD) модели. Таким образом, этот способ может быть использован как для изготовления сложной внутренней структуры, так и для создания макрообъектов 3D формы. В тканевой инженерии с помощью 3D-печати возможно создавать как керамические так и полимерные подложки. Сложность удаления несвязанного порошка в глубине пористой структуры и применением органических связующих растворителей являются главным недостатками метода.  
    
    1.СВЕРХКРИТИЧЕСКИЕ ФЛЮИДНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ
    1.1Свойства сверхкритических флюидов
     Более полувека прошло с того момента, как была изучена  способность сверхкритических флюидов растворять мало летучие твёрдые материалы. Не смотря на все это, возможностью её промышленного применения начали интересоваться только в 70-е годы прошедшего столетия. В то время впервые предположили, что сверхкритические флюиды возможно использовать в экстракционных процессах. Это также помогло бы решить   затруднения энергосбережения и экологичности производства. 
     В окрестностях критической точки рост восприимчивости системы к внешним воздействиям имеет аномальный характер. К примеру, в области 1<Т/Ткр<1,1 и 1<Р./Ркр<2 значение изотермическая сжимаемость резко возрастает (рис. 1)  . Таким образом, незначительно меняя давление процесса, возможно серьезно изменять плотность флюида и его растворяющую способность. Такие аномальные превращения испытывают можно сказать все термодинамические и транспортные свойства в сверхкритическом состоянии. Явление носит универсальный характер, что свойственно всем газам. Все эти свойства помогают осуществить и реализовать без реагентные и безотходные пути переработки сырья, применяя сверхкритические флюиды. 
     Окрестность критической точки остается весьма сложной темой для исследования. Это связано с тем, что процессы в окрестности критической точки сопровождаются высокой температурной неустойчивостью вещества, присутствием гравитационного эффекта и критической опалесценции. Невзирая на данные сложности, новые методы изучения помогают благополучно исследовать эту тематику. Так например, исследованию поведения температуро-проводности вещества в околокритической области поспособствовало созданию лазерной техники, а значит возможности измерения ширины линии Релея в спектре рассеянного света, а также разработка интерферометрических методов изучения. 
     Энергосберегающий характер процесса сверхкритической экстракции заключается в том, что всю регенерацию экстрагента возможно провести,  лишь изменяя температуру либо давление. Сей метод намного менее затратный, нежели способ с реагентами либо дистилляцией. 
     
    
    
    
    Рис. 1. Изотермическая сжимаемость сверхкритического диоксида углерода, рассчитанная на основе P, ?, T данных:
    1 - Т = 304,35 K; 2 - 305,25 K; 3 - 307,95 K; 4 - 313,15 K; 5- 323,15 K; 6-343,15 K
     Суб- и сверхкритическая флюидная спец технология развивается весьма быстро. За период с 1976 г. по 1997 г. зарегистрировано более 800 патентов на процессы либо аппараты, применяющие сверхкритические флюиды. Среди них методы очистки реагирующих мономеров; полимеризации в сверхкритических условиях; управления кинетикой кристаллизации в среде сверхкритического флюида; экстракция остаточных растворителей, катализатора, мономеров и олигомеров; фракционирование; рекристаллизация полимеров по методу сверхкритического анти растворителя; пропитку полимеров разными модификаторами и добавками. Примерами крупного промышленного использования СКФ технологий являются производства по декофеинизация кофе сверхкритическим диоксидом углерода и деасфальтизация тяжелых фракций нефти сверхкритическим пентаном. Несмотря на высокое свойства получаемых впоследствии продуктов, с экономической точки зрения СКФ экстракционные процессы все еще крайне дороги. Сегодня большинство изучений направлено на технико-экономическую оптимизацию данных процессов. 
    
    
    
    Преимущества сверхкритических флюидов.
    Применение суб- и сверхкритических флюидов в качестве растворителя и экстрагента в экстракционных процессах являются одним из методов решения проблем энергосбережения и удовлетворения возрастающих условий к экологичности сырья и технологических процессов  целиком.
    В процессах сверхкритической экстракции в качестве экстрагента применяют флюиды, находящиеся при сверхкритических условиях. В окрестности критической точки появляется резкая аномалия всех без исключения термодинамических и транспортных свойств растворителя, что обуславливает их большую растворяющую способность в сверхкритических условиях по сравнению с обычными условиями.
    Сверхкритическая технология обладает рядом преимуществ по сравнению с традиционными методами, как например, легкость регенерации растворителей и возможности подачи его на рецикл, большой выход и высокое качество экстрагируемых продуктов, отсутствие остаточного растворителя в экстракте, одно-стадийность операции, селективность извлечения.
    При сверхкритическом экстрагировании, так же как и при обычной экстракции, большое значение имеет выбор растворителя. Весомой характеристикой растворителя представляет селективность, или избирательность (способность извлечения одного из компонентов смеси). При этом больше всего приемлем растворитель, который имеет летучесть того же порядка, что и целевой компонент. Регулируя селективность изменением температуры и давления в системе, возможно, воздействовать и на прочие компоненты смеси и таким образом управлять процессом сверхкритической экстракции.
    При выборе растворителей следует также учитывать его регенерируемость, т.е. возможность отделения растворителя от растворенноых веществ по завершению экстрагирования с минимальными энергетическими затратами и максимальной чистотой конечного продукта. Желательно, чтобы растворитель имел невысокие значения критических параметров.
    
    1.3 Энергосбережение сверхкритической флюидной экстракции
    Энергосберегающие мероприятия при проведении процессв  сверхкритических флюидных экстракции реализуются за счет технологических особенностей процесса. Весьма удобно, то, что растворяющая способность сверхкритических флюидных сред регулируется изменением давления и температуры протекания процесса. Также важным энергосберегающим аспектом является процесс регенерация растворителя. Регенерация растворителя в процессе СКФ экстракции проводится путем снижения температуры и давления процесса. Вследствие этому, не требуется принимать для регенерации растворителей таких затратных мер, как дистилляция.
    Еще огромного энергосбережения при проведении процесса экстракции, возможно, достичь, сконструировав механизм безостановочной подачи первичного материала и отбора рафината с экстрактом. Стоит добавить, что благодаря высокой скорости разделения компонентов, совершается большая экономия электроэнергии. 

    СКФ-технологии
    Сверхкритические флюиды начали широко применяться лишь с 1980-х годов, когда всеобщий уровень развития промышленности предоставил выполнить установки для получения СКФ общедоступными. С этого времени начались усиленные развития сверхкритических технологий. Сначала экспериментаторы сосредоточили свое внимание на высоких растворяющих способностях СКФ — на фоне традиционных методов применение сверхкритического флюида выявились весьма эффективными. СКФ — это не только лучшие растворители, но и вещества с большими коэффициентами диффузии, т. е. они легко попадают в глубинные слои разных твердых веществ и сырья. Больше всего широкое применение начали сверхкритический СО2, который занимает первые позиции в мире сверхкритических технологий, потому что имеет целый комплекс преимуществ. Перевести его в сверхкритическое состояние не затруднительно (tкр — 31°С, Ркр — 73,8 атм), помимо того, он не токсичен, не горюч, не взрывоопасен и к тому же недорог и общедоступен. С точки зрения всякого технолога СО2 является совершенным компонентом каждого процесса. Главную особенность ему придает то, что он является составной частью атмосферного воздуха и, соответственно, не загрязняет окружающую среду. Сверхкритический СО2 возможно считать экологически чистым растворителем. На рис. 2 представлена принципиальная схема сверхкритического компрессорного экстракционного цикла. В методе жидкостного цикла в схема добавляется теплообменными аппаратами, которые обеспечивают перевод экстрагента в жидкую и сверхкритическую фазу соответственно, до и после жидкостного насоса. В настоящее время  для сверхкритических флюидов нашли применение в областях обработки полимеров, получения наночастиц, синтеза и получения биоматериалов, для импрегнации и создания микропористых материалов, экстракции металлов и т.д. Таким образом,  сверхкритические флюидные технологии не ограничиваются экстракционным процессом, а включают еще процессы сушки по сверхкритическим траекториям, диспергирования и импрегнацию (пропитки пористых матриц) с рабочими средами в сверхкритических флюидных состояниях. Есть также возможности использования  СКФ в  средах для проведения химических реакций. Не менее результативны и сферы применения сверхкритических флюидных хроматографий.
    
    Рис. 2. Принципиальная схема сверхкритического компрессорного изотермического экстракционного цикла
    1-экстрактор, 2-дроссельный вентиль, 3-сепаратор, 4-компрессор T1=T2, P1>>P2
    
    СКФ в процессе импрегнации.
     Новейшие способы для импрегнации полимерного материала низкомолекулярными функционально активными соединениями связываются с 
применением сверхкритических флюидных (СКФ) сред, прежде всего, сверхкритического диоксида углерода (ск-СО2) [11]. Сей способ, который позволяет управлять функциональными качествами вводимых в полимерную матрицу соединениями, изменяя параметры СКФ в процессе полимеризации и модификации полимеров – давление, температуру, – и применяя со-растворители, демонстрирует большую эффективность и при внедрении в полимерные матрицы индолиновых спирооксазинов (ИСО). Невысокие показатели вязкости и поверхностного натяжения, характерных для СКФ, позволяют осуществить доставку химического реагента в область свободного объема в полимерах. При этом же вероятно применение как растворимых в ск-СО2 веществ, так и агентов, которые слабо растворяются в ск-СО2, и даже нано-частиц [12-14]. Плохая сольватирующая способность ск-СО2 как к вводимым компонентам, так и к фрагментам полимерных матриц обусловливают эффективным удалением СО2 из системы полимера/ИСО по завершению процесса СКФ-импрегнации.
     Среди изученных методов для создания и модификации особенное положение имеют сверхкритические флюидные импрегнации. Большой интерес к сверхкритическому флюиду как к средам для импрегнации полимеров материалами разной природы обусловлен качествами СК флюидов. В среде ск-СО2 выполняют также импрегнации разного полимерного материала веществами любой разной природы – от органического металла до лекарственного препарата и органического красителя. Преимуществами этого способа являются получение чистых экологических безопасных комплексных полимерных систем, а к недостаткам – плохая растворимость в полярных соединениях в ск-СО2. Для увеличения растворимостей к ск-СО2, как уже было сказано, в многих случаях добавляются полярные вещества, которые называют энтрайнерами. В качестве энтрайнеров больше всего неоднократно применяются этанол, метанол, вода и др. [109].
     В большинстве случаев процесс импрегнации полимера содержит 3 главных этапа: 
     1) набухание" полимера и "растворение" введенного в реактор соединения в ск-СО2; 
     2) транспорт "растворенного" агента (молекул либо более крупных частиц) в истинном растворе либо в СКФ-коллоиде и его стабилизация в объеме образца; 
     3) удаление СО2 из полимерной матрицы.
     Как было уже отмечено выше, при обработке сверхкритическим СО2 полимер набухает, в последствии чего улучшается подвижность полимерных цепей, это, приводит к большему облегчению и ускорению процессов переноса растворенных в ск-СО2 веществах в глубине полимерной матрицы. Известно, что степень набухания полимеров и изменения его микроструктуры зависят от его химической природы полимера и способностями взаимодействовать с СО2.
    Принципиальная схема экспериментальной установки импрегнации дана на рисунке 2. 3 основных частей установки пропитки это:
    - водяная баня, содержащая трубы и колонны, незаменимые для работы
    - насос высокого давления модель Constametric 3200 P/F, способный гарантировать регулярное давление либо режим безостановочного расхода.
    - Уф-детектор (microUVIS20 — Carlo Erba Instruments), соединенный с ПК. ПК записывает объем поглощения и время. СО2 поступает из баллона высокого давления. Цилиндры насоса охлаждаются до 0°С с помощью холодильника (Haake F3),для того чтобы поддерживать СО2 в жидком состоянии во время сжатия. Водяную баню поддерживали при постоянной температуре с точностью ±0.1°C.
    Поток СО2 проходит сквозь вентиль Va, а дальше через насытительную колонну (длина 200 мм, внутренний диаметр 9.3 мм),содержащий препарат. В данной колонне поток растворителя насыщается препаратами. Данную колонну также можно обойти с помощью двух тройных вентилей (Vc1, Vc2). Насыщенный поток СО2 встречается первым датчикм давления PI 1 (DS Europe, LP 632) и стремится к шестиступенчатому вентилю V6, способный привести к колонне с образцом либо обойти ее. Полимер  содержится в колонне с образцом (длина, 30 мм; внутренний диаметр, 3.7 мм) и удерживается на месте с помощью двух хроматографических фритт (Supelco) для предотвращения движения полимера. Уже после прохождения клапана V6 поток встречается вторым датчиком давления PI 2 и затем проходит сквозь УФ-детектор. Отходящий поток дальше поступает к очистительной колонне, в котором содержится активированный уголь для того чтобы удалить прочие вещества из потока СО2. Очистка нужна для предотвращения загрязнения либо засорения понижающего клапана Vx. Уже после вентиля Vx поток  при атмосферных условиях проходит через расходомер (Bronkhurst) ,измеряющий расход потока растворителя и всеобщий объем.
     
    Все части пропиточных оборудований сделаны из нержавеющей стали, соединительные трубки имеют внутренний диаметр 1/16 дюйма.
    
    МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТОВ
    Экспериментальные методы
    Исследование по очистке матрикса проводятся на лабораторной проточной установке, реализующей взаимодействие потока сверхкритического флюида с обрабатываемым материалом [1] (рис.1).

    Рис. 2. Схема лабораторной установки сверхкритической экстракции  с
    насосным циклом работы.
    
    
    2.2 Схема лабораторной установки сверхкритической экстракции
    Перед началом исследования производится подготовка установки. Она содержит: термостатированние термостатов 5, 7 и криостата 4. Очистку, промывку экстрактора техническим спиртом. 
     Для осуществления эксперимента производится выемка исследуемого образца из морозильной камеры, дальше наружний осмотр, если нужна очистка от обледенения. Далее образец взвешивается на электронных аналитических весах марки ЕТ-600-П-Е с точностью ±10–5 кг. и загружается в экстрактор. Предварительно экстрактор и коммуникации промываются диоксидом углерода при избыточном давлении 0.3-0.4 МПа. Заполнение экстрактора диоксидом углерода производится с расходом, не превосходящим 3 гр/мин., для предотвращения гидроудара. Уже после достижения в экстракторе рабочего давления, вентиль перед экстрактором открывается полностью. Процесс термостатирования продолжается до тех пор пока температура в экстракторе, измеряемая термопарой (Т2), не достигнет заданного значения. Регулирование расхода экстрагента осуществляется игольчатым вентилем и рестриктором с соответствующими параметрами. Из экстрактора раствор исследуемого вещества в сверхкритическом диоксиде углерода поступает на обогреваемое дросселирующее устройство (8), на котором происходит падение давления, и растворитель утрачивает растворяющую способность. Растворенный компонент осаждается в накопительной емкости (9).
    Электронный блок управления шприцевого насоса (3) фиксирует объем растворителя, прошедшего за время эксперимента при заданном давлении в цилиндре насоса. 
    После прохождения сквозь экстрактор заданного количества экстрагента экстрактор вместе с дроссельным аппаратом отсоединяется от коммуникаций и осуществляется плавное и медленное выравнивание давления с окружающей.......................