Биология и морфология Azotobacter

1. Биология и морфология Azotobacter
     Азотобактер — род бактерий, живущих в почве и способных в результате сложного процесса азотфиксации перерабатывать газообразный азот в растворимую форму, которая доступна для усваивания растениями.
     Род азотобактер принадлежит к группе грамотрицательных бактерий и относится к так называемым  свободноживущим азотфиксаторам. Представители этого рода живут в нейтральных и щелочных почвах, воде,а так же в группе с некоторыми растениями. Образуют особые покоящиеся формы — цисты.
     Этот род бактерий играет особую роль в круговороте азота в природе, связывая недоступный растениям атмосферный азот и выделяя связанный азот в виде ионов аммония в почву. Используется человеком для производства азотных биоудобрений, является продуцентом некоторых биополимеров.
     Первый представитель рода, Azotobacterchroococcum, был открыт и описан еще в 1901 году голландским микробиологом и ботаником Мартином Бейеринком. На данный момент в род входят шесть видов.
     
     Рис.1
     Научная классификация
     Царство:	Бактерии
     Тип:	Протеобактерии
     Класс:	GammaProteobacteria
     Порядок:	Pseudomonadales
     Семейство:	Pseudomonadaceae
     Род:	Азотобактер
     Латинское название
     AzotobacterBeijerinck, 1901
     Виды:
     Azotobacterarmeniacus
     Azotobacterbeijerinckii
     Azotobacterchroococcumtypus
     Azotobacternigricans
     Azotobactersalinestris
     Azotobactervinelandii
     
     Морфология
     
     Клетки представителей рода Azotobacter: видны палочковидные и кокковидные клетки различного размера, окраска железным гематоксилином по Гейденгайну, ? 1000
     Клетки бактерий рода Azotobacterдовольно крупные, обычно имеют овальную форму, но обладают плеоморфизмом, то есть могут иметь разную форму — от палочковидной до сферической. При микроскопическом исследовании можно увидеть, что в препаратах клетки располагаются одиночно, парами, неправильными скоплениями или, изредка, цепочками различной длины. Формируют особые покоящиеся формы — цисты, не образуют спор.
     Выяснено, что в свежих культурах клетки подвижны за счёт многочисленных жгутиков, а в более поздних клетки теряют свою подвижность и  приобретают почти кокковидную форму и выделяют обильный слой слизи, который формирует капсулу клетки. На форму клетки оказывает влияние и химический состав питательной среды —например,пептон, вызывает плеоморфизм и, в том числе, индуцирует образование так называемых «грибоподобных» клеток.  Именно аминокислота глицин оказывает индуцирующее влияние на плеоморфизм в культурах представителей рода азотобактер в составе пептона.
     
     Рис. 2 Клетки представителей рода Azotobacter: отчетливо видны кокковидныеи палочковидные  клетки разного размера, окраска железным гематоксилином по Гейденгайну, ? 1000
     
     При микроскопическом исследовании в клетках могут наблюдаться различные включения, часть из которых подвергается окрашиванию, а часть остаётся бесцветными. В начале XX века считали, что прокрашиваемые включения есть «репродуктивные гранулы», или гонидии, и они принимают участие в размножении клетки, являясь своеобразными «зародышевыми» клетками, но затем было доказано, что гранулы не участвуют в размножении клеток и не являются «малыми, коккоподобными репродуктивными клетками» бактерий — гонидиями. Состав прокрашиваемых гранул составляют зерна волютина, неокрашивающиеся же гранулы являются каплями жира. Гранулы являются резервным источником питания.
     
     Цисты
     
     Циста - сферическое тело, состоящее из так называемого центрального тела: уменьшенной копии вегетативной клетки с большим количеством вакуолей, и двуслойной оболочки, внутренняя часть которой называется интима и имеет волокнистое строение, а внешняя называется экзина и представлена ровной, отражающей структурой, имеющей гексагональное кристаллическое строение.Экзина частично гидролизуется трипсином и устойчива к действию лизоцима, в отличии от центрального тела. Центральное тело может быть изолированно в жизнеспособном состоянии некоторыми хелатирующими агентами.  Главными компонентами внешней оболочки цисты являются алкилрезорцинолы, состоящие из длинных алифатических цепей и ароматических колец. 
     Цисты представителей рода Azotobacter более устойчивы к действию неблагоприятных факторов внешней среды, чем вегетативные клетки — так, цисты в два раза более устойчивы к действию ультрафиолетового излучения чем вегетативные клетки, устойчивы к высушиванию, гамма-излучению, солнечной иррадиации, действию ультразвука, однако не являются устойчивыми к действию высоких температур.
     Формирование цист индуцируется изменением концентрации питательных веществ в питательной среде и добавлением некоторых органических веществ. Цисты редко образуются в жидких питательных средах. Инцистирование может быть индуцированно химическими факторами и сопровождается метаболическими сдвигами, изменениями в катаболизме и дыхании, изменениями в биосинтезе макромолекул. Определённое значение в индукции инцистирования имеет альдегиддегидрогеназа, а также регулятор ответа AlgR.
     
     Прорастание цист
     
     Цисты представителей рода Azotobacter являются покоящимися формами вегетативной клетки, необходимыми для того, чтобы пережить неблагоприятные факторы внешней среды, и не служит для размножения. После того как оптимальные условиявозобновляются, такие, как оптимальное значение pH, температура и поступление доступного источника углерода цисты прорастают, образовавшаяся вегетативная клетка вновь размножается путём простого деления клетки. При прорастании цисты ее экзинаповреждается, и высвобождается большая взрослая вегетативная клетка.
     При микроскопии первым признаком прорастания спор проявляется постепенное понижение преломления света цистой при фазово-контрастной микроскопии. Само прорастание цист — это достаточно медленный процесс и длится он около 4—6 часов, на протяжении которых центральное тело цисты увеличивается и происходит захват зеренволютина, которые прежде находились в интиме. Затем экзинаразрушается и вегетативная клетка высвобождается из экзины, имеющей характерную подковообразную форму. В процессе прорастания цисты отмечаются характерные метаболические изменения. Сразу после прибавления источника углерода к среде цисты начинают активно поглощать кислород и выделять двуокись углерода, скорость дыхания повышается до максимальных значений через 4 часа после прибавления глюкозы. Синтез белков и РНК также начинается после прибавления источника углерода к среде, но интенсивный синтез макромолекул отмечается только через 5 часов после прибавления источника углерода. Синтез ДНК и фиксация азота инициируются лишь через 5 часов после того, как молекула глюкозы прибавленияется к безазотистой питательной среде.
     Во время того, как циста прорастает, отмечаются изменения в интиме, которые видны на электронно-микроскопических препаратах. Интима состоит из углеводов, липидов и белков и занимает почти такой же объём в клетке, что и центральное тело. Во время прорастания цист интима гидролизируется и используется клеткой для синтеза компонентов клетки.
     
     Физиологические свойства
     
     Бактерии получают энергию в ходе окислительно-восстановительных реакций, они используют в качестве донора электоронов органические соединения. Для их роста необходим кислород, но способны расти лишь при пониженных концентрациях кислорода, образуют каталазу и оксидазу.Так же используюттакие вещества, как  углеводы, спирты и соли органических кислот в качестве источников углерода. Азотбактерии способны фиксировать по крайней мере 10 мкг азота на грамм потреблённой глюкозы, фиксированиеазота зависит от ионов молибдена, отсутствие его может быть частично замещено ионами ванадия. В качестве источников азота могут использовать так же нитраты, ионы аммония и аминокислоты. Оптимальное значениеpH для роста и фиксации азота равно 7,0—7,5, но способны расти и в диапазоне pH от 4,8 до 8,5. Возможен также зависимый от водорода миксотрофный рост представителей рода Azotobacter на безазотистой питательной среде, которая содержитманнозу.  Не исключена возможность миксотрофии у представителей рода Azotobacter в природных условиях, так как водород доступен в почве.
     
     Культуральные свойства
     
     Как уже указывалось выше, представители рода Azotobacter способны использовать углеводы, спирты и соли органических кислот, в том числе и бензоаты, в качестве источника углерода и энергии. Представители этого рода растут на безазотистых средах, которыепредназначенны для выделения свободноживущих азотфиксирующих и олигонитрофильных организмов, например на среде Эшби, содержащей источник углерода и необходимые микроэлементы, или на среде М. В. Фёдорова, содержащей больше микроэлементов, а также на жидкой среде Бейеринка.
     На плотных питательных средах представители рода образуют плоские, покрытые слизью  колонии пастообразной консистенции диаметром 5—12 мм, в жидких питательных средах образуют отчетливые плёнки. Характерно также пигментирование, колонии могут быть окрашены втёмно-коричневый, зелёный и других цветов, но могут быть и бесцветными в зависимости от принадлежности к виду. Представители рода Azotobacter являютсямезофильными микроорганизмами, они растут при температуре 25 - 35 °C.
     
     Пигменты
     Представители рода Azotobacter продуцируют различные пигменты. Так, типовой вид рода Azotobacterchroococcum продуцирует тёмно-коричневый пигмент меланин, который является водорастворимым.  Образование меланина у Azotobacterchroococcumвозможно при высоких уровнях дыхания во время фиксирования азота и, видимо, защищает нитрогеназную систему от воздействия кислорода при аэроадаптации. Другие виды рода Azotobacter тоже продуцируют пигменты от салатового до пурпурного цвета. Также представители данного рода способны производить зеленоватый флюоресцирующий пигмент, который флюоресцирует жёлто-зелёным светом и пигмент, флюоресцирующий бело-голубым светом.
     
     
     Геном
     Определение нуклеотидной последовательности хромосомы Azotobactervinelandii штамма AvOP частично завершено. Хромосома Azotobactervinelandii — это кольцевая молекула ДНК размером 5 342 073 пар нуклеотидов и содержит 5043 генов, из которых 4988 кодируют белки, доля Г+Ц пар составляет 65 моль %. Отмечено изменение плоидности представителей рода Azotobacter на протяжении жизненного цикла: по мере старения культур количество хромосом в клетках и содержание ДНК увеличивается — в стационарной фазе роста культуры могут содержать более 100 копий хромосомы на клетку. При пересеве на свежую питательную среду первоначальное содержание ДНК восстанавливается. Кроме хромосомальной ДНК, у представителей рода Azotobacter обнаружены плазмиды, доказана и возможность трансформации представителей рода Azotobacter экзогенной плазмидной ДНК.
2. Распространение Azotobacter
     Азотобактер развивается при наличии простых органических соединений, достаточной увлажнённости почвы, с нейтральной реакцией, а также наличии в них фосфор, кальция и ряда микроэлементов (в частности молибдена, магния и железа). Высокая требовательность к внешним факторам делает распространение азотобактера весьма ограниченным. 
     В целинных подзолах и дерново-подзолистых почвах азотобактер практически отсутствует. Это бедные гумусом (0,3-0,5%), имеющие кислую реакцию почвы, непригодные для существования данного микроорганизма. При окультировании условия для развития азотобактера улучшаются; органические и минеральные фосфорные удобрения стимулируют размножение азотобактера, а азотные минеральные в высоких дозах - подавляют его рост.
     В кислых подзолистых почвах бактерия практически не встречается, а выделенные немногочисленные колонии оказываются ослабленными.
В серых лесных почвах в летний период, когда почва в достаточной степени увлажнена и устанавливается благоприятный температурный режим, количество азотобактера имеет наибольшее значение.
     Считается, что светло-серые лесные почвы близки по свойствам к дерново-подзолистым, поэтому предполагается что и степень распространения в них азотобактер также равна, темно-серые же почвы по органическому составу близки к оподзоленным и выщелоченным чернозёмам.
     В почвах с повышенной степенью увлажнения и преобладанием луговой растительности азотобактер обычно встречается в течение всего вегетационного периода. К подобным почвам относятся почвы пойм, имеющие в подзолистой зоне благоприятную реакцию среды и относительно высокое содержание питательных веществ.
     Болотно-низинные почвы нередко содержат азотобактер, но, вследствие неблагоприятного воздушно-водного режима, а также недостатка фосфора, кальция и микроэлементов этот микроорганизм здесь размножается слабо.
     В низинных целинных торфяниках азотобактер обнаруживается редко, а в верховных не встречается совсем, в связи с их сильнымзакислением. Окультуривание торфяных почв улучшает условия для размножения, но некоторые торфа токсичны для азотобактера.
     Чернозёмы отличаются высокой активностью микробиологических процессов. Наиболее интенсивно они протекают весной и рано летом, когда почва имеет благоприятный температурный режим и достаточный запас влаги. Это нейтральные или слабощелочные почвы с высоким содержанием солей кальция и магния. Черноземные почвы более северных районов содержат азотобактер в течение всего вегетационного периода. В зоне обычных и южных черноземов данный микроорганизм встречается реже, так как в летний период эти почвы не так богаты органическими остатками. 
     Сильно окультуренные подзолистые почвы, образованные на суглинках, имеют благоприятный водно-воздушный режим, слабокислую реакцию (рН=5.5) чем обеспечивается активная деятельность полезной почвенной микрофлоры, в том числе и азотобактера.
     В хорошо окультуренных огородных почвах азотобактер обычно находиться в значительных количествах.
     Таким образом, азотобактер может служить индикатором степени окультуренности почвы.
3. Значение Azotobacter в растениеводстве
     Известно, что  интенсивное растениеводство обедняет почву азотом, так как значительная его доля ежегодно выносится из почвы вместе с урожаем. Еще с древних времен для того, чтобы восстановить и улучшить почву, существует метод использования бобовых растений, способных в симбиозе с азотфиксирующими микроорганизмами восполнять почвенные запасы азота в результате диазотрофности. Большой положительный эффект от возделывания бобовых вызвал постановку исследований явления диазотрофности. Культивирование бобовых положительно влияет на азотный баланс почв, также облегчает борьбу с эрозией и помогает восстанавливать истощенные земли.
     Наиболее простой способ инокуляции основан на использовании почвы после выращивания на ней бобовых растений. Этот метод разработан в конце XIX века и применяется до настоящего времени. Недостаток метода – необходимость перемещения достаточно больших объемов почвы (100–1000 кг/га), а также возможность распространения болезней.
     Более эффективным оказалось применение для инокуляции семян специальных препаратов азотфиксирующих бактерий. Клубеньковые бактерии рода Rhizobium, развиваясь в корневой системе бобовых растений, в симбиозе с ними фиксируют атмосферный азот, обеспечивая этим азотное питание растений. Процесс азотфиксации протекает только в клубеньках на корнях бобовых растений, которые образуются в результате проникновения бактерий через корневые волоски в корень. Взаимоотношение бактерий с растениями зависит от комплекса условий, включая физиологическое состояние и условия роста растений, а также физиологическую активность и вирулентность бактерий. Под вирулентностью понимают способность бактерий проникать внутрь корня растений и вызывать образование клубенька.
     Первая коммерческая разновидность культуры для инокуляции семян (товарное название «Nitragin») была запатентована в Великобритании Ноббе и Хилтнером в 1896 году. Для разных бобовых в то время выпускали 17 вариантов культуры. В 20-е годы выпускалось много разновидностей инокулятов, среди них были чистые культуры азотфиксирующих микроорганизмов, смеси бактерий с песком или торфом, а также культуры, выращенные на агаре или в жидкой среде.
     В качестве носителя для бактерий были опробованы различные композиции: смеси торфа с почвой, добавки люцерны и соломы, перегнившие опилки, бентоит и активированный уголь. В настоящее время для поддержания жизнеспособности симбиотических азотфиксирующих бактерий используют разнообразные носители, но лучшим считается торф.
     Сухие препараты азотфиксаторов, приготовленные на основе клубеньковых бактерий рода Rhizobium и предназначенные для повышения урожайности бобовых растений (гороха, фасоли, сои, клевера, люцерны, люпина и др.) в настоящее время выпускаются под товарным названием «Нитрагин». Помимо почвенного нитрагина, выпускают также сухой нитрагин – препарат бактерий с содержанием в 1г не менее 9 млрд. жизнеспособных клеток, в качестве наполнителя используют мел, каолин, бентоит. Препараты сухого нитрагина с остаточной влажностью 5–7 % фасуют по 0.2–1.0 кг и хранят при 15 °С в течение 6 месяцев.
     Аналог азотных удобрений – другой препарат азотфиксирующих бактерий – «Азотобактерин», который выпускается промышленностью в нескольких вариантах. Бактерии рода Azotobacter являются свободноживущими азотфиксирующими микроорганизмами и обладают высокой продуктивностью азотфиксации (до 20 мг/г использованного сахара). Помимо связывания атмосферного азота, эти бактерии продуцируют биологически активные соединения (витамины, гиббериллин, гетероауксин и др.). В результате этого инокуляция азотобактерином стимулирует прорастание семян и ускоряет рост и развитие растений. Более того, Azotabacterспособенэкскретироватьфунгицидные вещества. Этим угнетается развитие в ризосфере растений микроскопических грибов, многие из которых тормозят развитие растений. Однако бактерии рода Azotobacter весьма требовательны к условиям среды, особенно концентрации в почве фосфатов и микроэлементов, и активно развиваются в плодородных почвах.
     В последние годы для изучения биологической азотфиксации стали применять методы молекулярной биологии и новейшие методы генетики.
     Установлена возможность с помощью колифага P1 размножать свободноживущую азотфиксирующую бактерию Klebsiellapneumoniae М5 и с ее помощью трансдуцироватьnif-гены (гены азотфиксации). Также доказано, что перенос nif-генов возможен с помощью плазмид от штамма-азотфиксатора к штамму, не обладающему диазотрофностью. Обнаружены конъюгативныеплазмиды, несущие гены азотфиксации, относительно легко передающиеся при конъюгации от штамма к штамму. П осле этого появились надежды на получение методами клеточной и генной инженерии растений, способных фиксировать атмосферный азот. Однако перенос генов азотфиксации и их экспрессия является чрезвычайно сложной задачей.
4. Механизм фиксации атмосферного азота
     Представители рода Azotobacter являются свободноживущими азотфиксаторами, то есть в отличие от представителей рода Rhizobium фиксируют молекулярный азот из атмосферы, не вступая в симбиотические отношения с растениями, хотя некоторые представители рода вступают в ассоциацию с растением-хозяином. Фиксация азота ингибируется наличием доступных источников азота, например ионов аммония, нитратов.
     Представители рода Azotobacter имеют полный комплекс ферментов, необходимый для осуществления азотфиксации: ферредоксины, гидрогеназы и важнейший фермент — нитрогеназу. Процесс азотфиксации энергозависим и требует притока энергии в виде АТФ. Процесс фиксации азота крайне чувствителен к присутствию кислорода, поэтому у представителей рода Azotobacter выработался особый механизм защиты от действия кислорода — так называемая дыхательная защита, осуществляемая путём значительной интенсификации дыхания, снижающего концентрацию кислорода в клетках. Также имеется особый белок Shethna, защищающий нитрогеназу и участвующий в предотвращении гибели клетки, вызванной кислородом: мутанты, не вырабатывающие этот белок, гибнут в присутствии кислорода во время азотфиксации в отсутствие источника азота в среде Определённую роль в процессах азотфиксации у Azotobacter играютгомоцитрат-ионы.

Нитрогеназы
     Нитрогеназный комплекс является важнейшим ферментом, участвующим в азотфиксации. У представителей рода Azotobacter обнаружено несколько типов нитрогеназ — Mo-Fe-нитрогеназа и альтернативные нитрогеназы: Ванадий-содержащая, не зависимая от ионов молибдена, более активная чем Mo-Fe-нитрогеназа в условиях пониженных температур — так, эффективная фиксация азота не прекращалась V-нитрогеназой вплоть до понижения температуры до 5 °C, активность V-нитрогеназы понижалась при понижении температуры в 10 раз меньше, чем у Mo-Fe-нитрогеназы, и Fe-содержащая, менее активная, чем обычная нитрогеназа. Важную роль в образовании активной нитрогеназы играет созревание Р-кластера Mo-Fe-нитрогеназы, также как и предшественник Mo-Fe-кофакторанитрогеназы, шаперонGroEL, играет важную роль в завершающей перестройке нитрогеназы. Регуляция активности нитрогеназыможет осуществляться образованием осадка аргинина Синтез нитрогеназы осуществляется под контролем т. н. nif-генов. Фиксация азота регулируется nifLA опероном, продукт NifA регулирует транскрипцию nif-генов, NifL имеет антагонистичное действие по отношению к действию NifA в ответ на поглощённый азот и в зависимости от уровня поступления кислорода в клетку, экспрессия nifLA оперона регулируется по механизму позитивной регуляции. NifL является флавопротеином, модулирующим активацию транскрипции генов азотфиксации путём редокс-зависимого переключения. Двухкомпонентная система регуляции, состоящая из двух белков, образующих комплексы между собой, является атипичной и не распространённой среди других организмов системой регуляции экспрессии генов.
5. Биохимия Azotobacter
     Характерной особенностью азотобактера является его способностью наряду со связанными формами азота усваиват молекулярный азот. Размер азотонакопления зависит прежде всего от свойств того или иного штамма азотобактера. По этому признаку различаются активные и пассивные культуры. В некоторых случаях под влиянием неблагоприятных условий среды азотобактер может терять способность усваивать молекулярный азот (Мишустин, Емцов, 1987).
     Большинство культур азотобактера усваивает не более 10 мг молекулярного азота на 1 г потребленного источника углерода. Отдельные штаммы Az. chroococcum фиксировали до 15 мг азота на 1 г использованной глюкозы (Мишустин, Емцов, 1987).
     Молекула атмосферного азота очень инертна, для разрыва 3-х ее химических связей необходимо затратить 225 ккал/моль.
     При промышленном получении аммиака из N2 затрачивается большое количество энергии, даже в присутствии катализаторов требуется повышение температуры до +500?С и давление до 300-350 атм., в то время как все процессы азотофиксации в клетке, идут при физиологических значениях температуры, низких давлениях и без загрязнения среды обитания. Биохимический механизм фиксации молекулярного азота воздуха сходен у всех диазотрофов. В основе его лежит процесс восстановления N2 по уравнению:

N2+6e-+6H?2NH3

Реакция эта в клетке проходит при участии фермента нитрогеназы, расположенного на внутренних клеточных мембранах. Кроме того, для фиксации N2 необходимы сильные восстановители (поток электронов), АТФ и Mg2+ (Глик, Пастернак, 2002).
     Нитрогеназа - сложный ферментативный ансамбль, состоящий из комплекса двух белков: Mo-Fe-белка (молибдоферредоксин) и Fe-белка (азотоферредоксина).Mo-Fe-белок - это тетрамер, содержащий 2 атома молибдена, негемовое железо и лабильный сульфид.Fe-белок является димером, тоже содержит негемовое железо и лабильный сульфид (Анисимова, 1986).
     В процессе фиксации АТФ взаимодействует с азоферредоксином. При этом выделяется АДФ, а азоферредоксин претерпевает конформационную перестройку, вследствие чего его окислительно-восстановительный потенциал понижается с - 280 до - 400 мВ. Азоферредоксин становится сильным восстановителем, предает электроны на молибдоферредоксин, где и осуществляется восстановление N2 до NH3. Суммарно процесс фиксации азота можно выразить реакцией

N2+6e-+12АТФ+12Н2О?2NH4+12 АДФ+12Н3РО4+4Н+

     Нитрогеназа обладает широкой субстратной специфичностью, кроме азота она может восстанавливать цианиды, закись азота, ацетилен и др.
Нитрогеназа при участии АТФ катализирует также восстановление ионов водорода с образованием молекулярного водорода (Lin, Stewart, 1998).
Нитрогеназа - анаэробный фермент, инактивирующийся в присутствии кислорода воздуха. Он повреждает оба белка, хотя наиболее чувствителен к нему Fe-белок. Чувствительность белков нитрогеназы к О2 определяется главным образом чувствительностью их металлоцентров, участвующих в связывании субстрата и переносе электронов. При взаимодействии нитрогеназы с О2 может происходить 4-х ступенчатое восстановление О2 с образованием супероксида, Н2О2 и синглетного кислорода. Ферредоскины и флаводоксины, переносящие электроны на нитрогеназу также могут поддвергаться необратимым окислительным повреждениям (Готтшалк, 1982).
     Азотобактер относиться к облигатным аэробам. При избыточном количестве кислорода начинает резко интенсифицировать процессы дыхания, как бы стараясь выбрать весь кислород и обеспечить выполнение ею функций азотофиксации. Процесс этот малопродуктивен и кончается снижением азотофиксирующей активности. Ещё одним способом защиты от кислорода воздуха является конформационное изменение нитрогеназы с особыми FeS-белками, в результате чего повышается ее стабильность в присутствии кислорода (Громов, Павленко, 1989).

Регуляция нитрогеназной системы
Общее свойство всех препаратов нитрогеназы - их чувствительность к присутствию кислорода. Фермент необратимо ингибируется кислородом поэтому фиксацию азота можно называть строго анаэробным процессом. Для защиты нитрогеназы от повреждения кислородом у таких аэробов, как представители рода Azotobacter, существует два механизма.
     . Дыхательная защита. Бактерии, относящиеся к роду Azotobacter, обладают очень активной разветвленной дыхательной системой. В одной из ветвей цепи переноса электронов имеются три пункта сопряженного фосфорилирования; в двух других - только один такой пункт. Поэтому при увеличении концентрации кислорода скорость дыхания микроорганизмов может повышаться за счет частичного разобщения фосфорилирования. Это приводит к потере NADH2, но зато нитрогеназа защищается при этом повреждения кислородом.
. Конформационная защита. Осуществляется за счет конформационных изменений в молекуле фермента и ассоциации с защитными белками (Готтшалк, 1982).
     Много исследований посвящено вопросу о влиянии на азотофиксацию связанных форм азота, так, например, малые дозы селитры не только не снижают, но даже нередко стимулируют фиксацию, но по мере повышения конценрации селитры фиксации азота понижается. При содержании 24 мг нитратного азота на 100 мл среды связывание азота уже не происходит, аналогично нитратам влияют на азотофиксацию и аммонийные соли, а при длительном культивировании азотобактера в присутствии азотистых соединений, он теряет свою способность усваивать азот атмосферы (Блинков, 1959). Дело в том, что ионы аммония подавляют синтез нитрогеназы. В регуляции образования нитрогеназы большую роль играет глутаминсинтетаза. Глутаминсинтетаза и глутаматсинтетаза нужны бактериям для включения ионов аммония в органические соединения в том случае, если ионы присутствуют лишь в низкой концентрации. Эта система обладает высоким сроством к ионам аммония, и поддерживает их концентрацию в клетке на низком уровне. Повышение концентрации ионов аммония в окружении клетки (а тем самым и внутри клетки) подавляет образование глутаминсинтетазы, а в результате - и нитрогеназы.

Основные физиологические свойства азотобактера
К основным физиологическим свойствам бактерий рода Azotobacter относится его резко выраженная способность усваивать азот атмосферы. Большинство штаммов усваивают не более 10 мг азота на 1 г. Потребляемого источника углерода, некоторые штаммы азотобактера способны фиксировать до 15 мг азота на 1 г глюкозы (Самсонов, 1987).
     Азотобактер является полифагом, в качестве источника углерода может использовать моно-, ди - и полисахариды, органические кислоты жирного и ароматического ряда, летучие органические соединения (пары этилового спирта, ацетона), но предпочтительным энергетическим материалом являются одно- и многоатомные спирты: этиловый, бутиловый. Отдельные штаммы и даже виды азотобактера по-разному относится к источнику углерода, - так можно встретить штаммы, не ассимилирующие лактозу, маннит, бензойную кислоту и др. если в среде несколько источников углерода, то они используются в порядке доступности (Мишустин, Шильникова, 1968).
Культура азотобактера образует значительное количество биологически активных веществ, среди них витамины группы В, гормоны растений (гиббереллины, цитокинины, ауксины (в частности, индолил-3-уксусная кислота (ИУК)) (Воробьева, 1982; Мишке, 1988).
     Было установлено, что Az. chroococcum на 10-е сутки ферментации выделяет в культуральную жидкость в количестве 5 мкг/мл, а на 17-е сутки-20 мкг/л гиббереллин подобных веществ. Сам гиббереллин к концентрации 0,1-100 мкг/мл не оказывает влияния на размножение азотобактера, но имеются сведения о повышении азотофиксирующей способности при добавлении гиббереллина (Мишке, 1988).
     Важнейшим природным ауксином является индолил-3-уксусная кислота. Данный фитогормон был обнаружен в бактериях, грибах, низших и высших растениях (Гамбург, 1990). Для образования ауксина грибы и бактерии нуждаются в питательной среде, содержащей глюкозу, а также необходимо присутствие триптофана, тирозина и других аминокислот. Несмотря на то, что культуры сами выделяют биологически активные вещества, внесение их в среду ускоряет процесс роста азотобактера. Под влиянием регуляторов роста увеличивается также и продуктивность азотофиксации (Мишке, 1988).
Весьма важное свойство азотобактера заключается в том, что он вырабатывает фунгистатическое вещество, представляющее собой метиловый эфир алифатической тетраеновой кислоты, содержащей гидроксильную и В-метильную группы. Обнаруженный антибиотик-азохроомицин, по данным Н.И. Придачиной, активен против значительного числа фитопатогенных грибов. Благодаря описываемому свойству при бактеризации азотобактером в ризосфере угнетается развитие микроскопических грибов, многие из которых задерживают рост растений. Так, культура Az. chroococcum снимает угнетающее действие фитотоксичного гриба Alternaria на кукурузу, а рост не заряженного растения стимулирует.

Взаимодействие азотобактера с высшими растениями и почвенными микроорганизмами

     Жизнедеятельность азотобактера осуществляется в зоне окружающей корень растения - ризосфере. Ризосферу (с окружающей ее почвой) растений можно рассматривать как своеобразный проточный культиватор микроорганизмов, где наблюдается высокая активность естественно смешанных культур микроорганизмов. В ризосфере сталкиваются метаболические процессы клеток микроорганизмов и клеток корневых систем растений. На поверхность корневой системы и наземных частей растений во время их жизни, выделяются различные органические соединения, синтезированные растительным организмом. Это явление называется экзоосмосом. (Мишустин, 1972).
     Количественные соотношения ризосферных микроорганизмов формируются на пищевой базе корневых выделений. Ризосферный эффект (отношение числа микроорганизмов в зоне корня к числу микроорганизмов в почве) служит подтверждением обилия питательных веществ в корневых выделениях. Чем более развитых фотосинтезирующим аппаратом обладают растения, тем больше транспортируют энергетических веществ в прикорневую зону. Тем выше уровень несимбиотическойазотфиксации в ризосфере и больше азотсодержащих соединений поступает в прикорневую область (Шильникова, Серова, 1983).
     В свою очередь азотобактер оказывает стимулирующее действие на прорастание семян растений и ускорение их роста (что особенно важно в ранние фазы их развития) за счет продукции биологически активных веществ (ауксинов, витаминов, гибереллинов). Синтез азотобактеров ростовых веществ может иметь существенное значение для растений, произрастающих в условиях недостаточной влажности (Шильникова, Серова, 1983).
Как указывает Федоров М.В., благодаря воздействию на растение ростовых веществ, происходит быстрое удлинение зародышевого корня, позволяющего ему уходить из пересыхающего горизонта вглубь почвы, где лучшие условия снабжения влагой (Федоров, 1963).
     Кроме того обнаружена антогонистическая активность по отношению к возбудителям болезней растений. Азотобактер обладает фунгистатическим действием, за счет продукции антибиотических веществ, задерживающих развитие плесневых грибов (Клешко, 1981).
     Кроме растений на жизнедеятельность азотобактер могут оказывать влияние и почвенные микроорганизмы. Обнаружено наличие так называемых бактерий - спутников, которые содержатся в слизи, выделяемой азотобактером. Одним из представителей является Pseudomonasradiobaster. Развиваясь безазотистой среде, он обладает способностью фиксировать молекулярный азот. За счет деятельности протеолитических и амилолитических ферментов Ps. radiobacter активирует биохимическую активность азотобактера (Мишустин, Шильникова, 1968).
     Стимулирующий эффект оказывают некоторые бактерии из родов Pseudomonas и Mycobacterium.
     Сильными антагонистами азотобактера являются Bacillussubtilis, Bacilluscereus, грибы родов Penicillium и Aspergillus, которые задерживают или полностью подавляют его развитие на питательных средах в первые сутки культивирования (Мишустин, Шильникова, 1968).
     Среди почвенных микроорганизмов плесневые грибы составляют основную массу активных антаганистов - 40-80%. Их численность и активность возрастают в летний период в связи с понижением влажности почвы. В весенний период большую долю антаганистов составляют бактерии (до 40%) (Колешко, 1981).
6. Глубинное культивирование
     
     Большое  количество  микроорганизмов,  включая  бактерии,  микроводоросли,  дрожжи  и  грибы,  могут  производить  внеклеточные  полисахариды.  Эти  микробные  экзополисахариды  представляют  потенциальный  интерес  с  экономической  точки  зрения,  в  зависимости  от  их  структурных  свойств  [7,  9].  Большой  интерес  на  сегодняшний  день  представляют  бактерии  Azotobactervinelandii.  Из  литературных  данных  известно,  что  данная  культура  способна  продуцировать  в  среду  полисахариды,  в  том  числе  и  альгинаты,  которые  образуют  гели  различной  плотности  [3,  8] 
     Проводились исследования влияния  частоты  перемешивания  на  накопление  альгината  и  поли-3-гидроксибутират  (ПГБ)  бактерией  Azotobactervinelandii.
     Культуру  бактерий  выращивали  на  среде,  г/л:  сахароза  —  20;  дрожжевой  экстракт  —  3;  К2НРО4  —  0,66;  КН2РO4  —  0,16;  CaSO4  —  0,05;  NaCl  —  0,2;  Mg  SO4·7H2O  —  0,2;.......................